İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Özet

Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için bir protokol tarif ediyoruz. Bu protokol iki hafta içinde böbrek organoidleri üretir. Elde edilen böbrek organoidleri, paralel ilaç testi yaklaşımları için büyük ölçekli iplikçi şişelerinde veya çok kuyulu manyetik karıştırma plakalarında kültürlenebilir.

Özet

hPSC'lerden üretilen böbrek organoidleri, sınırsız bir böbrek dokusu kaynağı sağlamıştır. İnsan böbrek organoidleri, böbrek hastalığı ve hasarını incelemek, hücre bazlı tedaviler geliştirmek ve yeni terapötikleri test etmek için paha biçilmez bir araçtır. Bu tür uygulamalar için, çok sayıda üniform organoid ve yüksek oranda tekrarlanabilir tahlillere ihtiyaç vardır. Organoidlerin genel sağlığını iyileştirmek için daha önce yayınlanmış böbrek organoid protokolümüzün üzerine inşa ettik. Bu basit, sağlam 3D protokolü, 3 gün boyunca lipitler, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin takviyesi ve GSK3 inhibitörü (CHIR99021) ile polivinil alkol içeren minimum bileşen ortamında üniform embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından nakavt serum replasmanı (KOSR) içeren ortamda kültürü içerir. Ek olarak, ajitasyon tahlilleri, embriyoid cisimlerin kümelenmesinde azalmaya ve organoidler arasındaki değişkenliği azaltmak için önemli olan düzgün bir boyutun korunmasına izin verir. Genel olarak, protokol büyük miktarlarda böbrek organoidi üretmek için hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Giriş

Son yıllarda, insan pluripotent kök hücrelerini böbrek organoidlerine ayırmak için bir dizi protokol geliştirilmiştir ^1,2,3,4,5. Böbrek organoidleri, yeni rejeneratif tıp yaklaşımlarına yönelik araştırmalara yardımcı olmak, böbrekle ilgili hastalıkları modellemek, toksisite çalışmaları yapmak ve terapötik ilaç geliştirmek için önemli bir araç sağlamıştır. Geniş uygulanabilirliklerine rağmen, böbrek organoidlerinin olgunlaşma eksikliği, in vitro sınırlı uzun süreli kültür kapasitesi ve insan böbreği....

Protokol

hPSC'leri kullanan tüm deneyler kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir Sınıf II biyogüvenlik başlığında gerçekleştirildi. Tüm reaktifler, aksi belirtilmedikçe hücre kültürü sınıfındadır. Tüm kültürler 37 °C, %5 CO₂ hava atmosferinde inkübe edilir. Tahlilin tüm aşamalarında, embriyoid cisimler veya böbrek organoidleri toplanabilir ve analiz için sabitlenebilir veya hazırlanabilir. Bu verileri oluşturmak için kullanılan hPSC hatları tamamen karakterize edilmiş ve yayınlanmıştır¹⁸.

1. Kültür plakalarının hazırlanması

NOT: hPSC'....

Sonuçlar

Protokolümüzün bu en son versiyonunda, böbrek organoid farklılaşması tanımlanmış, düşük proteinli bir ortamda başlatılır. Tahliller tamamen süspansiyon halinde gerçekleştirilir ve hPSC'lerin tübülogenezin başlatılması için farklılaşma ve organizasyonun doğuştan gelen yeteneğine dayanır. 100 mm ~% 60 oranında bir akıcılık hPSC kültür plakasından kaynaklanan tek bir tahlil, önceki yayınımızda gösterildiği gibi rutin olarak 500-1.000 böbrek organoidi verir⁵

Tartışmalar

Önceki çalışmalar, ilk protokol adımlarının ara mezoderm farklılaşması ^5,19,20 için kritik olduğunu ve bu nedenle bu aşamada sıkı bir orta bileşimin uygulanmasının gerekli olduğunu göstermiştir. Serum, albümin, proteinsiz hibridoma medium II gibi tanımlanmamış bileşenlerin protokolün ilk aşamasından çıkarılması, tahliller²¹ arasındaki tutarlı farklılaşma verimliliğini.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher	21-985-023
Anti-adherence rinsing solution	STEMCELL Technologies	7010
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	10 mM stock in DMSO
Corning disposable spinner flasks	Fisher Scientific	07-201-152
Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates	Fisher Scientific	07-200-601
Corning Slow-Speed Stirrers	Fisher Scientific	11-495-03	Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture
Dispase	STEMCELL Technologies	7923	Aliquot and freeze
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermo Fisher	11054020
DPBS 1x, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher	14-190-250
Egg / Oval Stirring Bars	2mag	PI20106
Excelta General-Purpose Tweezers	Fisher Scientific	17-456-103	Keep sterile in the cell culture hood
EZBio Single Use Media Bottle, 250mL	Foxx Life Sciences	138-3211-FLS	Used to make PVA 10%
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)	Thermo Fisher	08-772E
Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL	Fisher Scientific	14-955-135
Fisherbrand  Cell Lifters - Cell lifter	Fisher Scientific	08-100-240
Fisherbrand Multi Function 3D Rotators	Fisher Scientific	88-861-047	Orbital shaker
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Thermo Fisher	A1413302	BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	7174	GCDR
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher	35-050-061	L-glutamine supplement.
HEPES (1M)	Thermo Fisher	15-630-080
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine	Thermo Fisher	51-500-056	ITSE
KnockOut  Serum Replacement - Multi-Species	Thermo Fisher	A3181502	KOSR. Aliquot and freeze
Lipid Mixture 1, Chemically Defined	Millipore-Sigma	L0288-100ML
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher	11140-050
MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL	Fisher Scientific	S2GPU05RE
MilliporeSigma  Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL	Fisher Scientific	S2GPU02RE
MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit	2mag	VMF 90250 U
MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive	2mag	VMF 40600	6MSP
MP Biomedicals  7X Cleaning Solution	Fisher Scientific	MP0976670A4	Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.
Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-270
Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-268
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher	15-140-122	Aliquot and freeze
Plasmocin	Invivogen	ant-mpt	Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze
pluriStrainer® 200 µm	Fisher Scientific	NC0776417	Cell strainer
pluriStrainer® 500 µm	Fisher Scientific	NC0822591	Cell strainer
Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed  (PVA)	Millipore-Sigma	P8136-250G	10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS
ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)	STEMCELL Technologies	72304	10 mM stock in DPBS
Sterile Disposable Serological Pipets  - 10mL	Fisher Scientific	13-678-11E
Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL	Fisher Scientific	13-678-11
Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL	Fisher Scientific	13-678-12D
TeSR-E5	STEMCELL Technologies	5916	Serum-free, low protein base medium for E5-ILP
Variomag distriBOX 2 Distributor	2mag	VMF 90512	If you use more than one MIXdrive