JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

R-döngüleri, hem DNA dizisine hem de topolojik uygunluğa bağlı olarak tüm genomlarda meydana gelen, transkripsiyona dayalı B olmayan DNA yapılarının yaygın bir sınıfını oluşturur. Son yıllarda, R-döngüleri çeşitli adaptif ve uyumsuz rollerde yer almıştır ve insan bozuklukları bağlamında genomik kararsızlık ile ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, genomlardaki bu yapıların doğru bir şekilde haritalanması birçok araştırmacı için büyük ilgi çekmektedir. DRIP-seq (DNA:RNA İmmünopresipitasyonu ve ardından yüksek verimli dizileme) burada açıklanmaktadır. R-döngülerinin doğru ve yarı kantitatif haritalanmasına izin veren sağlam ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Yöntemin yeni bir yinelemesi, R-döngülerinin ipliğe özgü ve yüksek çözünürlüklü haritalanmasına izin veren sonikasyon (sDRIP-seq) kullanılarak parçalanmanın gerçekleştirildiği de açıklanmaktadır. Bu nedenle sDRIP-seq, çözünürlük ve örgülülük açısından DRIP-seq yönteminin bazı yaygın sınırlamalarını ele alır ve bu da onu R-döngü haritalaması için tercih edilen bir yöntem haline getirir.

Özet

R-döngüleri, hem DNA dizisine hem de topolojik uygunluğa bağlı olarak tüm genomlarda meydana gelen, transkripsiyona dayalı B olmayan DNA yapılarının yaygın bir sınıfını oluşturur. Son yıllarda, R-döngüleri çeşitli adaptif ve uyumsuz rollerde yer almıştır ve insan bozuklukları bağlamında genomik kararsızlık ile ilişkilendirilmiştir. Sonuç olarak, genomlardaki bu yapıların doğru bir şekilde haritalanması birçok araştırmacı için büyük ilgi çekmektedir. DRIP-seq (DNA:RNA İmmünopresipitasyonu ve ardından yüksek verimli dizileme) burada açıklanmaktadır. R-döngülerinin doğru ve yarı kantitatif haritalanmasına izin veren sağlam ve tekrarlanabilir bir tekniktir. Yöntemin yeni bir yinelemesi, R-döngülerinin ipliğe özgü ve yüksek çözünürlüklü haritalanmasına izin veren sonikasyon (sDRIP-seq) kullanılarak parçalanmanın gerçekleştirildiği de açıklanmaktadır. Bu nedenle sDRIP-seq, çözünürlük ve örgülülük açısından DRIP-seq yönteminin bazı yaygın sınırlamalarını ele alır ve bu da onu R-döngü haritalaması için tercih edilen bir yöntem haline getirir.

Giriş

R-döngüleri, esas olarak, yeni oluşan RNA transkriptinin şablon DNA zincirine hibridizasyonunun ardından transkripsiyon sırasında oluşan üç sarmallı nükleik asit yapılarıdır. Bu, bir RNA:DNA melezinin oluşumuyla sonuçlanır ve şablon olmayan DNA zincirinin tek sarmallı ilmekli bir durumda yer değiştirmesine neden olur. Biyokimyasal sulandırma 1,2,3,4 ve matematiksel modelleme5, diğer biyofiziksel ölçümlerle 6,7 birlikte, R-döngülerinin belirli olumlu özellikler sergileyen bölgeler üzerinde meydana gelme olasılığının daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Örneğin, guaninlerin (G) ve sitozinlerin (C) dağılımında, RNA'nın G-açısından zengin olduğu şekilde iplik asimetrisi gösteren bölgeler, pozitif GC çarpıklığı adı verilen bir özellik, DNA dupleksi8'e kıyasla DNA:RNA hibritinin daha yüksek termodinamik stabilitesi nedeniyle kopyalandığında R-döngüleri oluşturmak için tercih edilir. Birçok ökaryotik gen 4,9,10,11'in erken kısımları gibi pozitif GC çarpıklığı gelişen bölgeler, in vitro ve in vivo 3,4,12 R-döngüleri oluşturmaya eğilimlidir. Negatif DNA süper sarmal stresi de yapı oluşumunu13,14 büyük ölçüde destekler, çünkü R-döngüleri bu tür topolojik stresleri verimli bir şekilde emer ve çevredeki DNA lifini uygun bir gevşemiş duruma 5,15 geri döndürür.

Tarihsel olarak, R-döngü yapılarının, transkripsiyon sırasında RNA'nın DNA ile nadir, kendiliğinden dolaşmasından kaynaklandığı düşünülüyordu. Bununla birlikte, yüksek verimli DNA dizilimi (DRIP-seq) ile birlikte DNA:RNA immünopresipitasyonunun (DRIP) geliştirilmesi, R-döngülerinin ilk genom çapında haritalanmasına izin verdi ve bu yapıların insan hücrelerinde beklenenden çok daha yaygın olduğunu ortaya çıkardı 4,16. R-döngüleri, memeli genomlarında on binlerce korunmuş, kopyalanmış, genetik sıcak nokta üzerinde meydana gelir ve genlerin ilk intronu ve çok sayıda genin terminal bölgeleri ile örtüşen GC çarpık CpG adaları için bir tercih vardır17. Genel olarak, R-döngüleri toplu olarak insan hücrelerinde genomun %3-5'ini kaplar ve mayalar, bitkiler, sinekler ve fareler dahil olmak üzere diğer organizmalardaki ölçümlerle tutarlı olarak 18,19,20,21,22.

İnsan hücrelerinde R-döngüsü oluşturan sıcak noktaların analizi, bu tür bölgelerin spesifik kromatin imzaları23 ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. R-döngüleri, genel olarak, daha düşük nükleozom doluluğu ve daha yüksek RNA polimeraz yoğunluğuna sahip bölgelerde bulunur. Promotörlerde, R-döngüleri, iki ko-transkripsiyonel olarak biriken histon modifikasyonu, H3K4me1 ve H3K36me317'nin artan alımı ile ilişkilidir. Gen terminallerinde, R-döngüleri, önceki gözlemlerle24 tutarlı olarak, verimli transkripsiyon sonlandırması17 geçiren yakından düzenlenmiş genlerle ilişkilidir. R-döngülerinin ayrıca bakteriyofaj, plazmid, mitokondriyal ve maya genomlarının replikasyon kökenlerinde DNA replikasyonunun başlatılmasına katıldığı gösterilmiştir 25,26,27,28,29,30,31. Ek olarak, R-döngüsüne eğilimli insan CpG ada destekleyicilerinin %76'sı, R-döngüleri ve replikasyon kökenleri arasındaki bağlantıları daha da güçlendirerek, erken, kurucu replikasyon kökenleri 32,33,34,35 olarak işlev görür. Toplu olarak, bu çalışmalar, R-döngülerinin, bağlama bağlı bir şekilde belirli biyolojik çıktıları tetikleyebilen yeni bir biyolojik sinyal türünü temsil ettiğini göstermektedir23.

Önceleri, R-döngülerinin, immünoglobulin sınıf anahtarı rekombinasyonu 3,36,37 işlemi sırasında sınıf değiştirme dizilerinde oluştuğu gösterilmiştir. Bu tür programlanmış R-döngülerinin, çift sarmallı DNA kırılmalarının38 eklenmesi yoluyla sınıf anahtarı rekombinasyonunu başlattığı düşünülmektedir. O zamandan beri, genellikle aşırı R-döngüsü oluşumundan kaynaklandığı anlaşılan zararlı R-döngüsü oluşumu, genomik kararsızlık ve hiper rekombinasyon, transkripsiyon-replikasyon çarpışmaları, replikasyon ve transkripsiyonel stres gibi süreçlerle ilişkilendirilmiştir (gözden geçirme için 39,40,41,42,43). Sonuç olarak, R-döngü yapılarının daha iyi haritalanması, bu yapıların sağlık ve hastalıktaki dağılımını ve işlevini daha iyi deşifre etmek için heyecan verici ve önemli bir zorluğu temsil eder.

DNA:RNA immünopresipitasyonu (DRIP), DNA:RNA hibritleri44 için S9.6 monoklonal antikorunun yüksek afinitine dayanır. DRIP-seq, R-döngü oluşumunun 4,45 genom çapında sağlam profillenmesine izin verir. Yararlı olsa da, bu teknik, nazik DNA parçalanması elde etmek için kısıtlama enzimlerinin kullanılması nedeniyle sınırlı çözünürlükten muzdariptir. Ek olarak, DRIP-seq, R-döngü oluşumunun yönlülüğü hakkında bilgi sağlamaz. Burada, R-döngülerinin diziye özgü bir şekilde yüksek çözünürlükte eşlenmesine izin veren bir DRIP-seq varyantını rapor ediyoruz. Bu yöntem, immünopresipitasyondan önce genomu parçalamak için sonikasyona dayanır ve bu nedenle yöntem sDRIP-seq (sonikasyon DNA: RNA immünopresipitasyonu, yüksek verimli dizileme ile birleştiğinde) olarak adlandırılır (Şekil 1). Sonikasyon kullanımı, artan bir çözünürlüğe izin verir ve DRIP-seq yaklaşımlarında gözlenen kısıtlama enzimine bağlı parçalanma önyargılarını sınırlar46. sDRIP-seq, hem DRIP-seq hem de immünopupsipite R-döngü yapılarının45 RNA ipliklerinden dizileme kitaplıklarının oluşturulduğu daha önce açıklanan yüksek çözünürlüklü DRIPc-seq yönteminden elde edilen sonuçlarla güçlü bir uyum içinde olan R-döngü haritaları üretir.

Aralarından seçim yapabileceğiniz çok sayıda yöntemle karşı karşıya kalan kullanıcılar, ihtiyaçları için hangi DRIP tabanlı yaklaşımın tercih edildiğini merak edebilirler. Aşağıdaki tavsiyeleri sunuyoruz. DRIP-seq, sınırlamalarına rağmen, teknik olarak en kolayıdır ve burada tartışılan üç yöntemin de en sağlamıdır (en yüksek verim); bu nedenle geniş ölçüde kullanışlı olmaya devam eder. Yeni veri kümeleri için yararlı bir karşılaştırma noktası sağlayan çok sayıda DRIP-seq veri kümesi yayınlanmıştır. Son olarak, biyoinformatik analiz boru hattı, veriler mahsur kalmadığı için daha basittir. Yeni kullanıcıların DRIP ile R-döngü haritalama becerilerini geliştirmeye başlamaları ve ardından kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve DRIP-seq ile devam etmeleri önerilir. sDRIP-seq biraz daha yüksek bir teknik zorluk derecesini temsil eder: sonikasyon (aşağıda tartışılmıştır) nedeniyle verimler biraz azalır ve sıralama kütüphanesi süreci biraz daha karmaşıktır. Yine de, mahsur kalma ve daha yüksek çözünürlük kazancı paha biçilmezdir. sDRIP-seq'in hem iki sarmallı RNA:DNA hibritlerini hem de üç sarmallı R-döngülerini yakalayacağı belirtiliyor. Kütüphane yapım adımları nedeniyle, DRIP-seq iki sarmallı RNA:DNA hibritlerini yakalayamaz. DRIPc-seq, teknik olarak en zorlu olanıdır ve daha yüksek miktarda başlangıç malzemesi gerektirir. Karşılığında, en yüksek çözünürlüğü ve büküklüğü sunar. Dizileme kitaplıkları, R-döngülerinin veya hibritlerin RNA kısmından oluşturulduğundan, DRIPc-seq, özellikle S9.6, dsRNA 19,47,48 için artık afiniteye sahip olduğundan, olası RNA kontaminasyonundan muzdarip olabilir. sDRIP-seq, dizileme kitaplıkları DNA zincirlerinden türetildiğinden, RNA kontaminasyonu konusunda endişelenmeden ipliğe özgü, yüksek çözünürlüklü haritalamaya izin verir. Genel olarak, bu üç yöntem yararlı olmaya devam ediyor ve farklı karmaşıklık dereceleri ve biraz farklı uyarılar sunuyor. Bununla birlikte, üçü de oldukça uyumlu veri kümeleri48 üretir ve sinyal özgüllüğünü45,49 sağlamak için temel bir kontrolü temsil eden RNase H ön işlemine karşı oldukça hassastır. Dizileme kütüphanelerine uygulanan boyut seçimi göz önüne alındığında, gecikmeli iplikçik DNA replikasyon hazırlama bölgeleri (Okazaki primerleri) etrafında geçici olarak oluşanlar gibi küçük hibritlerin (tahmini <75 bp) hariç tutulacağı belirtilmektedir. Benzer şekilde, tüm DRIP yöntemleri DNA parçalanmasını içerdiğinden, stabiliteleri için negatif DNA süper sarılması gerektiren kararsız R-döngüleri kaybolacaktır5. Bu nedenle, DRIP yaklaşımları, özellikle in vivo yaklaşımlar45,48 kullanılarak en iyi şekilde yakalanabilen kısa, kararsız R-döngüleri için R-döngü yüklerini hafife alabilir. R-döngülerinin ayrıca derin kapsama alanında, yüksek çözünürlükte ve sodyum bisülfit işleminden sonra tek DNA molekülleri üzerinde ipliğe özgü bir şekilde S9.6'dan bağımsız bir şekilde profillenebileceğibelirtilmektedir 12. Ek olarak, katalitik olarak aktif olmayan bir RNaz H1 enzimi kullanan stratejiler, doğal R-döngülerini in vivo olarak haritalamak için kullanılmıştır ve esas olarak duraklatılmış promotörlerde50,51,52 oluşan kısa, kararsız R-döngülerini vurgulamaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Aşağıdaki protokol, kültürde yetiştirilen insan Ntera-2 hücre hattı için optimize edilmiştir, ancak bir dizi diğer insan hücre hattına (HEK293, K562, HeLa, U2OS), birincil hücrelere (fibroblastlar, B hücreleri) ve ayrıca küçük modifikasyonlara sahip diğer organizmalara (fareler, sinekler) modifikasyon yapılmadan başarılı bir şekilde uyarlanmıştır.

1. Hücre hasadı ve lizis

  1. Kültür Ntera-2 hücreleri% 75 -% 85 birleşmeye kadar. Herhangi bir DRIP prosedürünü başlatmak için optimal hücre sayısının %>90 canlı sayımla 5 ila 6 milyon hücre olduğundan emin olun.
  2. Hücreleri bir kez 1x PBS ile yıkayın, 1.5 mL Tripsin-EDTA 1x ekleyin ve ardından hücreler tabaktan ayrılana kadar 37 ° C'de 2 dakika inkübe edin.
  3. 5 mL ılık ortam ekleyin ve hücreleri tek bir hücre süspansiyonuna yeniden süspanse etmek için iyice pipetleyin. İçeriği 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g'da nazikçe pellet edin.
  4. Hücreleri 5 mL 1x PBS ile bir kez yıkayın ve hücreleri 300 x g'da 3 dakika boyunca nazikçe peletleyin.
  5. Hücreleri 1.6 mL TE tamponunda (10 mM Tris-Cl pH 7.5, 1 mM EDTA pH 8.0) tamamen yeniden süspanse edin. 5 μL proteinaz K (20 mg / mL stok çözeltisi) ve 50 μL SDS (% 20 stok çözeltisi) ekleyin ve çözelti viskoz hale gelene kadar tüpleri beş kez hafifçe ters çevirin. Çözeltiyi pipetlemeye çalışmayın, sadece ters çevirerek karıştırın.
  6. Tüpleri gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.

2. DNA ekstraksiyonu

  1. DNA lizatını önceden bükülmüş 15 mL yüksek yoğunluklu faz kilitli jel tüpüne dökün ve 1 hacim (1.6 mL) Fenol / Kloroform İzoamil alkol (25: 24: 1) ekleyin. Beş kez nazikçe ters çevirin ve 5 dakika boyunca 1.500 x g'da döndürün.
  2. Yeni bir 15 mL tüpe 1/10 hacim 3 M sodyum asetat (NaOAc) (pH 5.2) ve 2.5 hacim %100 Etanol ekleyin. Faz kilitli jel tüpünden üst sulu fazı dökün ve DNA tamamen çökelene kadar (10 dakikaya kadar) hafifçe ters çevirin.
  3. DNA ipliklerini geniş delikli 1.000 μL'lik bir uç kullanarak sarın ve artık süpernatanı taşımamaya dikkat ederek temiz 2 mL'lik bir tüpe aktarın.
  4. 1.5 mL% 80 etanol ekleyerek DNA'yı yıkayın ve tüpü beş kez nazikçe ters çevirin. 10 dakika inkübe edin.
  5. Önceki adımı iki kez yineleyin. Yıkama adımları sırasında santrifüj yapmayın. DNA'yı rahatsız etmemeye çalışırken son yıkamadan sonra pipetleyerek mümkün olduğunca fazla etanolü dikkatlice çıkarın.
  6. Tüpü ters çevirirken DNA'nın tamamen kurumasına izin verin. Bu adım, DNA miktarına bağlı olarak 30 dk -1 saat sürebilir.
  7. Kısıtlama enzimi sindirimi yoluyla DNA'yı parçalamak için doğrudan DNA peletine 125 μL TE tamponu veya sonikasyon yoluyla DNA'yı kesmek için 100 μL TE tamponu ekleyin. 1 saat buz üzerinde tutun ve 200 μL'lik geniş çaplı bir uçla birkaç kez pipetleyerek DNA'yı nazikçe yeniden süspanse edin. Parçalanma adımına başlamadan önce 1 saat buz üzerinde bırakın.

3. DNA parçalanması

NOT: Restriksiyon enzimi bazlı DRIP-seq için adım 3.1'i izleyin. Sonikasyon tabanlı DRIP-seq için, adım 3.2'ye atlayın.

  1. Restriksiyon enzimi (RE) parçalanması
    1. Tedarikçinin talimatlarına göre bir RE kokteyli kullanarak yeniden askıya alınmış genomik DNA'yı (çok viskoz) sindirin.
      1. Son reaksiyona 0.1 mM spermidin ekleyin. Toplam hacmi 150 μL olan her enzimden 30 U olan 4-5 enzimden oluşan bir kokteyl kullanın.
        NOT: DRIP-seq (HindIII, SspI, EcoRI, BsrGI, XbaI)4 için ilk kokteyl, ortalama 5 kilobazlık bir parça uzunluğu oluşturmak üzere geliştirilmiştir. CpG metilasyonu ile herhangi bir girişimden kaçının ve genomun GC açısından zengin bölgelerini yedekleyin. Diğer kokteyller de mümkündür16). Bu kokteyller hem insan hem de fare genomları için uygundur, ancak gerektiği gibi ayarlanabilir.
      2. Reaksiyon karışımını gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
        NOT: Sindirim sonrası DNA karışımı artık viskoz olmamalıdır. Bu adımda kalan herhangi bir viskozite, eksik bir sindirimin göstergesidir.
      3. Gözlenirse, her enzimden 10 U daha ekleyin ve 37 ° C'de 2-4 saat daha inkübe edin.
        NOT: Kullanıcılar, burada önerilenden daha fazla hücre toplamaları durumunda peletin tamamını sindiremeyebilir.
    2. Gece boyunca sindirilen DNA'yı (150 μL) önceden bükülmüş 2 mL'lik faz kilitli jel ışık tüpüne nazikçe pipetleyin. 100 μL su ve bir hacim (250 μL) Fenol/Kloroform İzoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Beş kez nazikçe ters çevirin ve 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün.
    3. Yeni bir 1.5 mL tüpe 1.5 μL glikojen, 1/10 hacim 3 M NaOAc (pH 5.2) ve 2.5 hacim %100 Etanol ekleyin. DNA'yı faz kilitli jel tüpünden pipetleyin ve beş kez ters çevirerek karıştırın. -20 °C'de 1 saat inkübe edin.
    4. 4 ° C'de 35 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün. DNA'yı 200 μL% 80 etanol ile yıkayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün.
    5. Peleti havayla kurutun ve pelete 50 μL TE tamponu ekleyin. Tüpü 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın ve DNA'yı nazikçe yeniden süspanse edin.
    6. Bir spektrofotometre kullanarak parçalanmış DNA'nın konsantrasyonunu (OD260) ölçün.
    7. İsteğe bağlı ancak önerilir: Sindirimin tamamlandığını doğrulamak için bir boyut işaretleyicinin yanı sıra% 0.8'lik bir agaroz jel üzerine 1 μg sindirilmiş DNA yükleyin. Jeli 100 V'ta bir saat çalıştırın.
      NOT: Eksikse, ek enzim eklenebilir. Eksik sindirim, immünopresipitasyondan sonra çözünürlük kaybına neden olabilir.
    8. Bu adımdan sonra, immünopresipitasyon üzerine alınan sinyalin DNA: RNA hibritlerinden türetildiğinden emin olmak için 10 μg sindirilmiş DNA'yı 4 μL ribonükleaz H (RNaz H) ile 37 ° C'de 1-2 saat tedavi edin. Ardından, S9.6 immünopresipitasyonuna geçin (adım 4).
      NOT: Sindirilen DNA'lar, önemli bir verim kaybı olmadan -80 ° C'de bir aya kadar donmuş halde tutulabilir.
  2. Sonikasyon
    1. Ekstrakte edilen DNA'nın tamamını veya bir kısmını 100 μL toplam hacimde 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sonikleştirin. Bir sonikatör üzerinde 15-20 döngü 30 s AÇIK / 30 s KAPALI gerçekleştirin (homojen sonikasyonu sağlamak için 5, 10 ve 15 döngüden sonra döndürün).
    2. Bir spektrofotometrede sonikasyonlu DNA'nın konsantrasyonunu (OD260) ölçün.
      NOT: Bu adımda, DNA'nın viskozitesi ortadan kalkmış olmalıdır.
    3. Sonikasyonlu DNA'nın (300-500 bp) boyut dağılımını doğrulamak için bir agaroz jeli çalıştırın.
      NOT: DNA'nın aşırı sonikasyonu, R-döngü yapılarının kırılması ve ayrışmasından kaynaklanan verimde önemli bir azalmaya yol açabilir.
    4. Bu adımdan sonra, immünopresipitasyon üzerine alınan sinyalin DNA: RNA hibritlerinden türetildiğinden emin olmak için 37 ° C'de 1-2 saat boyunca 4 μL RNase H ile 10 μg sonikasyonlu DNA muamelesi yapın. Ardından, S9.6 immünopresipitasyonuna geçin (adım 4).

4. S9.6 immünopresipitasyon

NOT: İmmünopresipitasyon adımları, DNA'nın RE'ler veya sonikasyon yoluyla parçalanıp parçalanmadığına bakılmaksızın benzerdir.

  1. Üç tüp hazırlayın ve tüp başına 500 μL TE tamponunun son hacminde 4.4 μg parçalanmış DNA alın. Daha sonra giriş DNA'sı olarak kullanmak üzere her tüpten 50 μL (hacmin 1/10'u) tasarruf edin.
  2. Seyreltilmiş DNA'nın 450 μL'sine 50 μL 10x bağlayıcı tampon (100 mM NaPO4 pH 7, 1.4 M NaCl, %0.5 Triton X-100) ve 10 μL S9.6 antikoru (1 mg/mL) ekleyin.
  3. Gece boyunca 4 °C'de 7-10 rpm'de bir mini tüp döndürücüde inkübe edin.
  4. Her tüp için, 50 μL Protein A/G agaroz boncuk bulamacını 700 μL 1x bağlayıcı tampon ile yıkayın ve tüpleri oda sıcaklığında 7-10 rpm'de 10 dakika boyunca bir mini döndürücü üzerinde ters çevirin. Boncukları 1,100 x g'da 1 dakika boyunca döndürün ve süpernatanı atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
  5. Adım 4.3'ten DNA'yı 50 μL boncuklara ekleyin ve bir mini döndürücü üzerinde 7-10 rpm'de ters çevirirken 4 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  6. Boncukları 1.100 x g'da 1 dakika döndürün ve süpernatanı atın.
  7. Boncukları 750 μL 1x bağlayıcı tampon ile mini döndürücüde 7-10 rpm'de ters çevirerek 15 dakika yıkayın. 1.100 x g'da 1 dakika aşağı çevirin ve süpernatanı atın. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
  8. Boncuklara 250 μL elüsyon tamponu (50 mM Tris-Cl pH 8, 10 mM EDTA pH 8, %0.5 SDS) ve 7 μL proteinaz K (20 mg/mL stok) ekleyin ve 55 ° C'de (12 rpm) 45 dakika boyunca rotasyonla inkübe edin.
  9. Boncukları 1.100 x g'da 1 dakika aşağı döndürün. Süpernatanı önceden bükülmüş 2 mL faz kilitli jel ışık tüpüne aktarın ve bir hacim (250 μL) Fenol/Kloroform İzoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Tüpleri beş kez ters çevirin ve oda sıcaklığında 16.000 x g'da 10 dakika döndürün.
  10. Yeni bir 1.5 mL tüpe 1.5 μL glikojen, 1/10 hacim 3M NaOAc (pH 5.2) ve 2.5 hacim %100 Etanol ekleyin. DNA'yı faz kilitli jel tüpünden pipetleyin ve beş kez ters çevirerek karıştırın. -20 °C'de 1 saat inkübe edin.
  11. 4 ° C'de 35 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün. DNA'yı 200 μL% 80 etanol ile yıkayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'da döndürün.
  12. Peletleri havayla kurutun ve her tüpe 15 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8) ekleyin. Tüpleri 20 dakika buz üzerinde bırakın ve yavaşça yeniden askıya alın. Üç tüpün içeriğini tek bir tüpte (45 μL) birleştirin.
  13. 45 μL yeniden süspanse edilmiş DNA'nın 5 μL'sini kullanarak qPCR ile DRIP verimliliğini kontrol edin (bkz. 5 μL'yi 10 μL su ile seyreltin ve reaksiyon başına 2 μL kullanın.

5. Yalnızca sonikasyonlu DNA için ön kütüphane adımı

NOT: Sonikasyon, R-döngülerinin yer değiştirmiş ssDNA zincirinin kırılmasına neden olur. Böylece, üç sarmallı R-döngü yapıları, sonikasyon üzerine iki sarmallı DNA: RNA hibritlerine dönüştürülür. Sonuç olarak, bu DNA:RNA hibritleri, kütüphane yapımından önce çift sarmallı DNA'ya geri dönüştürülmelidir. Burada, ikinci bir iplik sentezi adımı kullanılır. Başarılı bir şekilde kullanılan alternatif bir yaklaşım, bunun yerine tek sarmallı bir DNA ligasyonu ve ardından ikinci bir iplik sentezigerçekleştirmektir 53.

  1. Adım 4.12'den itibaren 40 μL DRIP'lenmiş DNA'ya 20 μL 5x saniye iplikçik tamponu (200 mM Tris pH 7, 22 mM MgCl2, 425 mM KCl), 10 mM dNTP karışımı (dATP, dCTP, dGTP ve kullanıcı ipliğe özgü DRIP dizilimi elde etmeyi planlıyorsa dTTT veya dUTP), 1 μL 16 mM NAD ekleyin, ve 32 μL su. İyice karıştırın ve buz üzerinde 5 dakika inkübe edin.
  2. 1 μL DNA polimeraz I (10 birim), 0.3 μL RNase H (1.6 birim) ve 0.5 μL E. coli DNA ligaz ekleyin. Karıştırın ve 16 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  3. Reaksiyonu hemen 1.6x oranında paramanyetik boncuklar kullanarak temizleyin. DNA'yı 40 μL'lik 10 mM Tris-Cl'de (pH 8) elute edin.

6. Yalnızca RE DNA için kütüphane öncesi sonikasyon adımı

NOT: DRIP, genellikle kilobaz uzunluğunda olan ve bu nedenle hemen kütüphane inşası için uygun olmayan RE parçalarının geri kazanılmasına yol açar.

  1. Kütüphane yapımı için malzemenin boyutunu azaltmak için, immünopresipite edilmiş DNA'yı 0.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sonikleştirin. Bir sonikatör üzerinde 12 döngü 15 s AÇIK / 60 s KAPALI gerçekleştirin (homojen sonikasyonu sağlamak için altı döngüden sonra döndürün). 7. adıma geçin.
    NOT: İmmünopupipüle edilmiş materyal, yan taraftaki çift sarmallı DNA'dan farklı şekilde sonikasyona yanıt veren üç sarmallı R-döngülerini hala taşır.
  2. İsteğe bağlı adım: DRIP profillerini eşitlemek için, immünopresipite edilmiş materyali, sonikasyondan önce 37 ° C'de 1 saat boyunca 1x RNase H tamponunda 1 μL RNase H ile muamele edin.

7. Kütüphane inşaatı

  1. Adım 4.12'den (RE parçalanması) veya adım 5.3'ten (sonikasyon kesme) 40 μL'ye 5 μL 10x uç onarım modülü tamponu, 2.5 μL 10 mM ATP ve 2.5 μL Uç onarım modülü enzimi (toplam 50 μL) ekleyerek son onarımı gerçekleştirin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Giriş DNA'sına karşılık gelen kontrol dizileme kitaplıkları oluşturmak için 1 μg YENİDEN sindirilmiş ve sonikasyonlu (DRIP) veya sonikasyonlu (sDRIP) giriş DNA'sı ekleyin.
  2. Reaksiyonu paramanyetik boncuklar (1.6x oran) kullanarak temizleyin ve 34 μL'lik 10 mM Tris-Cl'de (pH 8) elute edin.
  3. 5 μL tampon 2, 10 μL 1 mM dATP ve 1 μL Klenow exo- (toplam 50 μL) ekleyerek A-tailing gerçekleştirin. İyice karıştırın ve karışımı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  4. Reaksiyonu paramanyetik boncuklar (1.6x oran) kullanarak temizleyin ve 12 μL'lik 10 mM Tris-Cl'de (pH 8) elute edin.
  5. 15 μL 2x hızlı ligasyon tamponu, 1 μL 15 μM adaptör ve 2 μL hızlı ligaz (toplam 30 μL) ekleyerek adaptörleri bağlayın. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  6. Reaksiyonu paramanyetik boncuklar (1x oranı) kullanarak temizleyin ve 20 μL 10 mM Tris-Cl (pH 8) içinde elute edin.
  7. Sonikasyon kesme yapıldıysa ve adım 5.1'de dUTP kullanıldıysa, 1.5 μL (1.5 U) Urasil N-glikosilaz ekleyin ve ipliğe özgü bir DRIP elde etmek için 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
  8. PCR, adım 6.6 veya 6.7'den itibaren kütüphanenin 10 μL'sini yükseltir. 1 μL PCR primer 1.0 P5 (Malzeme Tablosuna bakınız), 1 μL PCR primer 2.0 P7 (Malzeme Tablosuna bakınız), 15 μL ana karışım ve 3 μL su ekleyin. İyice karıştırın.
  9. Bir termo döngüleyicide programı Tablo 1'de gösterildiği gibi çalıştırın.
  10. Paramanyetik boncuklar kullanarak kitaplığın iki aşamalı temizliğine devam edin. İlk olarak, 500 bp'nin üzerindeki parçaları çıkarmak için 0,65x oranını kullanın. Süpernatanı koruyun. 200 bp'nin altındaki parçaları çıkarmak için süpernatan üzerinde 1x oranına ilerleyin. 12 μL'lik 10 mM Tris-HCl'de (pH 8) elüte edin.

8. Kalite kontrol

  1. Pfaffl yöntemini kullanarak iki negatif ve üç pozitif lokus üzerinde qPCR ile R-döngü zenginleştirmelerini kontrol etmek için, adım 6.10'daki temizleme kitaplığının 1 μL'sini kullanın. Kütüphanenin 1 μL'sini 10 μL su ile seyreltin ve lokus başına 2 μL kullanın.
  2. Yüksek hassasiyetli bir DNA kiti kullanarak temizlenen kitaplığın boyut dağılımını adım 6.10'dan kontrol edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

DRIP ve sDRIP, qPCR (Şekil 2A) ve/veya dizileme (Şekil 2B) yoluyla analiz edilebilir. İmmünopresipitasyon adımından sonra, deneyin kalitesi ilk olarak pozitif ve negatif kontrol lokusları üzerinde qPCR ile ve ayrıca RNase H ile tedavi edilen kontrollerle doğrulanmalıdır. Birden fazla insan hücre hattında sık kullanılan lokuslara karşılık gelen primerler Tablo 2'de verilmiştir. qPCR'den elde e...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, S9.6 antikorunu kullanarak potansiyel olarak herhangi bir organizmada R-döngü yapılarını haritalamak için iki protokol açıklanmıştır. DRIP-seq, geliştirilen ilk genom çapında R-döngü haritalama tekniğini temsil eder. Herhangi bir genom boyunca R-döngülerinin dağılımını haritalamaya izin veren kolay, sağlam ve tekrarlanabilir bir tekniktir. DRIP-seq olarak adlandırılan ikinci teknik de sağlam ve tekrarlanabilirdir, ancak bir sonikasyon adımının ve ç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Chedin laboratuvarındaki çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01 GM120607) bir hibe ile desteklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL tube High density Maxtract phase lock gelQiagen129065
2 mL tube phase lock gel lightVWR10847-800
Agarose A/G beadsThermoFisher Scientific20421
Agencourt AMPure XP beadsBeckman CoulterA63881
AmpErase Uracil N-glycosylaseThermoFisher ScientificN8080096
Index adaptersIlluminaCorresponds to the TrueSeq Single indexes
Klenow fragment (3’ to 5’ exo-)New England BioLabsM0212S
NEBNext End repair moduleNew England BioLabsE6050
PCR primers for library amplificationprimer 1.0 P5 (5’ AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACTCTTTCCCTACACGA 3’)
PCR primers for library amplificationPCR primer 2.0 P7 (5’ CAAGCAGAAGACGGCATACG
AGAT 3’)
Phenol/Chloroform Isoamyl alcohol 25:24:1Affymetrix75831-400ML
Phusion Flash High-Fidelity PCR master mixThermoFisher ScientificF548S
Quick Ligation KitNew England BioLabsM2200S
Ribonuclease HNew England BioLabsM0297S
S9.6 AntibodyKerafastENH001These three sources are equivalent
S9.6 AntibodyMillipore/SigmaMABE1095
S9.6 AntibodyAbcamab234957

Referanslar

  1. Reaban, M. E., Lebowitz, J., Griffin, J. A. Transcription induces the formation of a stable RNA.DNA hybrid in the immunoglobulin alpha switch region. The Journal of Biological Chemistry. 269 (34), 21850-21857 (1994).
  2. Daniels, G. A., Lieber, M. R. RNA:DNA complex formation upon transcription of immunoglobulin switch regions: implications for the mechanism and regulation of class switch recombination. Nucleic Acids Research. 23 (24), 5006-5011 (1995).
  3. Yu, K., Chedin, F., Hsieh, C. L., Wilson, T. E., Lieber, M. R. R-loops at immunoglobulin class switch regions in the chromosomes of stimulated B cells. Nature Immunology. 4 (5), 442-451 (2003).
  4. Ginno, P. A., Lott, P. L., Christensen, H. C., Korf, I., Chedin, F. R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Molecular Cell. 45 (6), 814-825 (2012).
  5. Stolz, R., et al. Interplay between DNA sequence and negative superhelicity drives R-loop structures. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (13), 6260-6269 (2019).
  6. Duquette, M. L., Handa, P., Vincent, J. A., Taylor, A. F., Maizels, N. Intracellular transcription of G-rich DNAs induces formation of G-loops, novel structures containing G4 DNA. Genes & Development. 18 (13), 1618-1629 (2004).
  7. Carrasco-Salas, Y., et al. The extruded non-template strand determines the architecture of R-loops. Nucleic Acids Research. 47 (13), 6783-6795 (2019).
  8. Huppert, J. L. Thermodynamic prediction of RNA-DNA duplex-forming regions in the human genome. Molecular Biosystems. 4 (6), 686-691 (2008).
  9. Hartono, S. R., Korf, I. F., Chedin, F. GC skew is a conserved property of unmethylated CpG island promoters across vertebrates. Nucleic Acids Research. 43 (20), 9729-9741 (2015).
  10. Green, P., Ewing, B., Miller, W., Thomas, P. J., Green, E. D. Transcription-associated mutational asymmetry in mammalian evolution. Nature Genetics. 33 (4), 514-517 (2003).
  11. Polak, P., Arndt, P. F. Transcription induces strand-specific mutations at the 5' end of human genes. Genome Research. 18 (8), 1216-1223 (2008).
  12. Malig, M., Hartono, S. R., Giafaglione, J. M., Sanz, L. A., Chedin, F. Ultra-deep Coverage Single-molecule R-loop Footprinting Reveals Principles of R-loop Formation. Journal of Moleclar Biology. 432 (7), 2271-2288 (2020).
  13. Masse, E., Phoenix, P., Drolet, M. DNA topoisomerases regulate R-loop formation during transcription of the rrnB operon in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 272 (19), 12816-12823 (1997).
  14. Drolet, M., et al. The problem of hypernegative supercoiling and R-loop formation in transcription. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 8, 210-221 (2003).
  15. Chedin, F., Benham, C. J. Emerging roles for R-loop structures in the management of topological stress. The Journal of Biological Chemistry. 295 (14), 4684-4695 (2020).
  16. Ginno, P. A., Lim, Y. W., Lott, P. L., Korf, I., Chedin, F. GC skew at the 5' and 3' ends of human genes links R-loop formation to epigenetic regulation and transcription termination. Genome Research. 23 (10), 1590-1600 (2013).
  17. Sanz, L. A., et al. conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals. Molecular Cell. 63 (1), 167-178 (2016).
  18. El Hage, A., Webb, S., Kerr, A., Tollervey, D. Genome-wide distribution of RNA-DNA hybrids identifies RNase H targets in tRNA genes, retrotransposons and mitochondria. PLoS Genetics. 10 (10), 1004716(2014).
  19. Hartono, S. R., et al. The affinity of the S9.6 Antibody for Double-Stranded RNAs impacts the accurate mapping of R-loops in fission yeast. Journal of Molecular Biology. 430 (3), 272-284 (2018).
  20. Wahba, L., Costantino, L., Tan, F. J., Zimmer, A., Koshland, D. S1-DRIP-seq identifies high expression and polyA tracts as major contributors to R-loop formation. Genes & Development. 30 (11), 1327-1338 (2016).
  21. Alecki, C., et al. RNA-DNA strand exchange by the Drosophila Polycomb complex PRC2. Nature Communications. 11 (1), 1781(2020).
  22. Xu, W., et al. The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature Plants. 3 (9), 704-714 (2017).
  23. Chedin, F. Nascent connections: R-Loops and chromatin patterning. Trends in Genetics: TIG. 32 (12), 828-838 (2016).
  24. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J., Gromak, N. Human senataxin resolves RNA/DNA hybrids formed at transcriptional pause sites to promote Xrn2-dependent termination. Molecular Cell. 42 (6), 794-805 (2011).
  25. Kreuzer, K. N., Brister, J. R. Initiation of bacteriophage T4 DNA replication and replication fork dynamics: a review in the Virology Journal series on bacteriophage T4 and its relatives. Virology Journal. 7, 358(2010).
  26. Carles-Kinch, K., Kreuzer, K. N. RNA-DNA hybrid formation at a bacteriophage T4 replication origin. Journal of Molecular Biology. 266 (5), 915-926 (1997).
  27. Masukata, H., Tomizawa, J. A mechanism of formation of a persistent hybrid between elongating RNA and template DNA. Cell. 62 (2), 331-338 (1990).
  28. Itoh, T., Tomizawa, J. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (5), 2450-2454 (1980).
  29. Stuckey, R., Garcia-Rodriguez, N., Aguilera, A., Wellinger, R. E. Role for RNA:DNA hybrids in origin-independent replication priming in a eukaryotic system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5779-5784 (2015).
  30. Lee, D. Y., Clayton, D. A. Initiation of mitochondrial DNA replication by transcription and R-loop processing. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30614-30621 (1998).
  31. Xu, B., Clayton, D. A. A persistent RNA-DNA hybrid is formed during transcription at a phylogenetically conserved mitochondrial DNA sequence. Molecular and Cellular Biology. 15 (1), 580-589 (1995).
  32. Cadoret, J. C., et al. Genome-wide studies highlight indirect links between human replication origins and gene regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15837-15842 (2008).
  33. Sequeira-Mendes, J., et al. Transcription initiation activity sets replication origin efficiency in mammalian cells. PLoS Genetics. 5 (4), 1000446(2009).
  34. Picard, F., et al. The spatiotemporal program of DNA replication is associated with specific combinations of chromatin marks in human cells. PLoS Genetics. 10 (5), 1004282(2014).
  35. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genetics. 10 (5), 1004319(2014).
  36. Huang, F. T., Yu, K., Hsieh, C. L., Lieber, M. R. Downstream boundary of chromosomal R-loops at murine switch regions: implications for the mechanism of class switch recombination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (13), 5030-5035 (2006).
  37. Huang, F. T., et al. Sequence dependence of chromosomal R-loops at the immunoglobulin heavy-chain Smu class switch region. Molecular and Cellular Biology. 27 (16), 5921-5932 (2007).
  38. Yu, K., Lieber, M. R. Current insights into the mechanism of mammalian immunoglobulin class switch recombination. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 54 (4), 333-351 (2019).
  39. Crossley, M. P., Bocek, M., Cimprich, K. A. R-Loops as cellular regulators and genomic threats. Molecular Cell. 73 (3), 398-411 (2019).
  40. Santos-Pereira, J. M., Aguilera, A. R loops: new modulators of genome dynamics and function. Nature Reviews. Genetics. 16 (10), 583-597 (2015).
  41. Garcia-Muse, T., Aguilera, A. R Loops: From physiological to pathological roles. Cell. 179 (3), 604-618 (2019).
  42. Skourti-Stathaki, K., Proudfoot, N. J. A double-edged sword: R loops as threats to genome integrity and powerful regulators of gene expression. Genes & Development. 28 (13), 1384-1396 (2014).
  43. Costantino, L., Koshland, D. The Yin and Yang of R-loop biology. Current Opinion in Cell Biology. 34, 39-45 (2015).
  44. Boguslawski, S. J., et al. Characterization of monoclonal antibody to DNA.RNA and its application to immunodetection of hybrids. Journal of Immunological Methods. 89 (1), 123-130 (1986).
  45. Sanz, L. A., Chedin, F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nature Protocols. 14 (6), 1734-1755 (2019).
  46. Halasz, L., et al. RNA-DNA hybrid (R-loop) immunoprecipitation mapping: an analytical workflow to evaluate inherent biases. Genome Research. 27 (6), 1063-1073 (2017).
  47. Phillips, D. D., et al. The sub-nanomolar binding of DNA-RNA hybrids by the single-chain Fv fragment of antibody S9.6. Journal of Molecular Recognition. 26 (8), 376-381 (2013).
  48. Chedin, F., Hartono, S. R., Sanz, L. A., Vanoosthuyse, V. Best practices for the visualization, mapping, and manipulation of R-loops. The EMBO Journal. 40 (4), 106394(2021).
  49. Smolka, J. A., Sanz, L. A., Hartono, S. R., Chedin, F. Recognition of RNAs by the S9.6 antibody creates pervasive artefacts when imaging RNA:DNA hybrids. Journal of Cell Biology. 220 (6), 202004079(2021).
  50. Chen, J. Y., Zhang, X., Fu, X. D., Chen, L. R-ChIP for genome-wide mapping of R-loops by using catalytically inactive RNASEH1. Nature Protocols. 14 (5), 1661-1685 (2019).
  51. Yan, Q., Sarma, K. MapR: A Method for Identifying native R-loops genome wide. Current Protocols in Molecular Biology. 130 (1), 113(2020).
  52. Wang, K., et al. Genomic profiling of native R loops with a DNA-RNA hybrid recognition sensor. Science Advances. 7 (8), (2021).
  53. Crossley, M. P., Bocek, M. J., Hamperl, S., Swigut, T., Cimprich, K. A. qDRIP: a method to quantitatively assess RNA-DNA hybrid formation genome-wide. Nucleic Acids Research. 48 (14), 84(2020).
  54. Svikovic, S., et al. R-loop formation during S phase is restricted by PrimPol-mediated repriming. The EMBO Journal. 38 (3), 99793(2019).
  55. Yang, X., et al. m(6)A promotes R-loop formation to facilitate transcription termination. Cell Research. 29 (12), 1035-1038 (2019).
  56. Vanoosthuyse, V. Strengths and weaknesses of the current strategies to map and characterize R-Loops. Non-coding RNA. 4 (2), 9(2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

R d ng leriRNA DNA Hibritlerimm nopresipitasyonDRIP seqSDRIP seqGenomik nstabiliteTranskripsiyon G d ml Yap larHaritalama TeknikleriY ksek Verimli Dizilemepli e zg HaritalamaB D DNA Yap lar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır