Kızılötesi Lazer Destekli Mikropatterning ile Hücre Geometrisinin Kontrolü

Özet

Burada sunulan protokol, memeli hücrelerindeki sitoskeletal yapıları incelemek için hücre şeklini standartlaştıran mikropatternlerin otomatik olarak üretilmesini sağlar. Bu kullanıcı dostu teknik, piyasada bulunan görüntüleme sistemleri ile kurulabilir ve standart hücre biyolojisi laboratuvarlarına erişilemeyen özel ekipman gerektirmez.

Özet

Mikropatterning, hücre biyolojisi topluluğunda, hücresel hücreden hücreye varyasyonlardan kaynaklanan komplikasyonları atlatırken hücresel bölmelerin morfolojisi ve işlevi arasındaki bağlantıları incelemek için kullanılan yerleşik bir tekniktir. Hücre şeklini standartlaştırmak için hücreler ya 3D kalıplara hapsedilir ya da yapışkan adalar aracılığıyla yapışkan geometri için kontrol edilir. Bununla birlikte, fotolithografiye ve derin UV gravürlerine dayanan geleneksel mikropatterning teknikleri büyük ölçüde temiz odalara veya özel ekipmanlara bağlıdır. Burada, piyasada bulunan görüntüleme sistemleriyle kolayca kurulabilen Doyle ve ark. Bu protokolde, poli-vinil alkol kaplı kapaklar üzerinde önceden ayarlanmış bölgeleri ablates bir kızılötesi (IR) lazer aracılığıyla mikron hassasiyeti ile mikropatterns üretmek için bir Nikon A1R MP + görüntüleme sistemi kullanıyoruz. Donanım otomatik odaklama ile donatılmış olmayan sistemlerde yüksek verimlilik ve doğrulukla otomatik desen üretimi sağlamak için özel bir komut dosyası kullanmaktadır. Bu IR lazer destekli mikropatterning (mikrofotofopatterning) protokolünün, hücrelerin özel olarak bağlandığı ve istenen şekli aldığı tanımlanmış desenlerle sonuçlandığını gösteriyoruz. Ayrıca, hücre şeklinin standardizasyonu nedeniyle çok sayıda hücreden elde edilen verilerin ortalaması alınabilir. Bu protokolle oluşturulan desenler, yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve nicel analiz ile birlikte, form ve işlev arasındaki bağlantıya aracılık eden moleküler oyuncuları tanımlamak için nispeten yüksek aktarım hızı ekranları için kullanılabilir.

Giriş

Hücre şekli doku morfogenez^1,hücre göçü^2,hücre çoğalması³ve gen ekspresyasyonu⁴gibi temel biyolojik süreçlerin önemli bir belirleyicisidir. Hücre şeklindeki değişiklikler, plazma zarını deforme eden sitoskeletonun dinamik yeniden düzenlenmesi ile hücreye uygulanan dış kuvvetler ve hücre-hücre ve hücre matrisi yapışıklıklarının geometrisi gibi dış etkenler arasındaki karmaşık bir denge tarafından yönlendirilir⁵. Örneğin, mezenkimal hücrelerin geçirilmesi, plazma zarını ileri iten ve geniş bir lamellipodia⁶oluşturan öncü kenarda yoğun bir aksin ağını polimerize eder, aktomiyosin kontraktilitesi hücreyi mevcut konumundan ayırmak için hücrenin dar sondaki kenarını geri alır^7,8. Bu tür özel sitoskeletal yapılara yol açan sinyalizasyon olaylarını bozmak şekil ve polariteyi perturbs ve hücre göçunu yavaşlatır⁹. Ek olarak, gastrülasyon sırasında epitel tabaka bükme, hücrelerin ve komşularının kama şeklinde olmasına neden olan aktomiyosin bazlı apikal daralma gerektirir¹⁰. Bu çalışmalar hücre şeklinin önemini vurgulasa da, hücre şeklindeki doğal heterojenlik, morfolojiyi işleve bağlayan mekanizmaları belirleme çabalarını sonafettir.

Bu amaçla, son otuz yılda hücre şeklini manipüle etmek için çok sayıda yaklaşım geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, hücreyi üç boyutlu bir kalıpla kısıtlayarak veya hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin birtifasyon yüzeyine desenli birikmesi yoluyla hücresel yapışma geometrisini kontrol ederek amaçlarına ulaşır, mikropatterning¹¹olarak adlandırılan bir teknik. Burada, yıllar boyunca popülerlik kazanan bir dizi tekniği gözden geçireceğiz.

Başlangıçta mikroelektronik uygulamalar için bir yaklaşım olarak öncü olan yumuşak litografi tabanlı mikrokontact baskı, kesin olarak kült bir favori haline gelmiştir¹². Bir ana gofret ilk olarak fotoresist kaplı silikon substratın alanlarını fotoirradiasyona seçici olarak maruz bırakarak, desenli bir yüzey bırakarak imal edilir¹³. PDMS gibi bir elastomer, ECM proteinlerini istenen bir substrat^11,14'eaktaran yumuşak bir "damga" oluşturmak için ana gofrete dökülür. Üretildikten sonra, yüksek oranda tekrarlanabilir mikropatterns^12'yeyol açan birçok PDMS damgası dökmek için bir ana gofret kullanılabilir. Ancak uzun fotolitografi süreci nedeniyle desenler kolayca ayarlanamamaktadır. Bu işlem ayrıca biyoloji bölümlerinde tipik olarak bulunmayan son derece özel ekipman ve temiz odalar gerektirir.

Daha yakın zamanda, derin UV kullanarak doğrudan baskının geleneksel litografi tabanlı yaklaşımların getirdiği sınırlamaları atlattıği bildirilmiştir. Derin UV ışığı, bir fotomask aracılığıyla poli-L-lizinaşılı-polietilen glikol ile kaplanmış bir cam örtünün seçici alanlarına yönlendirilir. Derin UV'ye maruz kalan kimyasal gruplar, ECM proteinlerinin bağlanmasını sağlamak için ışığa duyarlı bağlayıcılar kullanılmadan fotokonverte edilir¹⁵. Işığa duyarlı bağlayıcıların olmaması, desenli kapak altlıkların yedi aydan fazla oda sıcaklığında sabit kalmasını sağlar¹⁵. Bu yöntem temiz odaların ve fotolithografi ekipmanlarının kullanılmasını önler ve daha az özel eğitim gerektirir. Bununla birlikte, foto maskeler gereksinimi, desenlerde kolayca kullanılabilir değişiklikler gerektiren deneyler için hala önemli bir engel teşkil etmektedir.

ECM proteinlerinin 2B yüzeyde kontrollü birikmesi yoluyla hücre geometrisini manipüle eden yöntemlere ek olarak, diğerleri hücreleri 3D mikroyapılara hapsederek hücre şeklini kontrol etmeye çalışır. Birçok çalışma, yukarıda açıklanan yumuşak litografi tabanlı yaklaşımı embriyolarda, bakterilerde, mayalarda ve bitkilerde şekle bağlı biyolojik süreçleri araştırmak için 2D, PDMS odaları yerine 3D üretmek için uyarlamıştır^16,17,18,19. İki fotonlu polimerizasyon (2PP), nanometre çözünürlüğü²⁰olan karmaşık 3D hidrojel iskeleler oluşturabilen bir mikrofabrikasyon tekniği olarak da öne geçti. 2PP, femtosaniye darbelerde verilen iki fotonun aynı anda bir molekül tarafından emildiği iki foton adsorpsiyon ilkelerine dayanır - bu durumda fotokilatör - fotopolimerlerin yerel polimerizasyonunu sağlayan²¹. Bu teknik, insan dokusunun yerel ECM yapılarını taklit eden 3D iskeleleri yazdırmak için yoğun olarak almıştır ve hücrelere düşük fotokimyasal hasar verdiği gösterilmiştir²².

10 yıl önce mikrofotoğrafçılığın piyasaya çıkışı, araştırmacılara erişilemeyen ve özel ekipmanlardan kaçınırken mikropatternler uydurma fırsatı verdi. Mikrofotopatterning, kızılötesi lazer^23,24kullanarak aktif cam yüzeylere kaplanmış poli-vinil alkolün (PVA) seçici bölgelerini termal olarak kaldırarak mikron ölçeğinde desenler oluşturur. PVA'yı değil, sadece alttaki cam yüzeyi bağlayan ECM proteinleri, kontrollü yayılma dinamiklerini ve hücre şeklini etkinleştirmek için biyokimyasal ipuçları olarak hizmet eder. Desenler gerçek zamanlı olarak kolayca değiştirilebildiğinden, bu yöntem aynı zamanda üstün esneklik sunar. Burada, ticari bir çoklu foton görüntüleme sistemi kullanarak mikrofotoğrafterning'in adım adım protokolünü sağlıyoruz. Açıklanan protokol, büyük desenlerin hızlı ve otomatik bir şekilde imal edilmesi için tasarlanmıştır. Hücre-ECM yapışıklıklarının geometrisini kısıtlayarak bu desenlerin hücre şeklini verimli bir şekilde kontrol ettiğini gösterdik. Son olarak, açıklanan desenleme tekniğinin aktin sitoskeletonunun organizasyonuna ve dinamiklerine göre modüle ettiğini gösteriyoruz.

Protokol

1. Kapaklı ön işleme

1. Waterman-Storer, 1998^25'teaçıklandığı gibi gıcırtılı temiz kapaklar hazırlayın.
2. % 1 (3-aminopropil)trimetoksisilane (APTMS) çözeltisi hazırlayın ve çözeltideki kapakları hafif ajitasyonla 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kapakların çözeltide serbestçe hareket etmesinden emin olun.
3. Kapak örtülerini her biri 5 dakika boyunca dH₂O ile iki kez yıkayın.
4. % 0,5 glutaraldehit (GA) çözeltisi hazırlayın ve kapak kapaklarını bir çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca çözeltide kuluçkaya yatırın. 25 kapak için 50 mL glutaraldehit çözeltisi kullanın. Kapakların çözeltide serbestçe hareket etmesinden emin olun.
5. Kapak örtülerini her biri 10 dakika boyunca dH₂O ile üç kez yıkayın.
6. Özel yapım bir kapak döndürücü kullanarak 30 sn için kuru kapakları döndürün. Kapak döndürücünün ayrıntılı bir açıklaması^{yayınlandı 26} ve çevrimiçi olarak kullanılabilir (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). Aktif kapaklar, birbirinden ayrı durmaları için bölücülü bir kutuda +4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.

2. PVA kaplama

1. %5,6'lık bir çözüm yapmak için PVA'yı (%98 hidrolizli PVA, MW 98000) dH₂O ile karıştırın.
2. Karışımı 90 °C'lik bir su banyosunda çözün ve sıcakken biyogüvenlik kabininde 0,2 μm'lik bir filtreden hemen süzün. Çökeltilirse stok çözeltisini yeniden filtreleyin. PVA çözeltisi oda sıcaklığında 3 ay saklanabilir.
3. 15 mL'lik bir tüpte, sekiz parça PVA'ya bir parça HCl ekleyin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez dikkatlice ters çevirin.
4. Karışık çözeltinin 2 mL'lik kısmını 35 mm Petri kabına dökün ve kapak altlarına yapışmamaya dikkat ederek sıvıya temiz, önceden işlenmiş bir kapak kapağı batırın. Bir çalkalayıcıda 5 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatır.
5. Kapakları çözeltiden dikkatlice çıkarın. 40 sn için palto döndürmek için kapak döndürücü spinner kullanın. Bu arada, cımbızları temizle. Kapak kapağını bir kutuya aktarın ve gece boyunca +4 °C'de kurutun. PVA kaplı kapaklar +4 °C'de iki haftaya kadar saklanabilir.

3. Multiphoton Mikroskobu Yapılandırma

NOT: Açıklanan protokol, özellikle donanım otomatik netlemesi ile donatılmış olmayan dik veya ters çoklu foton görüntüleme sistemlerinde istenen şekil ve boyutta hücre yapışkan mikropatternleri oluşturmak için ayarlanmıştır. Bu nedenle, her görüş alanı (FOV) için, desenleme komut dosyası kapakta güvenilir bir işaretleyici oluşturmak için küçük bir alanı kısaltır, mikroskobu kapak yüzeyine odaklamak için bir yazılım otomatik odaklama kullanır ve istenen deseni ortadan çıkarır. Bu komut dosyasını bitişik FOV'lar için bir döngüde çalıştırmak, hücre şeklini kısıtlayan ve hücre içi biyolojik süreçlerin etkinliğini modüle eden çok çeşitli mikropatternler (5 x 5 mm veya daha büyük) oluşturur. Açıklanan protokol, NIS-Elements yazılımı tarafından kontrol edilen Nikon A1R MP+ görüntüleme sistemi için geliştirilmiştir. Desenleme için başka bir satıcıdan görüntüleme sistemi kullanılıyorsa, optik yapılandırmalar ve desenleme komut dosyası üreticinin yönergelerine göre ayarlanmalıdır.

1. Mikroskop yazılımını açın. "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" hedefinin mikroskop üzerine monte edildiğine emin olun.
   NOT: Burada açıklanan protokol 25x/1.1 NA su daldırma hedefi için optimize edilmiştir, ancak diğer hedefler desenleme için de kullanılabilir. Okuyucular, yüksek büyütme hedefiyle(örneğin,40x ve 60x) sıvazlamanın, her FOV'da ablatlanan desen sayısını önemli ölçüde azalttığı için daha uzun zaman aldığının farkında olmalıdır. Düşük büyütme hedefleri, FOV boyunca tek tip aydınlatma ve PVA tabakasını alevlendirmek için yeterli lazer gücü sağladıkları sürece desenleme için kullanılabilir.
2. A1plus MP GUI penceresinde lazer çizgisini 750 nm olarak ayarlayın.
3. "Görüntü" optik yapılandırmasını ayarlama
   NOT: NIS-Elements, kullanıcılara mikroskop donanımını denetlemek için çeşitli araçlar (grafik arabirim, edinme iş akışı oluşturucu JOBS, optik yapılandırmalar ve makrolar) sağlar. Bu protokolde, donanım kontrolünün çoğu çeşitli optik yapılandırmaların yanı sıra ND Alma ve ND Stimülasyon modülleri ile elde edilir.
   1. Kalibrasyon sekmesinde, Yeni Optik Yapılandırma'ya tıklayın. Optik yapılandırmayı "Görüntü" olarak adlandırın. Bu, örtünmenin yansıtıcılık yoluyla görüntülenmesini sağlayan temel optik yapılandırmadır. Diğer tüm seçenekleri varsayılan olarak bırakın ve uygun hedefi seçin.
   2. A1plus MP GUI penceresinde, bu optik yapılandırma altındaki donanım ayarlarını yapılandırmak için Ayarlar düğmesine tıklayın. Stimülasyon Lazerini IR stimolarak ayarlayın, Işın Ayırıcıyı (BS 20/80) ışık yoluna yerleştirin, Tarayıcı Ünitesini Galvano'ya ayarlayın ve uygun descanned dedektörünü seçin.
   3. A1plus Compact GUI penceresinde, kapaktaki küçük özellikleri yakalamak için yeterli olan bir tarama boyutu ve çalışma süresi seçin (sistemimizde sırasıyla 1,1 ms ve 1024 piksel). Satır ortalaması veya hat tümleştirmesi yapılmaması için Normal düğmesine tıklayın. IR Lazer Kullan kutusunun işaretli olduğundan emin olun. Basitlik için tek yönlü tarama ayarlayın.
      NOT: Tarama hızı endişe vericiyse, çift yönlü tarama kullanılabilir.
   4. Aynı pencerede, kapak tabanı yüzeyinin parlak ancak doygun olmayan görüntüsünü elde etmek için lazer gücünü ve dedektör hassasiyetini ayarlayın. Lazer gücünü maksimum gücün %3-5'ine ve dedektör hassasiyetine ("HV" kaydırıcısı) 15 V'a ayarlamak iyi bir başlangıç noktasıdır.
   5. A1plus Tarama Alanı penceresinde, tüm FOV'u yakalamak için Yakınlaştırma'yı 1 olarak ayarlayın.
   6. Optik yapılandırmayı kaydedin.
4. "Print_Fudiciary_Marker" optik yapılandırmasını ayarlama
   1. "Görüntü" optik yapılandırmasını çoğaltın ve "Print_Fudiciary_Marker" olarak yeniden adlandırın.
   2. A1plus Compact GUI penceresinde, en küçük tarama boyutunu ve durma süresini seçin (sistemimizde sırasıyla 64 piksel ve 80,2 ms).
   3. Bu adımda görüntülemeye gerek olmadığından dedektör hassasiyetini 0 olarak ayarlayın ve lazer gücünü %30'a çıkarın. Daha yüksek lazer gücü, istenen bölgelerdeki kapaktaki PVA tabakasını termal olarak kaldıracaktır.
   4. A1plus Tarama Alanı penceresinde Zoom'u maksimuma ayarlayın (sistemimiz için 15,87) ve tarama alanını FOV'un ortasına yerleştirin.
   5. ND Edinme penceresinde, bir Z yığını denemesi ayarlayın. Z konumundaki hareketi Göreli olarak ayarlayın ve uygun Z cihazını seçin. Mikroskop aşamasındaki veya bitişik FOV'ler arasındaki PVA yüzeyindeki düzensizlikleri hesaba katmak için adım boyutunu 2 μm'ye ve yığın derinliğini 10 μm yukarıda ve aşağıda ayarlayın.
5. "Otomatik netleme" optik yapılandırmasını ayarlama
   1. "Görüntü" optik yapılandırmasını çoğaltın ve "Otomatik netleme" olarak yeniden adlandırın.
   2. A1plus Tarama Alanı penceresinde, Yakınlaştırma faktörünü azaltın, böylece FOV güven verici işaretleyiciden biraz daha büyüktür. Bu, kapak kapağındaki diğer küçük özelliklerin otomatik odaklamayı engellememesini sağlar.
   3. Aygıtlar menüsünde Otomatik Netleme Kurulumu 'naseçin. Tarama kalınlığını Z yığını deneyindeki Z yığınına ayarlayın (bkz. adım 3.5.5). Mikroskop bu aralığı tarayacak ve güven verici işaretleyiciyi kullanarak en iyi odak düzlemini bulacaktır. Adım boyutunu varsayılan olarak bırakın.
6. "Load_ROI" optik yapılandırmasını ayarlama
   1. "Görüntü" optik yapılandırmasını çoğaltın ve "Load_ROI" olarak yeniden adlandırın.
   2. A1plus Compact GUI penceresinde, tarama boyutunu yatırım getirisi maskesininkiyle aynı ayarlayın. Bu optik yapılandırma, yatırım getirisi maskesinin yüklenecek bir görüntüyü yakalamak için kullanılacaktır. Çözünürlük ve hız arasında optimum dengeyi sağlamak için 2048 piksel kullandık.
      NOT: Yakalanan bu görüntünün yatırım getirisi maskesiyle aynı boyutta olması önemlidir.
7. "Micropattern" optik yapılandırmasını ayarlama
   1. "Print_Fiduciary_Marker" optik yapılandırmasını çoğaltın ve "Micropattern" olarak yeniden adlandırın.
   2. Yakınlaştırma faktörünü bir olarak ayarlayın.
   3. A1plus MP GUI penceresinde, PVA'yı alevlendirmek için stimülasyon lazer gücünü artırın ve uygun bir tarama hızı seçin (deneylerimizde sırasıyla% 40 ve 32 s / kare).
   4. ND Stimülasyon penceresinde, bir ND stimülasyon deneyi ayarlayın. Zaman Çizelgesi'ne birkaç aşama ekleyin ve her biri Uyarım olarak ayarlayın. Stimülasyon alanının ve süresinin doğru olduğundan emin olun.
      NOT: Faz sayısı, PVA katmanının kalınlığına ve pürüzsüzlüğüne ve bu optik konfigürasyonda kullanılan lazer gücüne göre ayarlanabilir.
   5. Aynı pencerede, her aşamadan önce StgMoveMainZ(-1.000,1) işlevini etkinleştirin. Bu yine Z yönünde herhangi bir sapmayı oluşturur.
      NOT: Hedef hareketlerin uzaklığı ve yönü PVA tabakasının kalınlığına ve pürüzsüzlüğüne göre ayarlanabilir.
8. "Label_Surface" optik yapılandırmasını ayarlama
   1. "Print_Fudiciary_Marker" optik yapılandırmasını çoğaltın ve "Label_Surface" olarak yeniden adlandırın.
   2. A1plus Compact GUI penceresinde lazer gücünü önemli ölçüde artırın ve Zoom'ı bire ayarlayın. Burada kullanılan yüksek lazer gücü cam kapakçığa fiziksel olarak zarar verecek ve çıplak gözle görülebilen bir etiket üretecektir. Bu, daha sonraki deneylerdeki kalıpların bulunmasına yardımcı olur.

4. Yatırım getirisi maskesini oluşturma ve makroyu ayarlama

1. Yatırım getirisi maskesi oluşturma
   1. 2048 × 2048 RGB görüntü oluşturmak için Adobe Photoshop'u veya diğer kullanılabilir yazılımları kullanın. Görüntü mikroskop altında bir FOV'a karşılık gelir(yani, 532,48 × 532,48 μm, piksel başına 0,26 μm). Görüntünün siyah (0, 0, 0) arka planı olmalıdır.
      NOT: Lazer destekli mikropatterning için yatırım getirisi maskeleri oluşturmak için bir dizi ticari ve ücretsiz görüntü editörü kullanılabilir. Maskeleri oluşturmak için Adobe Photoshop'u kullanmamıza rağmen, GIMP ve ImageJ / Fiji alternatif ücretsiz seçenekler olarak da mevcuttur.
   2. Siyah arka plana 8 - 12 beyaz (255.255.255) desen çizin. Desen boyutu hücre türüne (~200 piksel çapında) bağlı olarak değişir. Otomatik odaklama için görüntünün ortasına 500 × 500 boş alan bırakın. En iyi ablasyon ve hücre eki için bitişik desenler (>200 piksel) ve FOV'un boarder'ı arasında yeterli boşluk bırakın. Bu protokolde sunulan desenler Github'da (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) mevcuttur.
2. Makroyu ayarlama
   1. Makro menüsünü tıklatın ve Yeni Makro'yu seçin.
   2. Github'da (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) bulunan "Pattern_Stimulation" kodunu Yeni Makro penceresine içe aktarın. Bu kod parçasını uygun bir klasöre kaydedin.
   3. Başka bir Yeni Makro penceresi açın ve Github'da (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) bulunan "Stage_Movement" kodunu içeri aktarın. Bu koddaki "Stage_Movement" çalışma dizininin 4.2.2 adımındakiyle aynı olduğundan emin olun. Adım 4.2.2'de "Stage_Movement" kodunu aynı klasöre kaydedin.

5. Fotoğraf ablasyonunu kullanarak mikropatternler üretmek

1. Mikroskobu ve aksesuarlarını açın. IR lazerin bundan önce yeterince ısındığından emin olun.
2. PVA kaplı kapak kapağını bir tutucuya aktarın. Dik bir mikroskop için PVA yüzeyinin aşağı doğru ablated olduğundan emin olun.
3. Kapak boruyu stabilize etmek için köşelere su ekleyin ve tutucuyu mikroskop aşamasına monte edin.
4. Hedefi düşürün ve kapak kılıfına su ekleyin.
   NOT: Burada açıklanan protokol, 25x/1.1 NA suya daldırma hedefi için optimize edilmiştir. Kuru veya yağ daldırma hedefi kullanılırsa, su uygun bir daldırma ortamı ile değiştirilmelidir. Büyük bir mikropattern dizisi oluşturmak için bir su daldırma hedefi kullanıldığında, buharlaşma bir sorun haline gelebilir. Bu durumda, su eczanelerden temin edilebilecek reçetesiz bir göz yağı olan GenTeal ile değiştirilmelidir.
5. Mikroskop yazılımında, A1plus MP GUI penceresinde IR lazer deklanşöre açın. Desenlemeden önce lazeri hizalamak için Otomatik Hizalama düğmesine tıklayın.
   NOT: Lazer yolundaki küçük sapmalar desenlerin kalitesini önemli ölçüde etkileyeceğinden, her desenleme seansının başında lazer otomatik hizalamanın gerçekleştirilmesi çok önemlidir.
6. "Görüntü" optik yapılandırmasına geçin. A1plus Compact GUI penceresinde, hedefi yavaşça kapak kılıfı yakınlaştırırken FOV'u taramak için Tara'yı tıklatın.
7. Görüntüyü dikkatlice izleyin. İlk başta, görüntü son derece soluk görünecektir. Görüntü parlaklığı artana kadar hedefi kapak kılıfı yakınlaştırın. Bu, hedefe bakan kapaklı yüzeydir. Parlaklık azalana ve tekrar artana kadar hedefi hareket ettirmeye devam edin. Bu, desenlenecek PVA yüzeyidir. Bu yüzeydeki herhangi bir küçük özelliğe (kapak sapları kusurları, toz vb.)odaklanın ve Z sürücüsünde sıfır ayarlayın. Odaklamadan sonra her zaman sıfırı ayarlayın.
   NOT: Kapak kapağının her iki yüzeyi de PVA ile kaplanmış olsa da, camın optik özellikleri PVA kaplama ile önemli ölçüde değiştirilmez. Bu tür kapakları rutin olarak kuru, su ve yağ daldırma hedefleriyle görüntüledik ve desenli olmayan PVA yüzeyini görüntülemeye engel olacak şekilde bulamadık.
8. "Label_Surface" optik yapılandırmasına geçin. Yakala 'yatıklayın. "Görüntüleme" optik yapılandırmasına dönün ve tarayın. Cam yüzey hasar görmeli ve amorf görünmelidir. Hasarlı alan çıplak gözle görülebilir, bu da diğer deneylerdeki desenlerin yerini gösterir.
   NOT: Görünür etiketin boyutunu artırmak için, bitişik birden çok EV'de 5.8 adımını yineleyin.
9. Amacın kabaca kapak kılıfının merkezinde olup olmadığını tekrar kontrol edin. Amaç ve kapak arasında yeterli su olduğundan emin olun. Cam parçacıklarını önlemek için sahneyi 1 ila 2 FOV hareket ettirin ve onaylamak için tarayın.
10. Aygıtlar menüsünde Stage_Movement makrosunu açın. Pattern_Stimulation çalışma dizininin doğru olup olmadığını denetleyin; değilse, stimülasyon oluşmaz. "PatternLength" ve "PatternHeight" değişkenlerini desenlenecek istenen SAYıDA FOV'a ayarlayın. Makroyu kaydedin ve çalıştırın.
11. Desenleme tamamlandıktan sonra "Görüntüleme" optik yapılandırmasına geçin. Yine, IR lazer deklanşörün A1plus MP GUI penceresinde açık olup olmadığını kontrol edin.
12. Desenleri görüntülemek için sahneyi hareket ettinin. Kalitelerini kontrol etmek için desenleri tarayın.
13. Kapak çizgisini, desenler yukarı bakacak şekilde kılavuz kutusuna aktarın.
14. Desenli kapakları kullanmadan önce bir haftaya kadar +4 °C'de saklayın.

6. Fibronektin adsorpsiyon

1. Taze 1 M NaBH_4'te 1 M NaOH çözeltisi yapın. 0,2 M etanolamin içeren pH 8.0 fosfat tamponuna 1:100 oranında ekleyin.
2. Desenli kapakları 35 mm'lik doku kültürü çanağı içine aktarın. Otofluoresansı söndürmek için her kapak kapağını yukarıdaki çözeltinin 1 mL'si ile 8 dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve ardından PBS ile 3 kez durulayın.
3. PBS'deki fibronektin (FN) 10 μg/mL'lik son konsantrasyona seyreltin. Kapak kapağını FN'de +37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın.
   NOT: ECM proteininin substrata önemli ölçüde spesifik olmayan bağlanması gözlenirse, FN% 0.1 Pluronic F-127²⁴içeren PBS'de seyreltilebilir.
4. Kapak kapağını PBS ile 2 kez yıkayın. Hemen kullanılmazsa, PBS'de bir gecede +4 °C'de saklayın.

7. Hücre eki

NOT: Aşağıdaki protokol birincil insan dişeti fibroblastları için optimize edilmiştir.

1. 10 cm'lik bir hücre çanağını% 70 izdiah eder.
2. +37 °C su banyosunda hücre kültürü ortamı, PBS ve %0,05 trypsin ısıtın.
   NOT: Substrata zayıf yapışan hücreler için, versen (0,48 mM EDTA) veya tescilli enzim içermeyen tampon ile proteolitik olmayan ayrışma, hücrenin desenlere bağlanmasını artırabilir ve dikkate alınmalıdır.
3. Tohumlama hücrelerinden önce, desenli kapak kapağını 1 mL sıcak PBS içeren temiz bir 35 mm doku kültürü kabına yerleştirin.
4. Hücre kültürü medyasını 10 cm'lik doku kültürü çanağını aspire edin ve PBS ile bir kez yıkayın.
5. Yemeğe 700 μL% 0.05 tripsin / EDTA ekleyin ve hücreleri +37 ° C, % 5 CO₂ inkübatörde 1 dakika kuluçkaya yatırın.
6. Bu arada, desenli kapak sapını kaplayan PBS'yi aspire edin ve 1 mL hücre kültürü ortamı ekleyin.
7. Hücrelerin ayrıldığını onaylayın. Daha sonra 10 mL hücre kültürü ortamı ile trypnized hücreleri yeniden biriktirin ve desenli kapak kılıfı için 1 mL ekleyin.
8. 2 - 3 saat boyunca inkübatördeki kültür hücreleri ve desenlere yeterli sayıda hücre takılıp bağlanmamış olup olmadığını kontrol edin. Bu şekilde, eklenmemiş hücreleri kaldırmak için ortamı bir kez değiştirin. Bu, birden çok hücrenin aynı desene inme olasılığını en aza indirir.
   NOT: Ek süresi hücre türüne bağlı olarak değişebilir.
9. Başka bir 3-4 saat sonra veya yeterli sayıda hücre desenler üzerinde yayıldığında, hücreler daha fazla deney için hazırdır. Hücre bölünmesini önlemek için çok fazla beklemeyin.

8. Veri toplama

1. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca sitoskeleton tampon^{27'de% 4} PFA ile hücreleri sabitlayın.
2. İlgi çekici proteinler için oluşturulan immünofluoresans protokollerini izleyin. PVA kaplı kapaklar herhangi bir immünofluoresans protokolü ile iyi çalışır.
3. Uygun bir mikroskop kullanarak hücrelerin görüntülerini alın. Denemenin amacına bağlı olarak, FOV başına bir veya birden çok hücreyi görüntüleyin.

9. Görüntü analizi

NOT: Aşağıdaki protokol, kullanıcıların Z-mikroskop görüntüleri yığınlarından çok sayıda hücre üzerinde ilgi proteininin ortalama floresan sinyalini elde etmelerini sağlar.

1. Elde edilen görüntüleri NIS Elements'ta açın ve görüntüleri kırpın. Her görüntünün yalnızca bir iyi yayılmış hücre içerdiğinden emin olun. Görüntü işleme ile ilgili ayrıntılı talimatları aşağıdaki komut dosyasında bulabilirsiniz.
2. Anaconda'yı yükleyin ve Spyder'ı Anaconda Navigator aracılığıyla başlatın.
   NOT: .py komut dosyaları, gereksinimlerde tanımlanan uygun paketlerle herhangi bir ortamda çalıştırılabilir.txt. Anaconda'nın aşağıdaki kodlar için gerekli paketlerin çoğunu içerdiğinden öneririz.
3. Komut dosyasını Github'dan indirin (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) ve sırasıyla 3Kanallı veya 4 Kanallı görüntüler için Spyder( "Pattern_Averaging_3Channels.py " veya " Pattern_Averaging_4Channels.py" içinde açın.
4. Elde edilen görüntülere göre parametreleri ayarlayın. Ayrıntılı açıklamalar için komut dosyasına bakın.
5. Komut dosyasını çalıştırmak için F5 tuşuna basın. İlerleme Konsol panelinde izlenebilir.
6. Aynı klasöre kaydedilen çıktı dosyalarını alın. Çıktı görüntüleri, tüm örnekler için her kanalın ortalamasıdır. Excel sayfası, örnek bir hücre içindeki her kanalın ortalama yoğunluğunu gösterir ve bu da daha fazla nicel analiz sağlar.

Sonuçlar

Mikropatterning yoluyla elde edilen deneysel verilerin kalitesi büyük ölçüde kalıpların kalitesine bağlıdır. Yukarıdaki yöntemle oluşturulan desenlerin kalitesini belirlemek için ilk olarak kapak kapağının fotoğraf ablated alanlarının şeklini ve boyutunu değerlendirmek için reflektans mikroskopisini kullandık. Her bir desenin ablasyon maskesine çok benzediğini ve şeffaf yatılılar ve ışığı düzgün bir şekilde yansıtan bir yüzey sergilediğini gördük (Şekil 2B

Tartışmalar

Yukarıdaki sonuçlar, tanımlanan IR lazer destekli mikropatterning (mikrofotofopatterning) protokolünün, hücre şeklinin ve sitoskeletal mimarinin manipülasyonu sağlayan çeşitli şekillerde tekrarlanabilir yapışık desenler sağladığını göstermektedir. Mikrofotoğrafçılığın hem öncesinde hem de sonrasında çok sayıda mikropatterning yöntemi geliştirilmiş olsa da, bu yöntem çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, genellikle sadece Mühendislik bölümlerinde bulunan özel ekipman ve temiz ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Cell Culture Dish	VWR	10062-880	Polysterene, TC treated, vented
25X Apo LWD Water Dipping Objective	Nikon	MRD77225
3.5 cm Cell Culture Dish	VWR	10861-586	Polysterene, TC treated, vented
4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL dihydrochloride solution
Bovine Serine Albumin	BioShop	ALB005
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectin	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL in pH 7.5 buffer
Fibronectin Antibody	BD	610077	Mouse
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Fluorescent Phalloidin	Invitrogen	A12380	568nm
Glass Coverslip	VWR	16004-302	22 × 22 mm
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16220	25% aqueous solution
Hydrochloric Acid	Caledon	6025-1-29	37% aqueous solution
IR Laser	Coherent	Chameleon Vision
Minimal Essential Medium α	Gibco	12561-056
Mounting Medium	Sigma	F4680
Mouse Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4408S	Goat, 488nm
Multi-Photon Microscope	Nikon	A1R MP+
Myosin Light Chain Antibody	Cell Signaling Technology	3672S	Rabbit
NIS Elements	Nikon		Version 5.21.03
Nitric Acid	Caledon	7525-1-29	70% aqueous solution
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Powder
Poly(vinyl alchohol)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98% hydrolyzed
Rabbit Secondary Antibody	Cell Signaling Technology	4412S	Goat, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Alsoknown as analog rocker
Sodium Borohydride	Aldrich	452882	Powder
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma	S5136	Powder
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S5011	Powder
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA