Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Özet

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Özet

Protein arginin metiltransfenazlar (PRMTs) çok sayıda hücresel işlemde rol oynayan çok çeşitli proteinler üzerinde metillat arginin kalıntıları. PRMT'ler simetrik veya asimetrik olarak mono veya dimetilit arginin guanidino grupları olabilir. Bu proteinlerin enzmolojisi, miligram miktarlarda yüksek kaliteli rekombinant protein gerektiren karmaşık ve yoğun bir şekilde araştırılan bir alandır. Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ve Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) böcek hücrelerini kullanan baculovirus ekspresyon vektör sistemi (BEVS), PRMT 1, 2 ve 4 ile 9 arasında birçok PRMT'nin ekspresyon taraması ve üretimi için kullanılmıştır. Etki alanları ve kesilmiş parçaların yanı sıra tam uzunlukta proteinler de dahil olmak üzere bu proteinlerin birden fazla yapılarının ifadesini aynı anda taramak için, 24 ve 96 kuyu plakaları ve blokları ile birlikte ayarlanabilir ve programlanabilir çok kanallı pipetler kullanarak ölçeklenebilir yöntemler uyguladık. Genel olarak, bu yöntem ayarlamaları büyük ölçekli bir bakteri DNA'sı, rekombinant virüsler ve protein ekspresyon taramasının üretilmesini sağladı. Yüksek dolu hacimli Sf9 hücre süspansiyonu ile kültür gemilerinin kullanılması, tek parti büyük ölçekli protein üretimi için üretim boru hattındaki alan sınırlamalarının aşılmasına yardımcı oldu. Burada, biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar için fonksiyonel PRMT'lerin verimli ve uygun maliyetli ekspresyosu için ayrıntılı protokoller açıklıyoruz.

Giriş

Protein arginin metiltransfenazlar (PRMT'ler) monometrik veya simetrik/asimetrik dimetil tarzında metillat arginin kalıntıları. Tekrarlayan RG/RGG/GRG dizileri çoğu PRMT tarafından çok tercih edilir ve çok çeşitli proteinlerde bulunur^1,2. Histonlar veya transkripsiyon faktörleri ve birleştirme faktörleri gibi arginin metillenmiş proteinler transkripsiyon, birleştirme ve kromatin yapısını düzenler^3,4. PRMT'lerin substrat ve kofaktör kullanımı, cirosu ve kinetiğinin çeşitli düzenlenmesi ve seçici inhibitörlerin üretimi hakkında artan bilgi, bu enzimlere ve komplekslerine mekanistik ışık tutmaktadır^5,6. Ancak, tüm PRMT aile üyeleri aynı ölçüde çalışılmamıştır; örneğin, PRMT9'un PRMT ailesinin bir üyesi olduğu yeni keşfedildi¹. Bu proteinler için yapı ve enzim fonksiyon çalışmaları yeterli, genellikle miligram, miktarlarda rekombinant proteinin mevcut olmasını gerektirir.

Escherichia coli (E. coli) prokaryotik ifade sistemi genellikle belirli bir protein⁷,^8,9için birden fazla yapı kullanılarak ifade taraması için ilk tercihtir. Bununla birlikte, E. colibazlı ekspresyon, özellikle PRMT5 ve PRMT7 için belirttiğimiz gibi, aktif formlarında her zaman yeterli miktarda PRMT proteini ile sonuçlanmamıştır (aşağıya bakın). Böylece E. coli'de ifade edemeyen veya ökaryotik ekspresyon makineleri tarafından üretilmesi gereken PRMT'ler alternatif baculovirüs ekspresyon vektör sisteminde (BEVS) ekspresyon taramasına uygun vektörlere alt kavun haline getirildi. E. coli PRMT1, PRMT3 ve PRMT8 örneklerini in vitro tahliller ve kristalografi için yoğun olarak kullanırken, çift metiltransfenaz alanının MEP50 bağlayıcı ortağı gerektiren PRMT5 ve PRMT7 ve 9 gibi PRMT'ler gibi diğer PRMT'ler yeterli miktarda aktif protein elde etmek için böcek hücresi ekspresyonunu gerektirir. Genel olarak, PRMT4, 5, 6, 7 ve 9 için standartlaştırılmış orta verimli metiltransfenaz tahlilleri BEVS'i böcek hücrelerinde kullanmıştır⁶. Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalar için gerekli olan çeviri sonrası modifikasyonları sağlayan ökaryotik ekspresyon makineleri gerektiren rekombinant proteinler üretmek için çok yönlü bir platformdur^10,11,12. Birkaç BEVS, 1983'te protein ekspresyonu için bildirilen ilk baculovirüs kullanımından bu yana ticari olarak kullanılabilir hale^{gelmiştir 13}. Bu protokollerin çoğu, ifade plazmidinin böcek hücrelerine aktarılması için farklı stratejiler kullanmaktadır. Bunlar Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, vb. Protokolümüz, BEVS'te en sık kullanılan sistem olan Bac-to-Bac sistemi^14'edayanmaktadır, ilgi proteinini kodlayan geni / cDNA kodlamasını (POI, burada PRMT'ler) meydana özgü bir E. coli suşunda tutulan baculovirüs genomuna aktarmak için tasarlanmıştır^15.

Kısaca, ilgi genini içeren plazmid transfer vektörü, rekombinant viral bacmid DNA'sı oluşturmak için DH10Bac E. coli yetkin hücrelerine dönüştürüldü. Daha sonra yandaş Sf9 hücrelerine bacmid DNA'sı bulaştı. Transfeksiyondan dört ila beş gün sonra, hücre kültürü ortamına salgılanan ilk rekombinant baculovirüsler kurtarıldı ve P1 virüsü olarak etiketlendi. P1 baculovirus stokları daha sonra virüs amplifikasyonu (yani P2 baculovirus stoklarının üretimi) ve protein ekspresyon taraması için kullanıldı. İfade tarama sonuçlarına dayanarak, proteinin en iyi ifade yapısı için P2 virüsleri tanımlanmış ve büyük ölçekli protein üretimi için baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin (SCBIIS) süspansiyon kültürlerini oluşturmak için kullanılmıştır. Burada, istenen rekombinant proteinlerin yeterli miktarda elde etmek için daha zaman verimli, uygun maliyetli ve ölçeklenebilir bir metodoloji geliştirme stratejimizi desteklemek için reaktif ve kültür gemisi seçimlerimizin arkasındaki mantığı açıklıyoruz.

Protokol

NOT: BEVS protokol adımlarına genel bakış Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. Rekombinant bacmid DNA'sının üretimi

1. DH10Bac dönüşümü için LB agar seçici plakalarının hazırlanması
   1. DH10Bac transformantları için seçmek üzere 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 200 μg/mL Bluo-gal ve 40 μg/mL IPTG içeren LB agar plakaları hazırlayın.
   2. 25 g önceden karıştırılmış LB suyu ve 13 g Bacto Agar ağırlığında ve 2 L şişeye koyun. Hacmi damıtılmış su ile 1 L'ye getirin ve 121 °C'de 15-30 dakika otoklavlayın.
   3. 50 °C'de bir su banyosu ayarlayın ve otoklavlı agar çözeltisini su banyosunda 50-55 °C'ye kadar soğutun.
   4. Soğutulmuş çözeltiye, 7 μg/ mL'lik son konsantrasyona gentamisin, 50 μg / mL'lik son konsantrasyona kanamycin, 10 μg / mL'lik son konsantrasyona tetrasiklin, 200 μg / mL'lik son konsantrasyona Bluo-gal ve 40 μg / mL'lik son konsantrasyona IPTG ekleyin.
   5. Agar çözeltisini ve 7-10 mL'lik ortayı 50 mL pipet kullanarak her 60 mm plakaya karıştırın. Tabakların sertleşmesi için oda sıcaklığında (2 saat) oturmasına izin verin. 4 °C'de ters çevirin, sarın ve saklayın. Antibiyotik içeren plakalar 4 haftaya kadar stabildir.
2. Plazmid'in DH10Bac E. coli yetkin hücrelere dönüşümü
   1. Gerekli yetkin hücre hacmini hesaplayın.
   2. Buz üzerinde yetkin hücreleri çözün, hafifçe aşağı dönün ve hafifçe dokunarak geriye doğru yeniden biriktirin.
   3. 96 kuyulu PCR plakasının her kuyusuna 4 μL hücre dağıtmak için 12 kanallı bir pipet kullanın.
   4. Yetkin hücrelere ~ 0.3-0.5 μg rekombinant plazmid DNA ekleyin ve dokunarak hafifçe karıştırın. Karışımı 10-15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
   5. Karışımı 45 s için 42 °C'de bir PCR makinesinde ısı şoku. 2 dakika buzda soğutun.
   6. 96 kuyulu blokların her kuyusuna (96 derin kuyu 2,4 mL) 0,5 mL SOC ortamı dağıtın.
   7. Dönüştürülmüş bakteri süspansiyonu bloğun ilgili kuyusuna aktarmak ve bir airpore levha ile örtmek için 12 kanallı bir pipet kullanın.
   8. Bloğu 4-5 saat orta ajitasyon (205 rpm) ile 37 °C'de sallanan bir inkübatöre yerleştirin.
   9. Kültürün 30-50 μL'lik kısmını steril cam boncuklar kullanarak LB agar plakasının yüzeyine eşit şekilde yayın. Kültürün geri kalanını 4 °C'de saklayın.
   10. Mavi/beyaz kolonilerin rengi fark edene kadar plakaları 37 °C'de kuluçkaya yatırın (40-48 saat). Plaka üzerinde yeterli beyaz, büyük koloniler elde edildiğinde kültürü atın.
   11. Beyaz kolonilerin sadece rekombinant bacmid DNA içermesini sağlamak için, fenotipi doğrulamak için izole edilmiş bir beyaz koloniyi antibiyotik, bluo-gal ve IPTG içeren taze LB agar plakalarına yeniden çizin.
   12. 37 °C'de 48 saat kuluçkaya yaslanın.
   13. Rekombinant bacmid DNA'sının çıkarılması için yeniden çizgili bir plakadan doğrulanmış bir beyaz koloni seçin.
3. İzolasyon rekombinant bacmid DNA
   1. Tek, izole edilmiş bir beyaz koloniyi 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin ve 10 μg/mL tetrasiklin ile desteklenmiş 3 mL LB ortamına 24 kuyulu bloklar halinde (24 kuyu blokları yuvarlak alt) aşılayın ve bir airpore levha ile örtün.
   2. 250 rpm'de sallanarak bir gecede 37 °C'de büyüyün.
   3. 24 kuyulu blokları 2.100 x g'da 10 dakika santrifüj edin. Süpernatantı dekant, bloğu ters çevirin ve emici bir kağıt mendile hafifçe dokunun. Her kuyuya 250 μL çözelti 1 (hücre resüspenzyon çözeltisi) ekleyin.
   4. Blokları bant pedleri veya diğer sızdırmazlık filmleriyle kapatın ve 5-10 dakika boyunca 75 rpm'de bir sallama platformuna yerleştirin. Uygun hücre lizizini sağlamak için her kuyuya bakın ve gerekirse 1 mL'lik bir uç kullanarak yeniden dirildi.
   5. Her kuyuya 250 μL çözelti 2 (hücre liziz çözeltisi) ekleyin, blokları kapatın ve 30 s için 75 rpm'de bir sallama platformuna yerleştirin (numunelerin çapraz kirlenmesini önlemek için, 24 kuyu bloklarını ters çevirmeyin) oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkalayın.
   6. 250 μL çözelti 3 (nötralizasyon çözeltisi) ekleyin, blokları kapatın ve 30 s için 75 rpm'de sallama platformuna yerleştirin. Kalın beyaz bir protein çökeltici ve E. coli genomik DNA oluşacaktır. Numuneyi 10-15 dakika boyunca buza yerleştirin.
   7. Beyaz çökeltme malzemesini sıkıca peletmek için 4 °C'de 2.100 x g'da 60 dakika santrifüj. Santrifüjleme sırasında, yeni bir mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve 0,8 mL mutlak izopropanol ekleyin.
   8. Süpernatantı, herhangi bir beyaz çökelti malzemesinden kaçınarak izopropanol içeren tüpe hafifçe aktarın. Tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek karıştırın ve ardından 5 ila 10 dakika boyunca buza yerleştirin. Bu aşamada, numune gece boyunca -20 °C'de saklanabilir.
   9. Numuneyi 4 °C'de 14.000 x g'da 15 dakika santrifüj edin. Süpernatant çıkarın ve her tüpe% 70 etanol 0.5 mL ekleyin. Peletin yıkanması için tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 14.000 x g'da 5 dakika santrifüj. (İsteğe bağlı: tekrar yıkama)
   10. Plazmid preparatının sterilitesini sağlamak ve süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için laminer akış davlumbazının içine numuneler getirin.
       NOT: Pelet tüpün altından yerinden çıkabilir, bu nedenle üst kısmı atarken peletin dikkatlice izlenmesini izleyin.
   11. Peleti laminar akış davlumbazının içinde 15 - 20 dakika boyunca havayla kurutun ve DNA'yı 50 μL filtrelenmiş elüsyon tamponunda, 10 mM Tris-Cl'de, pH 8.5'te çözün (peletlerin aşırı kurulmadığından emin olun).
   12. Rekombinant bacmid DNA'sı 135 kb'den büyük olduğundan, DNA'nın yamulmasını önlemek için, hafifçe dokunarak peletin çözün.
   13. Bacmid DNA'sında ilgi geninin varlığını doğrulamak için PCR reaksiyon karışımını 96 kuyulu bir PCR plakasına ayarlayın.
   14. PCR karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın: 1 μL tampon, 0,2 μL (her biri 10 mM), 0,1 μL Taq DNA polimeraz, 0,1 μL (25 μM) ileri ve ters astarlar (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL bacmid DNA ve 8 μL su.
   15. Hedef genlerin amplifikasyonunu 95 °C'de 2 dakika boyunca ilk denatürasyon ile gerçekleştirin, ardından 30 s için 94 °C 25 döngü, 30 s için 55 °C ve 1 dk/kb için 72 °C.
   16. 72 °C'de 7 dakika boyunca son uzatmadan sonra reaksiyona son ver.
   17. Elektroforezi ile nükleik asit boyama çözeltisi içeren %1 (w/v) agarose jel üzerinde amplifikasyon ürününün 10 μL analiz edin.
   18. Doğrulanmış bacmid DNA'ları 4 °C'de saklayın.

2. Rekombinant baculovirüs stoklarının üretimi

NOT: Baculovirüs üretimi için hücre transfeksiyonu, baculovirüs hacim amplifikasyonu, protein ekspresyon taraması ve protein üretimi de dahil olmak üzere baculovirüs ekspresyon protokolünün herhangi bir adımı için% 95 veya daha fazla canlılığa sahip katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerini kullanın.

1. Sf9 hücrelerinin Bacmid DNA'sı ve JetPrime veya X-tremeGENE 9 gibi transfeksiyon reaktifleri (T.R.) ile transfeksiyonu.
   NOT: Uygun hücre sayısını ve % hücre canlılığını belirlemek için Trypan Mavi boyama ve hemositometre kullanılabilir. Canlı olmayan hücreler lekeyi alır ve mikroskop altında mavi görünürken, canlı hücreler etkilenmeden kalır. % hücre canlılığını hesaplamak için toplam hücre sayısı elde edilir (lekesiz ve lekeli) ve uygulanabilir hücre sayısı toplam hücre sayısına bölünür ve 100 ile çarpılır.
   1. Katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerini serumsuz böcek ortamlarında 4 x 10⁵ hücre / mL nihai hücre yoğunluğuna seyreltin ve steril reaktif rezervuarına dökün.
   2. Seyreltilmiş Sf9 hücrelerinin 0,5 mL'lik kısmını 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna tohumlamak için programlanabilir bir çok kanallı pipet kullanın.
   3. Plakanın bir kuyusunu kontrol (transtransfected) olarak etiketle ve potansiyel enfeksiyon belirtilerini değerlendirmek için transfected ve transfected olmayan hücreleri karşılaştırmak için bir kontrol olarak kullanın.
   4. Hücreleri plakalara tohum ettikten sonra, hücrelerin eşit bir monolayerini sağlamak için plakaları birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın. Plakaları döndürmeyin, çünkü hücreler kuyunun ortasına kümelenir.
   5. Kültür plakalarına hücre bağlanmasına izin vermek için plakaları en az 1 saat boyunca 27 °C'de kuluçkaya yatırın.
   6. Transfeksiyon reaktif şişesini iyice karıştırın. Her transfeksiyon için transfeksiyon tamponunun 100 μL'sine 2 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin. Başka herhangi bir desteksiz böcek ortamı da kullanılabilir. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini steril bir reaktif rezervuarında biriktirin ve 10 s boyunca hafifçe karıştırın.
   7. 12 kanallı pipet kullanarak, seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin 102 μL'lik kısmını steril bir 96 mikrowell plakaya aktarın.
   8. 0,2 μg/μL'lik bir rekombinant bacmid DNA çözeltisinin 10 μL'lik kısmını 96 kuyulu bir mikrowell plakasının ilgili kuyusuna aktarın ve plakayı yanlardan hafifçe sallayarak (dokunarak) karıştırın.
   9. Karmaşık oluşumu sağlamak için transfeksiyon karışımını 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
   10. 96 ve 24 kuyu plakaları arasında aktarım için tasarlanmış ayarlanabilir 6 kanallı pipet kullanarak, transfeksiyon karışımını hücrelere damla yönünde transeksiyon plakalarının ilgili kuyularına ekleyin ve 27 °C'de 4-5 saat kuluçkaya yatırın.
   11. Transfeksiyon karışımının hücre monolayer üzerinde eşit dağılımını sağlamak için inkübasyon süresi boyunca plakaları birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın.
   12. Transfeksiyondan sonra 4-5 saat, ısı inaktive fetal sığır serumu ve antibiyotik-antimycotic'in % 1 (v/v) son hacmine (100 birim/mL penisilin) % 10 (v/v) ile desteklenmiş 1,5 mL böcek serumsuz ortam ekleyin, 100 μg/mL streptomisiin ve 0,25 μg/mL amfoterisikin B).
   13. Hücreleri 27 °C inkübatörde 72-96 saat kuluçkaya yatırın. Mümkün olduğunda transfeksiyon plakalarını günde bir kez hafifçe sallayın.
   14. Transfeksiyon sonrası 72-96 saatte transktaklı hücrelerde belirgin olan enfeksiyon belirtilerini (SOI) arayın (Şekil 2). Transfected hücrelerin virüsü üretmeye başlayacağını ve kültürü daha da enfekte edeceğini unutmayın; bu nedenle, enfeksiyon belirtilerini arayın.
       NOT: Enfeksiyon belirtileri, hücre çapında% 25-50 artış, genişlemiş hücre çekirdeği, düzgün yuvarlatılmış şekil, çoğalma kaybı ve kültür çanağı yüzeyine yapışma gibi böcek hücrelerindeki yapısal değişiklikler ve hücre canlılığında azalmadır (Şekil 2. Baculovirus Enfekte ve enfekte olmayan Sf9 hücreleri).

3. Küçük ölçekli protein ekspresyon taraması ve virüs amplifikasyonu

1. P1 baculovirüs stokları ile Sf9 hücrelerinin enfeksiyonu.
   NOT: Transfeksiyondan 4-5 gün sonra, ters mikroskop altında kontrol (transtransktuz) hücrelere kıyasla transkromfected hücrelerde enfeksiyon belirtileri belirgin olmalıdır. Hücre kültürü ortamına salgılanan ilk rekombinant baculovirüsler toplanmaya hazır olmalıdır.
   1. Tohum 2 x 10⁵ serumsuz böcek medyasında katlanarak büyüyen Sf9 hücreleri, virüs hacmini yükseltmek için P1 virüsleri ile enfeksiyon için toplam 2 mL hacimde 24 kuyu plakalarının her kuyusuna (P2 virüslerinin üretilmesiyle sonuçlanır).
   2. Hücreleri plakalara pipetledikten sonra, eşit bir monolayer sağlamak için ileri geri hareket ederek plakaları hafifçe sallayın. Plakaları döndürmeyin, çünkü hücreler kuyunun ortasına kümelenir.
   3. Plakaya hücresel yapışmaya izin vermek için plakaları 27 °C'de en az 1 saat kuluçkaya bırakın.
   4. Protein ekspresyon taraması için P1 virüslerini enfekte etmek için 24 kuyu bloğunun her kuyusuna böcek serumsuz ortamda^3,5-4 x 10 6 yoğunlukta 4 mL Sf9 hücresi dağıtın.
      NOT: 24 kuyulu plakaların ve 24 kuyulu blokların bir kuyusunun bir kuyuyu kontrol olarak etiketlenin ve SOI ararken enfekte ve enfekte olmayan hücrelerin karşılaştırılması için enfekte olmayan bir kontrol olarak kullanın.
   5. P1 virüslerinin aynı anda toplanmasına (adım 2.1.13), taze tohumlanmış Sf9 hücrelerinin enfeksiyonuna (adım 3.1.1) ve 24 kuyulu bloklardaki süspansiyon hücrelerinin enfeksiyonuna (adım 3.1.4) 150 μL P1 virüsü ile izin vermek için programlanabilir bir elektronik çok kanallı kullanın.
   6. Toplanan P1 viral stoklarının geri kalanını 17.970 x g'da15 dakika boyunca aşağı çevirin, mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de karanlıkta saklayın.
   7. Eklenen P1 virüslerinin hücre monolayer üzerinde eşit bir dağılımını sağlamak için 24 kuyu plakalarını (adım 3.1.1) karşılıklı bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayın; kuluçka süresi boyunca bunu birkaç kez tekrarlayın.
   8. 24 kuyulu blokları enfekte Sf9 hücrelerinin süspansiyon kültürüyle (adım 3.1.4) bir airpore levha ile örtün.
   9. 24 kuyulu blokları 27 °C'de kuluçkaya yaslanın, 72-96 saat boyunca 245 rpm'de sallanın.
   10. P2 virüslü 24 kuyulu plakalarda (adım 3.1.1) ve ifade taraması için enfekte hücrelere sahip 24 kuyulu bloklarda (adım 3.1.4) enfeksiyon süresinden sonra 72-96 saat içinde SOI arayın.
       NOT: Sf9 hücrelerinin P1 virüsleri ile enfeksiyonundan 4-5 gün sonra, soi ters mikroskop altında enfekte olmayan kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında enfekte hücrelerde belirgin olmalıdır.
   11. P2 virüslerini 24 kuyu plakalarından toplayın, 17.970 x g'da15 dakika santrifüj, mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C'de karanlıkta saklayın.
   12. Enfeksiyon sonrası 72-96 saat, % 70 etanol ile 24 kuyu blokları üzerine püskürtün, laminer akış başlığına getirin ve Trypan Blue boyama ile birkaç kuyudaki hücre yoğunluğunu ve canlılığını kontrol edin.
   13. Hücrelerde enfeksiyon belirtileri varsa ve canlılık Trypan Blue boyama ile değerlendirildiği gibi% 70-75'e yakınsa protein saflaştırmaya devam edin.
   14. 24 kuyulu blokları 15 dakika boyunca 4 °C'de 525 x g'da santrifüj ederek hücreleri peletin. Süpernatantı atın ve peletleri 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, % 0.6 NP-40'dan oluşan 1 mL lizis tamponunda iyice yeniden askıya alın, 2 mM imidazol, %5 gliserol (v/v) ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli (100x proteaz inhibitörü kokteyli aprotinin 0.25 mg/mL, leupeptin 0.25 mg/mL, pepstatin A 0.25 mg/mL;. E-64 0.25 mg/mL).
   15. Sonraki test saflaştırması için hücre süspansiyonu -80 °C'de saklayın (bkz. 3.2.2).
2. 24 kuyu test-ekspresyon bloklarında donmuş hücre süspansiyonundan protein saflaştırma.
   1. Bağlama bloğunun montajı (Şekil 3).
      1. 96 derin kuyu bloğunun üstüne 3 çakışan parafilm katmanı yerleştirin (96 derin kuyu 2,4 mL).
      2. 96 derinliğindeki kuyu bloğunun üstüne 96 kuyu plakası (filtre mikro plakası, 96 kuyu, 25 μm ultra yüksek moleküler ağırlıklı polietilen membranlı polipropilen) yerleştirin.
      3. 96 kuyu derinliğindeki bloktan filtre plakasını kapatmak için uçları parafilme sabitlemek için filtre plakasını aşağı itin.
      4. Filtre plakasının her kuyusuna 50 μL önceden dengelenmiş %50 Ni-NTA reçine bulamacı aktarın.
   2. Test ifade yordamı
      1. 24 kuyu bloğunda bulunan donmuş hücre süspansiyonu (adım 3.1.15) 5-10 dakika boyunca RT'deki bir su banyosuna yerleştirin, ardından 20 dakika boyunca 450 rpm'de sallayın.
      2. 24 kuyulu blokları 3.275 x g'da 15 dakika santrifüj edin.
      3. Çok kanallı pipet kullanarak, temizlenmiş lysates'i önceden dengelenmiş % 50 Ni-NTA reçine bulamacı (adım 3.2.1.4) içeren bir filtre plakasına aktarın ve filtre plakasını 96 kuyulu bir kapak paspası (96 kuyulu kapak paspası, kare kuyu ile kullanım için, 2 mL) ile kapatın.
         NOT: Kuluçka ve santrifüjleme adımları sırasında bağlama bloğunu bir arada tutmak için birkaç lastik bant kullanın.
      4. Ni-NTA reçinesi ile temizlenmiş lisatları kuluçkaya yatırmak için güvenli bağlama bloğunu 45-60 dakika boyunca soğuk bir odada bir rotatora yerleştirin.
      5. Kuluçkadan sonra, filtre plakasını dikkatlice kaldırın ve parafilm tabakasını 96 derinliğindeki kuyu bloğunun yüzeyinden çıkarın (adım 3.2.1.1).
      6. Filtre plakasını 96 derinliğindeki kuyu bloğunun üzerine geri yerleştirin ve güvenli bağlama bloğunu 235 x g'da 2 dakika döndürün.
      7. 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, %5 gliserol ve 15 mM imidazolden oluşan 2 mL yıkama tamponu ile Ni-NTA reçine 2x yıkama bağı.
      8. Kalan sıvının tamamen çıkarılmasını sağlamak için 235 x g'da 5 dakika boyunca her seferinde yıkama tamponu ile bloğu aşağı çevirin.
      9. Filtre plakasını 10 μL 4x yükleme boyası içeren 96 kuyulu PCR plakasının üstüne aktarın.
      10. Filtre plakasının her kuyusuna 40 μL elüsyon tamponu (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, %5 gliserol, 500 mM imidazol) ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın.
      11. Proteinleri 10 dakika boyunca 235 x g'da 96 kuyulu PCR plakasına elute etmek için bloğu aşağı çevirin.
      12. 96 kuyulu PCR plakasını yüksek sıcaklığa dayanıklı musluk pedi ile kapatın ve 98 °C'de 3 dakika ısıtın.
      13. Protein merdiveninin yanındaki %4-20 SDS-PAGE jel üzerine standart Laemmli tamponunda 15 μL eluted protein numunesi yükleyin ve jeli SDS içeren standart çalışan tamponla çalıştırın.
      14. Jeli Coomassie mavisi ile lekelenin ve su ile lekeyi çözün. Büyük ölçekli üretim için en iyi ifade yapılarını tanımlamak için test ifadesinin sonuçlarını analiz edin.

4. Baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin (SCBIIC) protein üretimi için preparatları

1. Planlanan üretim süresinden 4 gün önce, katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerini 2 x 10⁶ hücre/mL'lik son hücre yoğunluğuna 125 mL / 250 mL / 500 mL'ye bölün %1 (v/v) son antibiyotik-antimycotic içeren 50 mL / 100 mL / 200 mL Böcek Serumsuz ortamda şaşkınlık ile Erlenmeyer cam sallama şişeleri.
2. Uygun P2 virüslerinin 0.150 mL / 0.300 mL / 0.6 mL'lik kısmını ekleyin, enfekte olmuş hücreleri bir inç strokla yörüngesel bir çalkalayıcıda 165 rpm'de ve hücre bölünmesini yavaşlatmak için 25 °C daha düşük bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın.
3. Enfeksiyon sonrası 4 gün içinde, soi için mikroskop altında hücreleri kontrol edin ve Trypan Blue lekesi ile doğrulanan hücre canlılığı% 70-75'e yakınsa üretime geçin.

5. Büyük ölçekli protein üretimi için Sf9 hücre preparatları

1. Planlanan üretim süresinden 4 gün önce, büyük ölçekli protein üretimi için gerekli Sf9 hücrelerinin hacmini hesaplayın.
2. Böcek Serumsuz Ortamda katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerinin 2 L'si, 2,8 L Fernbach sallama şişelerinde 1 x 10⁶ hücre /mL hücre yoğunluğuna.
3. 27 °C'de şişeleri 150 rpm'de sallanarak kuluçkaya yasla.
   NOT: Sf9 hücre kültüründe bakteriyel kontaminasyonu önlemek için gentamisin kullanarak sırasıyla 10 μg/mL veya penisilin/streptomisin ile 50 U/mL ve 50 μg/mL'lik son konsantrasyonda kullanın.

6. Büyük ölçekli protein üretimi için Sf9 hücrelerinin SCBIIS ile enfeksiyonu

1. Böcek Serumu Içermeyen Ortamda katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerinin 2,5 L Tunair sallama şişelerinde veya 5 L reaktif şişelerde 4 x^{10 6} hücre/mL'lik son hücre yoğunluğuna bölün.
2. Baculovirüs ile enfekte böcek hücresi (SCBIIC) süspansiyon kültürünün 10-12 mL / L'sini ekleyin.
3. Sf9 hücrelerinin enfekte kültürünü 72-96 saat boyunca 25 °C'nin daha düşük sıcaklığında (hücre bölünmesini yavaşlatmak için) 145 rpm'lik bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
4. Enfeksiyon sonrası 72 saatte, mikroskop altında soi için hücreleri kontrol edin ve hücre canlılığını değerlendirin.
5. Genellikle, enfeksiyon sonrası yaklaşık 72 saat sonra, Sf9 hücrelerinin canlılığı% 70-75'e düşer (Trypan Blue lekesi kullanılarak ölçülür). Hasat, 1 L polipropilen şişedeki Sf9 hücrelerini 4 °C'de 15 dakika boyunca 900 x g'da santrifüjleme ile hasat edin.
6. Üretim hücresi kültürünün 1 L'sinden toplanan hücre peletini 20-25 mL 1x PBS ile hafifçe döndürerek yeniden biriktirin ve 50 mL konik tüplere aktarın.
7. Hücre süspansiyonu 900 x g'da 15 dakika boyunca aşağı çevirin ve PBS çözeltisini atın.
8. Yıkanmış hücre peletini süspansiyon tamponunun 20-25 mL'si (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, % 5 gliserol, 1x proteaz inhibitörü kokteyli) ve sıvı nitrojende flaş dondurma ile yeniden biriktirin; saflaştırmaya kadar −80 °C'de saklayın.
   NOT: PRMT'ler için saflaştırma prosedürleri SGC yayınlanan⁶makalesinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Sonuçlar

BEVS protokolüne genel bir bakış Şekil 1'de özetlenmiştir. Yapısal Genomik Konsorsiyumu'nda (SGC, Toronto) nispeten yüksek ifade düzeyi^7,9olan çözünür ve stabil proteinleri tanımlamak için başarı oranını artırmaya yönelik şirket içi stratejilere göre, tam uzunlukta, etki alanları ve kesilmiş parçalar da dahil olmak üzere PRMT'lerin birden fazla ifade yapısı oluşturulmuştır. İlgilenen okuyucular, SGC'nin bir ifade klonuna dahil edilen gen dizisinin segmenti olarak bir "parça", PFAM açıklamalı yapısal etki alanı olarak "etki alanı" ve bir ifade vektöründe klonlanmış parça olarak "oluşturma" olarak bir "parça" tasarlama tanımlarını ve metodolojisini gözden geçirmeye teşvik edilir, bunların hepsi daha önceki bir yayında ayrıntılı olarak^{açıklanmıştır 7}. Bu protokolde sunulan PRMT'lerin ifade yapıları, pFastBac1 vektörün bir türevi olan pFBOH-MHL vektörüne klonlanmış poliistidin etiketli proteinlerin üretimi içindir. Şekil 4'te,Sf9 hücrelerinde 4 mL üretimden sonra toplanan peletlerden arındırılmış PRMT1, 2, 4-9'un Etiketli çözünür yapılarının SDS-PAGE analizini sunuyoruz (adım 3.1.4). Tam uzunlukta (FL) PRMT1 ve PRMT9 bu jelde sunulmaz, çünkü FL PRMT1 E. coli'den üretilmiştir ve BEVS'ten üretilen FL PRMT9 Flag-tag⁶ile saflaştırılmıştır. PRMT1, FL PRMT4 ve tüm PRMT8 yapılarının kesilmiş yapıları nispeten yüksek bir verim gösterir, ancak protein elüatları birlikte saflaştırılmış kirleticilerin fraksiyonlarını içerir. Bu yapılar, saflaştırma protokollerinin daha fazla optimizasyonunu gerektirir. Bu nedenle, bu proteinlerin ölçek büyütme üretimlerinden saflığını artırmak için, inkübasyon aşamasında nikel boncuk miktarının netleştirilmiş bir lisatla azaltılması gibi ek yaklaşımlar gereklidir; yıkama tamponlarındaki iimidazol konsantrasyonlarının artması; TEV proteaz ile His-tag'in bölünmesi, ardından Ni-benzeşim reçinesi üzerine uygulama; ve boyut dışlama ve iyon değişimi kromatografisi gibi ek saflaştırma adımları. PRMT2 yapıları, güçlü bir kirletici bant eşliğinde diğer proteinlere ve tam uzunlukta PRMT2 proteinine kıyasla önemli ölçüde daha düşük verim göstermektedir. Ölçek büyütme üretimi ve IMAC ve boyut dışlama gibi iki saflaştırma adımı, FL proteini için birlikte arındırıcı kirleticinin kalıcı varlığı ile birlikte bu yapı için düşük bir ifade seviyesini doğruladı. Zorunlu bağlama ortağı MEP50 ile üretilen ve saflaştırılmış PRMT5 kompleksi için saf proteinler elde edilmiştir. PRMT9'un kesilmiş yapısı, diğer PRMT'lere kıyasla 1,5 mg/ L'ye yakın neredeyse iki veya üç kat daha düşük ifade seviyesine sahiptir. Bununla birlikte, bu yapının rekombinant viral stokları ölçek büyütme üretimi için kullanılmış, kristalleri dağıtma elde edilmiş ve yapı PRMT4, 6 ve 7 ile birlikte bu protein için çözülmüştür (Şekil 5).

Ölçek büyütme üretimleri için, karşılık gelen P2 virüsleri Sf9 böcek hücrelerinin süspansiyon kültürünü enfekte etmek için kullanıldı. Bu adım, süpernatanttaki enfekte hücreleri ve P3 virüslerini içeren baculovirüs ile enfekte olmuş hücrelerin 50/100/200 mL'sini oluşturur. Büyük ölçekli protein üretimi için, 150 rpm, 27 °C'de 2,8 L Fernbach sallama şişelerinin her birinde 2 L Sf9 hücresi kültürlendi (Şekil 6). Üretim gününde, 2 L Sf9 hücresi (hücre canlılığı >% 97) 2,5 L Tunair sallama şişelerinde veya 5 L reaktif şişelerde 4 L'de 4 x 10⁶/mL hücre yoğunluğuna seyreltildi. Bu hücrelere doğrudan baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin süspansiyon kültürünün 10-12 mL / L'si ile enfekte edildi ve 145 rpm'de 25 ° C'lik daha düşük bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırıldı. Üretim grubunun doğrudan baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin süspansiyon kültürü ile enfeksiyonu, enfekte hücrelerin ekstra kullanımı hariç olmak üzere virüs hacmi amplifikasyonunda zahmetli ve zaman alıcı adımları önemli ölçüde azalttı ve titer ve virüs bozulmasında azalmayı önledi. SF9 hücre kültürü bakımı ve ölçek büyütme üretimi, tek parti halinde büyük ölçekli bir protein üretimini benimsemek için yüksek dolum hacmine sahip kültür gemilerinde yapılmıştır (Şekil 6).

Baculovirus aracılı üretim platformundan üretilen tam uzunlukta PRMT 4, 5 (MEP50 ile karmaşık), 6, 7 ve 9 protein, SGC^6'dakinetik karakterizasyon ve inhibitör bileşik taraması için kullanılmıştır. Kristal yapılar, çeşitli kimyasal problar ve inhibitörlerle PRMT 4, 6, 7 ve 9 proteinlerinin tam uzunlukta veya kesilmiş formları için Protein Veri Bankası'na (PDB) çözüldü ve biriktirildi. Bu PRMT'ler için ifade plazmidleri Addgene plazmid deposuna yatırıldı (Addgene, SGC'nin dağıtım ortağıdır, https://www.addgene.org/) ve araştırma topluluğunun kullanımına açıktır (Şekil 5).

Şekil 1: Baculovirüs ekspresyon sürecinin adımlarına şematik genel bakış Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Baculovirus Enfekte ve enfekte olmayan Sf9 hücreleri. Enfeksiyon belirtileri, hücre çapında% 25-50 artış, genişlemiş hücre çekirdeği, düzgün bir şekilde yuvarlanmış şekil, çoğalma kaybı ve kültür çanağı yüzeyine yapışma ve hücre canlılığında azalma gibi böcek hücrelerindeki yapısal değişikliklerdir. Beyaz ölçek çubuğu 200 μm. Burada sunulan enfeksiyon belirtileri, hem transfeksiyon reaktifleri, Hem JetPrime hem de X-tremeGene 9 kullanılarak transfeksiyon hücreleri için aynıdır. Gösterilen özel örnek JetPrime transfection reaktifi içindir. (A) Kontrol olarak enfekte olmayan Sf9 hücreleri. (B) Baculovirüs ile enfekte Sf9 hücreleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Test ekspresyon proteinlerinin hızlı saflaştırılması için bağlayıcı plaka montajı. Ayrıntılar için lütfen metne bakın, adımlar 3.2.1-2 Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Protein ekspresyon tarama sonuçları. Farklı PRMT'ler ve PRMT5-MEP50 kompleksi için karşılık gelen P1 rekombinant virüsleri ile enfekte Sf9 süspansiyon kültürünün 4 mL'sinde baculovirüs aracılı protein üretiminin protein ekspresyon tarama sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Toronto Yapısal Genomik Konsorsiyumu'nda (SGC) kristal yapı çalışmaları için kullanılan PRMT4, 6, 7 ve 9 için ifade yapılarının özeti. Kristal yapılar, çeşitli kimyasal problar ve inhibitörler ile PRMT 4, 6, 7 ve 9 proteinlerinin tam uzunluğu veya kesilmiş formları için Protein Veri Bankası'na (PDB) çözüldü ve biriktirildi. Bu PRMT'ler için ifade plazmidleri Addgene plazmid deposuna yatırıldı ve araştırma topluluğu tarafından kullanılabilir (Addgene, SGC'nin dağıtım ortağıdır, https://www.addgene.org/). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Farklı kültür damarlarında Sf9 böcek hücresi bakımı ve protein üretimi: (A) Hücre bakımı ve protein üretimi için 2,8 L Fernbach şişesi. %72'lik dolum hacminin kullanımı, bir sallama platformunda aktarım hızını 2,5 kat artırır. (B) Tunair sallama şişeleri (bu resimde 10 şişeden sadece 9 şişe sunulmaktadır) ve % 80 dolum hacmine sahip reaktif şişeler, sallama platformunun üretim kapasitesini büyük ölçüde arttırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Bevs'in böcek hücrelerindeki avantajlarından biri, fosforilasyon, miristosilasyon ve glikosilasyon gibi daha karmaşık modifikasyonları sağlamak için çeviri sonrası modifikasyon makinelerinin yeteneğine odaklanmaktadır. Memeli proteinlerinin yüksek verimli katlama ile birlikte, bu değişiklikler fizyolojik olarak ilgili aşağı akış deneyleri için uygun yüksek miktarda modifiye edilmiş ve katlanmış proteini kolaylaştırır¹⁶.

Burada, BACULOVIRUS ekspresyon platformunda BIRDEN fazla PRMT proteini ve büyük ölçekli PRMT protein üretiminin başarılı bir şekilde ifade taranması için kritik unsurları vurgulayan BEVS'in ayrıntılı protokollerini açıkladık: 1) Biyolojik malzemeleri 24 ila 96 arasında aktarmak için düzenli, ayarlanabilir ve programlanabilir çok kanallı pipetlerin kullanılması - bakteri DNA'sı ve virüs üretimi aşamalarında iyi hücre kültürü plakaları ve blokları; rekombinant virüslerin toplanması, rekombinant virüslerin viral hacimlerinin amplifikasyonu ve protein ekspresyon tarama bloklarının hazırlanması. 2) Rekombinant virüslerin üretimi için yüksek performanslı ve uygun maliyetli transfeksiyon reaktifleri. 3) Büyük ölçekli protein üretimi için baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin (SCBIIC) süspansiyon kültürü. 4) Sf9 süspansiyon kültürünü korumak için yüksek dolgu hacmi 2.8 L Fernbach sallama şişelerinin ve büyük ölçekli protein üretimi için 2.5 L Tunair sallama şişelerinin ve 5 L reaktif şişelerinin kullanımı.

Dönüşüm ve transfection adımları için özel hususlar ve gerekçeler.
Ticari bir protokol bir dönüşüm için 100 μL yetkin hücre kullanılmasını önerse de¹⁴, ticari DH10Bac E. coli yetkin hücrelerinin dönüşüm verimliliği 1 x 10⁸ cfu / μg DNA kadar yüksektir, bu nedenle sadece 4 μL kullanırız. Bu, her dönüştürücünün bacmid DNA izolasyonu için izole edilmiş beyaz rekombinant koloniler elde etmesi için yeterlidir. 24 kuyu transfeksiyon plakasındaki yapışan Sf9 hücreleri, Serumsuz Böcek Ortamı'nın 0,5^{mL'sinde 2} x 10 5 /mL hücre yoğunluğunda tohumlandı. Bu hacim, kuyunun çalışma yüzeyinin eşit olarak kapsamasını sağlamak için yeterlidir. Aynı zamanda, transfeksiyon karışımını çok fazla seyreltmez, bu da transfeksiyon verimliliğini arttırır. Transfeksiyon reaktifleri Sf9 hücreleri için toksik değildir ve ortam değişimi gerekli değildir. Medya değişikliği yerine, hücre büyümesini kolaylaştırmak için transfeksiyon plakasına 4-5 saat sonra %10 (v/v) FBS içeren ek 1,5 mL ortam eklenir. Her iki transfeksiyon reaktifinin transfeksiyon verimliliği yüksektir. Yine de, X-tremeGene 9 ile, transfected hücrelerde enfeksiyon belirtileri (Şekil 2) JetPrime reaktifinden 10-12 saat daha erken görünür, bu nedenle protokollerdeki sonraki adımların çalışma programına bağlı olarak bu reaktifler arasında seçim yapıyoruz, bu da genel süreçte biraz esneklik sağlıyor.

Transfeksiyon plakasından toplanan ve P1 olarak etiketlenen ilk rekombinant virüslerin miktarı protein ekspresyon taraması için kullanılacak sınırlayıcı bir faktörse, protein testi ekspresyon taraması P2 virüsleri ile ayarlanabilir.

Küçük kültür hacimlerinden büyük kültür hacimlerine geçerken dikkat edilmesi gereken noktalar.
Tarihsel olarak, optimal hücre büyümesinin Sf9 hücre bakımı ve ölçek büyütme üretimlerinin süspansiyon kültüründe yüksek bir hava alanı gerektirdiğine inanılmıştır. Bununla birlikte, 2014 yılında, kültür gemilerindeki yüksek hava alanının daha önce düşünülenden daha az kritik olduğu bildirildi¹⁷. Sallama platformunun yörünge atışına uygun şekilde ayarlanmış sallama hızı kullanılarak kurulan bir kültür gemisi, küçük hava kabarcıkları oluşturarak ve daha uzun süre koruyarak yüksek dolgu hacimli süspansiyon kültüründe bile yeterli oksijen transferi sağlayacaktır. Bu yaklaşımla, ticari olarak mevcut böcek hücreleri, yüksek hücre canlılığından ödün vermeden hücrelerin iki katına çıkması süresinin normal bir aralığında daha yüksek bir sallama hızında kültürlenebilir.

Böylece 6 yıl önce hücre bakımı sırasında sallanan bir şişede süspansiyon kültürü hacmini artırmaya başladık ve sallama koşullarını ayarlayıp izlerken protein üretimi için farklı bir kültür damarı türü tanıttık (Şekil 6). Bu kültür damarlarında en uygun koşulları sağlamak için, hücre canlılığı, boyutu ve şekli, toplama durumu ve hücrelerin enfekte edilebilirliği ile birlikte hücrenin iki katına çıkması gibi Sf9 hücre kültürü parametrelerini izledik.

Örneğin, Sf9 hücre bakımı için, 2.8 L Fernbach sallama şişelerinde, 27 ° C'de 150 rpm'de sallanan Sf9 süspansiyon hücrelerinin 0.8 L yerine 2 L'yi kültürlüyoruz ve hücre canlılığı çoğu zaman% 99'a yakındır, eşit şekilli sağlıklı bölme hücreleri ile. Ölçek büyütme üretimi için, 25 °C'lik daha düşük bir sıcaklıkta 145 rpm olarak yüksek hızda sallanan 5 L reaktif şişelerde 4 L hücre enfekte ediyoruz. Dahili sallama platformuna sahip en yaygın kullanılan inkübatörler 6 x 2,8 L sallama şişeleri veya 6 x 5 L reaktif şişeleri veya 10 x 2,5 L Tunair sallama şişelerini tutabilir. Bu nedenle, fernbach sallama şişelerini ve reaktif şişelerini damarların yüksek dolum hacmine karşı 1/3'e doldurursak, bir sallama platformunun kapasitesi 4,8 L'ye karşı 12 L'dir ve 2,8 L Fernbach sallama şişeleri ve 5 L reaktif şişeler kullanarak 10 L'ye karşı 24 L'dir (Şekil 6). Süspansiyon hücre kültürü bakımı ve yüksek dolum hacmine sahip kültür gemilerinde ölçek büyütme üretimi, üretim hacimlerindeki sınırlamaların üstesinden gelmemize ve büyük ölçekli bir platform benimsememize yardımcı oldu. Bu nedenle, bu, biyoreaktörlere erişimi olmayan ve/veya üretim boru hatlarında sınırlı alana sahip laboratuvarlar için son derece yararlıdır.

Bu protokol, uygun reçineler kullanılarak ve SGC tarafından yayınlanan PRMT4, 7, 9 ve His etiketli PRMT5-MEP50 kompleksi ve PRMT6'nın Bayrak etiketli tam uzunluktaki proteinleri için^6. PRMT protein ailesi için bir BEVS protokolü tarif etsek de, aynı yaklaşım başka herhangi bir protein ailesine de uygulanabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.8L Nalgene  Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,	Nalgene	29171-854	For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells
24-Well Blocks RB	Qiagen	19583	For incubation of  4ml of suspension  Sf9 cells  for protein  expression screening
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul	Biorad	5671095	For SDS-PAGe analysis of the purified proteins
50ml Reagent Reservoir	Celltreat Scientific Products	229290	Reservoir used for diluted transfection reagent  and Sf9 cells suspension
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL	Greiner Bio-One	381080	Used to cover 96 well block
96 well PCR plate	Eppendorf	30129300
Bacto agar	BD	214010	For LB-agar selection paltes
Airpore Tape Sheets	Qiagen	19571	To cover 24 well blocks for protein expression screening
Allega X-15R Centrifuge	Beckman Coulter	392932
Antibiotic Antimycotic (100x)	Gibco	15240112
Bacmid DNA	in-house	non-catalog item	Bacmid DNA for baculovirus production
Bluo-Gal, 1g	Thermo Fisher	15519028
Beckman JLA 8.1000
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile	Eppendorf	30722116	Tissue  culture treated plate
Cell Resuspension Solution 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCRS500	For Bacmid DNA extraction
Cell Lysis Solution 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCLS500	For Bacmid DNA extraction
CELLSTAR  Tissue Culture Plates, 96 well	Greiner Bio-One	655180	For transfection mix
ClipTip 1250, filter reload, sterile	ThermoFisher Scientific	94420818	Tips for  programmable and adjustable multichannel pipette
dNTP Mix (25 mM each)	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip  Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672090BT	Programmable and adjustable multichannel pipette
E4  XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL	Ranin	LTS EA6-300XLS	Ranin adjustable multichannel pipette
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane	Agilent	201005-100	For protein purification in expression screening
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L	IBI Scientific	SS-6003C	For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells
Gentamicin 10x10ml	BioShop	15750078
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Wisent Biocenter	080-450
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L	Wisent Biocenter	301-045-LL	Serum free insect cells growth medium
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain	Expedeon Protein Solutions	ISB1L-1L	For protein gel (SDS-PAGE) staining
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%	BioShop	IPT001.100
JetPRIME Transfection Reagent  Provided with  jetPRIME buffer	POLYPLUS TRANSFECTION Inc	114-01	For Sf9 cells transfection to generate baculovirus
Kanamycin Monosulfate	BioShop	KAN201.100
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&	Sigma	L3022-1KG
Masterblock 96 deep well 2.4mL	Greiner Bio-One	780285-FD	Used in the transformation and expression screening procedures
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml	Thermo Fisher	10361012	Competent cells for bacmid DNA generation
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 - 300 uL	Sartorius	Sartorius 725240	12 channel pipette
Neutralization Solution, 0.5 L	Millipore Sigma	LSKNS0500	For bacmid DNA extraction
New Brunswick  Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)	Eppendorf	M1282-0004	Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30250	For protein purification
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	LS15140122
PYREX  Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  500ml	Pyrex	4444-500	For  suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  125ml	Pyrex	4444-125	For suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  250ml	Pyrex	4444-250	For suspension culture of Sf9 cells
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution	Froggabio	21141
RNase A, 0.9 mL	Millipore Sigma	LSKPMRN30	For suspension buffer for bacmid DNA extraction
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads	MP Biomedicals	115000550	For  spread  of bacterial  cells across the surface of an agar plate.
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips)	Ranin	30389253	Tips for ranin multichannel pipette
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian	cytivalifesciences	SH3039602	Addition to the serum free medim for  the transfected cells
Sf9 cells	Thermo Fisher	12659017	Insect cells
Sfx-Insect Cell Culture Media	Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)	SH3027802	Serum free insect cells growth medium
Tape Pad	Qiagen	19570	Tape Pad
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer - 2,000 units	New England Biolabs	M0267L
Tetracycline Hcl	BioShop	TET701.10
Trypan Blue 0.4% Solution	Gibco	15250061	For  assessment of cell viability
VITLAB  Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L	VITLAB	V100889	For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells
VWR  Digital Mini Incubator	VWR	10055-006	Incubator for adherent Sf9 cells
VWR  Incubating Microplate Shaker	VWR	97043-606	Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks
VWR Petri Dishes	VWR	CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Transfection Reagent  1.0 M	Roche	6365787001	For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus