CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Özet

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

Özet

Beyin aktivitesi, nöronlar arasında geçen elektrokimyasal sinyaller, nöronal ağların bağlantı kalıpları ve bu nöronlar içindeki süreçlerin ve alt yapıların morfolojisi tarafından belirlenir. Bu nedenle, beyin fonksiyonu hakkında bilinenlerin çoğu, nöronların beyinde nasıl organize olduğu ve bağlandığı hakkında daha fazla fikir veren görüntüleme teknolojilerindeki gelişmelerin yanı sıra ortaya çıkmıştır. Doku temizlemedeki gelişmeler, kalın beyin dilimlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesine, morfolojik rekonstrüksiyonun ve dendritik çardaklar ve dikenler gibi nöronal alt yapıların analiz edilmesine izin sağlamaktadır. Birlikte, görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, büyük görüntüleme veri kümelerini hızlı bir şekilde analiz etme yöntemleri sağlar. Bu çalışma, CLARITY doku temizleme, konfokal mikroskopi ve görüntü analizi kullanarak etiketli sinir dokusunun kalın dilimlerini yüksek çözünürlükte işlemek, görselleştirmek ve analiz etmek için nispeten hızlı bir yöntem sunar. Bu protokol, sağlıklı beyinleri karakterize eden bağlantı kalıplarını ve nöronal morfolojileri ve hastalıklı beyin durumlarında ortaya çıkan bu özelliklerdeki değişiklikleri anlama çabalarını kolaylaştıracaktır.

Giriş

Karmaşık üç boyutlu biyolojik yapıların mekansal organizasyonun, bağlantı kalıplarının ve morfolojisinin anlaşılması, belirli hücrelerin ve dokuların işlevlerini sınırlandırmak için gereklidir. Bu, özellikle merkezi sinir sisteminin yüksek çözünürlüklü nöroanatomik haritalarını oluşturmaya adanmış muazzam çabanın bulunduğu nörobilimde geçerlidir^1,2. Bu haritaları oluşturan nöronların yakından incelenmesi, bu çeşitli nöron setlerinin işlevini yansıtan bağlantılar ve konumlar ile çeşitli morfolojiler verir^3,4. Ayrıca, subselüler yapıların, özellikle dendritik dikenlerin araştırılması, sinapsların olgunluğunu bilgilendirebilir, böylece gelişimsel süreçleri ve nörolojik hastalık durumlarını yansıtabilir^5,6,7. Bu nedenle, görüntüleme çözünürlüğünü ve verimini artıran yaklaşımlar, beyin fonksiyonlarını her ölçekte daha iyi anlamak için gereklidir.

Son gelişmeler, nöron popülasyonlarını işaretlemek ve manipüle etmek için moleküler ve genetik araç setini genişletti. Yeni floresan belirteçlerin geliştirilmesi, bu belirteçleri nöronlara sokmanın yeni yöntemleriyle birlikte, aynı hayvan veya beyin örneği 8 ,⁹,^10,11içindeki etkileşime giren nöron popülasyonlarının diferansiyel etiketlenerek etiketlenerek. Işık opak lipitler tarafından dağıldığı için ve beyin dokusunun yüksek lipid içeriği göz önüne alındığında, görüntüleme nöronal popülasyonları öncelikle ince bölümlerle sınırlıdır veya derin yapıları görüntülemek için gelişmiş mikroskropsi tekniklerine (örneğin, konfokal, çoklu foton ve ışık tabakası mikroskopisi) güvenmiştir. Bununla birlikte, bu çabalar doku temizleme tekniklerindeki gelişmelerle büyük ölçüde desteklenmiştir. Berrak Lipid-exchanged Akrilamid-hibrid Sert Görüntüleme / immünostaining /yerinde melezleme uyumlu Doku-hYdrogel (CLARITY), ilgi çekici dokuların hidrojel monomerler (akrilamid ve bis-akrilamid) ile aşılanması ve daha sonra deterjanlarla yıkanması¹². Hidrojel monomerler, optik olarak şeffaf ve makromolekül etiketlere geçirgen kararlı bir 3D hidrojel iskele oluşturmak için melezleşir. Nükleik asitler ve proteinler melezleştirilmiş matris içinde tutulurken, lipitler deterjan yıkamaları ile çıkarılır (Şekil 1). Bu, hücrelerin ve lipid olmayan moleküllerin orijinal şeklini ve yönünü koruyacak kadar sert, optik olarak ise derin yapıları yüksek çözünürlükte kolayca görüntüleyece kadar optik olarak şeffaf olan kararlı bir doku ile sonuçlanır. Doku yapısının ve oryantasyonunun bu şekilde korunması, kalın dilimlerin görüntülenmesini sağlar, böylece hücreden hücreye bağlantıları ve mekansal ilişkileri korur. Ayrıca, temizleme işlemi sırasında proteinlerin ve nükleik asitlerin yeri ve mevcudiyeti korunduğu için, temizlenmiş dokular ekspresyon bazlı belirteçlerin yanı sıra eksojen etiketleri de tutabilir. Böylece CLARITY, büyük miktarda derin beyin yapılarını ve bu yapılar arasındaki bağlantıları yüksek çözünürlükte görüntülemek için güçlü bir yöntem olarak kendini ödünç verir.

CLARITY kullanımı, nöronal popülasyonları görüntüleme yaklaşımlarını büyük ölçüde geliştirir. Bu teknik özellikle büyük miktarda görüntüleme verisi oluşturmada ustadır. CLARITY, birden fazla protein bazlı floresan formuyla iyi çalışır. Bu protokol, EGFP ve tdTomato ile seyrek etiket hücrelerine lentiviral tabanlı bir yaklaşım kullanır; bununla birlikte, tdTomato veya EGFP'yi rekonstrüksiyon için hücreleri etiketlemek için ifade eden transgenik muhabir alelleri rutin olarak kullanılmıştır. Hem fotoğrafa kararlı hem de parlak bir florofor seçmek önemlidir (örneğin, EGFP veya tdTomato). Ayrıca, floroforu ifade etmek için güçlü bir promotör kullanmak üstün kontrast ve görüntü kalitesi verir. Bu tekniğin dezavantajları, bu büyük miktarda verinin düzgün bir şekilde analiz edilmesi hem emek hem de zaman yoğun olabileceği için ortaya çıkar. Özel mikroskoplar verimi artırmaya ve iş yükünü azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, gelişmiş mikroskopların inşası, sahibi ve/veya işletilmeleri birçok laboratuvar için genellikle maliyet-yasaklayıcıdır. Bu çalışma, standart konfokal mikroskopi ile birlikte büyük bölümlerin CLARITY doku temizlemesini kullanarak yüksek çözünürlükte büyük miktarlarda sinir dokusunu görselleştirmek için yüksek verim, nispeten hızlı ve basit bir yöntem sunar. Bu protokol bu yaklaşımı aşağıdaki adımlarla açıklar: 1) sinir dokusunun parçalanması ve hazırlanması, 2) dokunun temizlenmesi, 3) dokunun montajı, 4) hazırlanan dilimlerin görüntülenmesi ve 5) mikroskopi görselleştirme yazılımı rekonstrüksiyonu ve analizi kullanılarak tam dilim görüntülerin işlenmesi (Şekil 2). Bu çabalar, nöron popülasyonlarını, nöronal bağlantı modellerini, 3D dendritik morfolojiyi, dendritik omurga bolluğunu ve morfolojisini ve sağlam beyin dokusu içindeki moleküler ifade kalıplarını analiz etmek için kullanılabilecek yüksek çözünürlüklü görüntülerle sonuçlanır.

Protokol

Aşağıdaki protokol, Baylor Tıp Fakültesi için tüm hayvan bakım yönergelerini takip eder.

1. Diseksiyon ve doku hazırlama

1. Fareyi, izoflurane batırılmış bir havlu ile kapalı bir kaba yerleştirerek (veya diğer IUCAC onaylı yollarla) aşırı dozda izofluran ile ötenazi yaptırın.
2. Hayvanı transkardiyöz olarak 10 mL buz gibi PBS ile 25 G iğne kullanarak ve ardından% 4 PFA'nın 10 mL'sini geçirin.
3. İlgi çekici beyin bölgesini (veya dokuyu) parçalara ayrıştırın.
4. Parçalanmış dokuyu 4 °C'de bir gecede %4 PFA'ya yerleştirin. Uygun sabitleme bu protokol için anahtardır. Bu adımı atlamayın veya kısaltmayın.
5. En az 12 saat boyunca% 4 PFA'da sabitlemeden sonra, dokuyu 4 °C'de 24 saat boyunca% 4 akrilamid hidrojel karışımına aktarın.
   NOT: Hidrojel çözülürken, polimerize olmadığından emin olun, hidrojel çok ısınırsa bu olabilir. Erken polimerizasyonu önlemek için buzda çözün.

2. Doku temizleme

1. Beyin dokusunu (hala hidrojel batırılmış) -90 kPa vakum ile 37 °C'de 3 saat boyunca bir vakum inkübatörüne yerleştirin. Vakumun düzgün oluşmasını sağlamak için tüp üstünü sökülmüş olarak bırakın.
2. Pbs ile dokuyu oda sıcaklığında (25 °C) 10 dakika hafifçe sallayarak yıkayın.
3. Polimerize doku örneğini, dokunun oda içindeki yönünü not derek elektroforez odasına yerleştirin.
4. Hazneyi ve hazneyi birlikte verilen elektroforez SDS tamponu ile doldurun.
5. Örneği 70 V, 1 A ve 35 C'de, yaklaşık 2 saat/mm doku için sabit akımla çalıştırın.
   1. Örneği periyodik olarak kontrol edin; düzgün bir şekilde temizlemek için odada daha fazla zaman gerektirebilir. Temizleme için iyi bir başlangıç noktası, beyin dokusunun mm'si başına 1-2 saattir. Tüm fare beyni yeterli temizleme için 8-10 saat gerektirir. Numuneyi odadan çıkarmadan önce yönünü hatırlayın ve aynı yönde odaya geri değiştirdiğinizden emin olun.
      NOT: Şekil 3A, tamamen temizlenmiş bir beynin nasıl görüneceğini göstermektedir. Beyin, çözünmüş SDS varlığı nedeniyle bu aşamada opak görünecek ve net olmayacaktır, ancak lipid çekildikten sonra sarı doku renkli ton çok az olmalıdır.

3. Temizlenmiş dokunun hazırlanması ve montajı

1. Numune temizlemeyi bitirdikten ve yeterince net görünüyorsa, oda sıcaklığında bir gecede PBS'de yıkayın. PBS'i mümkün olduğunca sık taze PBS ile değiştirin. Bu adım, sonraki adımlarda çökelti oluşturabilen artık SDS'leri kaldırmak için kritik öneme sahiptir.
2. PBS'deki son yıkamadan sonra, dokuyu oda sıcaklığında deiyonize suda 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Doku bu adımda opak hale gelecek ve genişleyebilir.
3. Refraktif indeks eşleştirme çözeltislerindeki dokuyu (bkz. Tablo 1)oda sıcaklığında en az 4 saat kuluçkaya yatırın. Şekil 3B, kırma indeksi eşleştirme çözeltisinde inkübasyondan sonra temizlenmiş bir doku parçasını göstermektedir.
4. Refraktif indeks eşleştirme çözeltisinde dokunun inkübasyonu sırasında, gerekirse numuneyi görüntülemek için uygun bir muhafaza odası oluşturun.
5. Küçük doku örnekleri/dilimleri için görüntüleme odası oluşturma
   1. Montaj için bir taban olarak cam bir slayt kullanarak, kauçuk veya plastik ara parçaları döşeyin ve süper tutkalla sabitleyin. Önceden hazırlanmış aralayıcılar mevcut değilse, konik tüp kesitlerinden yapılmış plastik halkalar kullanın.
   2. Bu parçaları cam kaydırağa delik açmadan sabitlemeyi sağlayın (Şekil 3C).
   3. Temizlenen dokuyu kırılma indisi eşleştirme çözeltisi ile önceden doldurulmuş montaj odasına yerleştirin.
   4. Üzerine cam bir kapak kılıfı yerleştirip oje ile kapatarak dokuyu güvenli bir şekilde monte edin.
   5. Bu dokuyu, doğrudan camın üzerine bir damla kırma indeksi eşleştirme montaj çözeltisi ekleyerek görüntüleyin.
6. Büyük doku görüntüleme odası
   1. Doku 5 mm kalınlığındaysa (tüm beyinler veya yarımküreler için uygundur) bu odayı inşa eder.
   2. Yüksek duvarlı 10 cm'lik bir cam çanak kullanarak, konik çapının kullanılan objektif lensin namlusunu kabul edecek kadar büyük olduğundan emin olarak merkeze 50 mL konik bir tüp yerleştirin.
   3. Suda% 3 agarose yapın ve cam tabak ve konik tüp arasındaki boşluğa dökün, 1 saat soğumaya bırakın(Şekil 3D). Bu, katı agarose halkası oluşturacaktır (Şekil 3E).
   4. Dokuyu süper tutkal kullanarak odanın dibine güvenli bir şekilde yapıştırın ve odayı kırılma indeksi eşleştirme çözeltisi ile doldurun. Dokuyu, ilgi alanlarına zarar vermeden çanaktan geri ıslaha izin verecek şekilde görüntülenmeyecek bir bölgeye yapıştırmak için yapıştırıcı uygulayın.
      NOT: Bu hazırlık zamana duyarlıdır, çünkü kırılma indeksi ortamı havadan korunmadığı ve 4 °C'de depolanmadığı sürece polimerize olmaya başlayabilir.

4. Temizlenmiş doku örneklerini görüntüleme

1. Görüntüyü, 4 mm çalışma mesafesi ile 25x/0,95 NA hedefine uygun bir konfokal mikroskop kullanarak elde edin.
2. İlgili tüm görüntüleme ekipmanlarını açın. Numuneyi sahne alanına yerleştirin ve montaj odasının üstüne bir damla kırılma indisi eşleştirme çözeltisi yerleştirin.
3. Daldırma ortamına hedefle dikkatlice yaklaşın ve sürekli bir medya sütunu oluşturur.
4. Epifluoresansı kullanarak uygun bir görüntüleme alanı bulun.
5. Uygun ayarları test ederek görüntü alma yordamını başlatın.
   1. Şekil 4A'yı kılavuz olarak kullanarak çözünürlük ve tarama hızı ayarlarını ayarlayarak başlayın. Konfokal mikroskop kullanarak görüntüleme yapıyorsanız, en küçük optik bölümü ve dolayısıyla en iyi z çözünürlüğünü elde etmek için iğne deliğini tamamen kapatın.
   2. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip uygun bir görüntü elde edilene kadar lazer gücü/sensör kazancını kademeli olarak artırın.
   3. Standart EGFP/tdTomato iki renkli görüntüleme kullanıyorsanız, şekil 4B'yi kılavuz olarak kullanarak ışık toplama ayarlarını ayarlayın.
   4. Z-stack parametrelerini dokunun gözlemlenen başlangıç ve bitiş noktalarına göre ayarlayın. Kılavuz olarak Şekil 4C'i kullanarak adım boyutunu istediğiniz z çözünürlüğüne göre ayarlayın.
      NOT: Daha küçük adım boyutları daha fazla z çözünürlüğü sağlayacaktır, ancak aynı zamanda daha fazla lazer uzatma süresi sunarak potansiyel olarak örnek ağartmaya yol açacaktır.
   5. Görüntü alma ayarlarından memnun olduğunuzda, görüntüyü alın.
   6. Görüntünün yüksek sinyal-gürültü oranına sahip olduğundan ve yapıların farklı sınırlarını gösterdiğinden emin olun (Şekil 4D).

5. Mikroskopi analiz yazılımı kullanılarak görüntü işleme ve 3D niceleme

NOT: Mikroskobik görüntü analizi yazılım paketleri, üç boyutlu görüntü görselleştirme ve işleme için güçlü araçlardır. Bu programların çoğu, temizlenmiş doku örneklerinin görüntülenmesinden oluşturulan büyük veri kümelerinin işlenmesi için mükemmel bir şekilde uygundur. Aşağıdaki adımlar ve ilişkili rakamlar İmaris yazılım iş akışına karşılık gelir.

1. Görüntü yığınını açın ve seçili çözümleme yazılımına alın.
2. Görüntüyü üç boyutlu uzayda görüntüleyin ve görüntüyü daha iyi görselleştirmek için görüntü ayarlayıcısını kullanarak arama tablolarında istediğiniz değişiklikleri yapın.
   NOT: Şekil 5A, CLARITY doku temizleme ile eşleştirilmiş 2 fotonlu mikroskopi ile erişilebilen olası aşırı görüntüleme derinliğini göstermektedir. Şekil 5B, Şekil 5A'dasunulan z yığınından belirgin dendrit işlemlerinin yanı sıra açıkça görülebilen omurga morfolojilerini göstermektedir.
3. Tutarlı bir arka planı filtrelemek için Görüntü İşleme düğmesini tıklatın ve arka plan çıkarma filtresini seçin.
   NOT: Şekil 5C, işlemeden önce görüntüyü tutarlı bir puslu arka plan sinyaliyle gösterir. Şekil 5B, arka plan çıkarma filtresi uygulandıktan sonra görüntüyü gösterir.
4. 3D görüntüyü gözlemleyin ve birden fazla açıdan ve yakınlaştırma seviyelerinden bakarak aşina olun.
5. Önce Filament izleyici aracını seçerek dendrit izlemeyi başlatın.
6. Filamenti El İle Düzenle, Otomatik Oluşturmayı Atla 'yıtıklatın.
7. Modu otomatik yol olarak ayarlayın ve Otomatik ortalama ve Otomatik çap düzeltmelerini kontrol edin.
8. Shift + bir başlangıç noktası ayarlamak için hücre gövdesine sağ tıklayın.
9. Nöronun dendritin tüm uzunluğu boyunca izini sürün; yazılımın başlangıç ve bitiş noktaları arasındaki yolu otomatik olarak hesaplamasına izin vermek için sonlandırma noktasını ayarlamak için dendritin sonuna sol tıklayın.
10. Tüm dendritler için bu adımı yineleyin ve hücre yapısını tam olarak takip edin.
11. İzlenmiş hücreyi görselleştirin ve doğruluğunu onaylayın. Gerektiğinde manuel ayarlamalar yapın.
12. Oluşturma sekmesini seçin.
13. Dendrit Çapını Yeniden Kes seçeneğini belirleyin.
14. Daha doğru izlenen bir dendrit için sihirbazı izleyerek tamamlayın.
15. Çiz sekmesini seçin.
16. Omurga çizmeye başlamak için Omurga radyo düğmesine tıklayın.
17. Yaklaşık omurga çapını gerektiği gibi ayarlayın ve omurga çaplarının doğru bir şekilde temsilini elde etmek için ölçüm aracını kullanın.
18. Yeni bir omurga eklemek için omurga kafalarının ortasına tıklayın.
19. Dendrit üzerindeki tüm dikenler için bunu tekrarlayın.
    NOT: Dikenleri manuel olarak eklerken dendriti mümkün olan tüm açılardan gözlemlemek önemlidir.
20. Yeni eklenen dikenlerin doğruluğunu kontrol edin ve gerektiğinde değişiklikler yapın.
21. Oluşturma sekmesini seçin.
22. Yazılımın aşağı akış veri analizi için çok önemli olan uygun baş ve boyun çaplarını belirlemesine izin vermek için Omurga Çapını Yeniden Kapat seçeneğini belirleyin.
23. Tamamlanmak için omurga çapı oluşturma sihirbazını izleyin.
24. Hesaplamanın sonucuna uyun ve gerektiğinde manuel ayarlamalar yapın. Şekil 5E omurgalarla tamamlanmış tam izlenmiş bir nöron göstermektedir.
25. Omurgaların gizli bir listesini oluşturmak için Araçlar sekmesini seçin.
    NOT: Bunun çalışması için MATLAB uzantısının yüklenmesi gerekir.
    1. MATLAB uzantısını yüklemek için tercihler penceresini açın.
    2. Özel Araçlar seçeneğini belirleyin.
    3. Uygun MATLAB çalışma zamanı MCR'sını ekleyin.
26. Omurgaları Sınıflandır 'atıklayın.
27. Omurga sınıflandırması için istenen parametreleri düzenleyin.
28. MATLAB uzantısında Omurgaları Sınıflandır'a tıklayın. Şekil 5F, renk kodlu sınıflandırılmış dikenlerle kaplanan dendriti göstermektedir.
29. İstatistikler sekmesini seçin.
30. Bu sekmenin sol alt köşesindeki Yapılandır düğmesine tıklayarak verileri ölçmek için istediğiniz istatistikleri yapılandırın.
31. İstatistik gösterimi yöntemi seçildikten sonra, bu pencerenin sağ alt kısmında bulunan Sekme Ekranındaki İstatistikleri Dosyaya Aktar düğmesini kullanarak verileri dışarı aktar.
32. Tercih edilen bir grafik yöntemi kullanarak istatistikleri grafiklendirin.

Sonuçlar

Görüntü alındıktan sonra, temsili hücre morfolojisi gömülü istatistikler kullanılarak ve analiz yazılımı içindeki komut dosyalarını sınıflandırarak analiz edildi. Toplanan veriler (Şekil 6A) nöron 2'nin daha yüksek omurga yoğunluğuna sahip daha büyük bir dendritik yapıya sahip olduğunu yansıtmaktadır. Bir bütün olarak, veriler nöron 2'nin nöron 1'e kıyasla daha karmaşık bir dendritik yapıya sahip olduğunu göstermektedir. Bu sonucu doğrulamak için, n?...

Tartışmalar

Çağdaş doku temizleme tekniklerinin ortaya çıkmasından önce, nöronal morfolojinin incelenmesi zaman yoğun kesitleme, görüntüleme ve bitişik çok ince bölümlerin yeniden yapılandırılmasından oluşuyordu. Konfokal görüntüleme ile birlikte elektroforetik doku temizlemenin kullanılması, tam nöronal morfolojinin engelsiz bir görünümünü sağlar. Bozulmamış dendritik ağaçlardan, en küçük sinaptik bouton'a kadar, nöronal morfolojiyi görüntülemek ve ölçmek hiç bu kadar mümkün olmamı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339650
25 G x 1" Needle	BD	305127
30% Acrylamide (No-Bis)	National Diagnostics	EC-810
50 mL Conical Tube	Thermo Scientific	339653
Electrophoretic Tissue Clearing Solution	Logos	C13001
Histodenz	Sigma	D2158-100G
Hydrogel Solution Kit	Logos	C1310X
Imaris	Oxford Instruments	N/A
Paraformaldehyde 16%	EMS	15710
PBS, 1x, 500 mL, 6 bottles/case	fisher	MT21040CV
VA-044	Wako	925-41020
X-CLARITY Polymerization System	Logos	C20001
X-CLARITY Tissue Clearing System II	Logos	C30001