JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokolde, immünofluoresans bazlı bir yöntem kullanarak hücre döngüsünün S/G2 aşamasında DNA çift iplik ucu rezeksiyonunun nasıl görselleştirilerek görselleştirilmeyi gösteriyoruz.

Özet

DNA hasar yanıtının (DDR) incelenmesi, kanser tedavisi için DDR hedefli ilaçların kullanımı nedeniyle daha önemli hale gelen karmaşık ve temel bir alandır. Bu hedefler, çeşitli DNA onarım biçimlerini başlatan poli (ADP-riboz) polimerazlarıdır (PARP'lar). Parp inhibitörleri (PARPi) kullanarak bu enzimlerin inhibe edilmesi, meme kanseri tip 1 (BRCA1), BRCA2 veya BRCA2 (PALB2) ortağı ve lokalizatöründeki mutasyonlar nedeniyle homolog rekombinasyon (HR) eksikliği olan hücrelerde terapötik bir güvenlik açığı sağlayarak sentetik öldürücülüğe ulaşır.

PARPi ile tedavi edilen hücreler DNA çift iplikçik kopuları (DSB' ler) biriktirir. Bu kırılmalar DNA uç rezeksiyon makineleri tarafından işlenerek tek iplikli (ss) DNA oluşumuna ve daha sonra DNA onarımına yol açmaktadır. BRCA1 eksikliği olan bir bağlamda, 53BP1 ve DYNLL1 gibi DNA rezeksiyon inhibitörlerindeki mutasyonlar yoluyla DNA rezeksiyonunu canlandırmak PARPi direncine neden olur. Bu nedenle, selülodaki DNA rezeksiyonunun izlenebilmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve PARPi direncinin üstesinden gelmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. İmmünoresans (IF) tabanlı teknikler, DNA hasarından sonra küresel DNA rezeksiyonunun izlenmesini sağlar. Bu strateji 5-bromo-2′-deoksiyuridin (BrdU) ile uzun nabız genomik DNA etiketleme gerektirir. DNA hasarı ve DNA sonu rezeksiyonu sonrasında, ortaya çıkan tek iplikli DNA, özellikle yerel koşullar altında bir anti-BrdU antikoru tarafından tespit edilir. Ayrıca, DNA rezeksiyonu, hücre döngüsünün çeşitli aşamalarını ayırt etmek için hücre döngüsü belirteçleri kullanılarak da incelenebilir. S/G2 fazındaki hücreler İk içinde uç rezeksiyonunun incelenmesine izin verirken, G1 hücreleri homolog olmayan uç birleştirmeyi (NHEJ) incelemek için kullanılabilir. Bu IF yöntemi için hücre döngüsü ayrımcılığı ile birleştirilmiş ayrıntılı bir protokol bu makalede açıklanmıştır.

Giriş

DNA onarım faktörlerinin modülasyonu, özellikle DNA DSB onarım eksikliği olan tümör ortamlarında kanser tedavisi için sürekli gelişen bir yöntemdir. Spesifik onarım faktörlerinin inhibisyonu, kanser hücrelerini DNA'ya zarar veren ajanlara duyarlı hale getirmek için kullanılan ustaca stratejilerden biridir. Onlarca yıllık araştırma, DNA onarım genlerinin çeşitli mutasyonlarının terapötik strateji seçimleri için biyobelirteç olarak tanımlanmasına yol açtı1. Sonuç olarak, DNA onarım alanı, kişiselleştirilmiş tıp kavramını güçlendirerek çok çeşitli tedaviler sağlamak için ilaç geliştirme merkezi haline gelmiştir.

DSB'ler iki ana yol tarafından onarılır: NHEJ ve HR2. NHEJ yolu hataya eğilimlidir, iki DNA ucunu çok az veya hiç DNA son işleme ile hızlı bir şekilde bağlar ve protein kinaz (DNA-PKcs), Ku70/80 kompleksi, 53BP1 ve RIF1 proteinlerini içerir3. Buna karşılık, İk BRCA14 tarafından başlatılan sadık bir mekanizmadır. İk onarımında önemli bir adım, 3'-OH uçlu tek iplikli (ss) DNA'ya yol açan kırık uçların bozulması olan DNA sonu rezeksiyon işlemidir. BRCA1, 5' ila 3' DNA rezeksiyonunda yer alan rezektosome MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1'i oluşturan aşağı akış proteinlerinin işe alımını kolaylaştırır5.

İlk son rezeksiyon, MRE11'in endonücleaz aktivitesi ile gerçekleştirilir ve DNA2 ve EXO1 çekirdekleri tarafından daha fazla işlenmesine izin verir. Oluşturulan ssDNA çıkıntıları, daha fazla işlemden korumak için Çoğaltma ProteinI A (RPA) tarafından hızlı bir şekilde kaplanır. Daha sonra BRCA2, PALB2 ve BRCA1, RPA'nın yer değiştirmesine ve homolojiye yönelik onarım mekanizması için gerekli rad51 nükleofilamentinin montajına aracılık etmek için devreye girer. Genomik bütünlüğün en iyi şekilde sürdürülmesi için NHEJ ve İk kullanımı arasında ince bir denge gereklidir. Yol seçimi hücre döngüsü aşamasına bağlıdır. İk tercihen DNA rezeksiyonun en üst seviyede olduğu S-G2 aşamalarında kullanılır ve uygun onarımı sağlamak için kardeş kromatlar mevcuttur.

Poli (ADP-riboz) polimeraz 1 (PARP-1), DSB'ye alınan en erken proteinlerden biridir. Hem rezeksiyon aktivitesini hem de NHEJ5,6'da yer alan aşağı akış efektörlerinin montajını düzenler. PARP-1, çoğaltma sırasında DNA tek iplikli kesme onarımı için de gereklidir7,8. DNA onarımındaki önemli rolü nedeniyle KANSER TEDAVILerİ OLARAK PARP inhibitörleri (PARPi) kullanılmaktadır. Birkaç hr eksikliği kanserde, PARPi tedavisi, İk eksikliği olan hücrelerin alternatif bir yol ile biriken hasarı onarma yetersizliği nedeniyle sentetik ölümcül bir yanıta yol açar9,10. Şu anda dört FDA onaylı PARPi vardır: Olaparib, Rucaparib, Niriparib ve Talazoparib (BMN 673 olarak da adlandırılır), çeşitli meme ve yumurtalık kanseri tedavileri için kullanılmaktadır11. Bununla birlikte, PARPi direnci yaygındır ve İk yeterliliğinin geri alınarak potansiyel bir neden ortaya çıkar12. Işınlama disregülasyonu varlığında PARP-1'in kaybı veya inhibisyonu, rezekozom makinelerini kontrol eder ve daha uzun ssDNA yollarının birikmesine yol 13. Bu nedenle, in vivo DNA rezeksiyonunun derinlemesine incelenmesi, DNA onarım yollarının daha net anlaşılması ve daha sonra kanseri tedavi etmek ve PARPi direncini yenmek için yeni stratejilerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir.

DNA rezeksiyon olaylarını tespit etmek için çeşitli yöntemler 5. Bu yöntemlerden biri, stres kaynaklı DSB'den sonra resekte edilen DNA'nın anti-RPA antikoru kullanılarak dolaylı olarak lekelenmesine ve görselleştirilmesine izin eden klasik IF tabanlı tekniktir. Genomik DNA'nın 5-bromo-2′-deoksiyridin (BrdU) ile etiketlenmesi ve sadece ssDNA'nın tespitinin alınması DNA rezeksiyon olaylarının doğrudan ölçümüdür. DNA replikasyonu gibi birden fazla hücresel işlemde yer alan RPA'nın izlenmesini atlatmaz. Burada açıklanan yöntemde, tek bir hücre döngüsü için BrdU ile kuluçkaya yatırılan hücreler, BrdU'nun çoğaltıcı hücresel DNA'nın bir ipliğine dahil edilmesine izin verir. Rezeksiyondan sonra IF boyama, BrdU'nun sadece ssDNA formunda tespit edilmesine izin vererek, bir anti-BrdU antikoru kullanılarak gerçekleştirilir. Bu antikor sadece maruz kalan BrdU nükleotitlerine erişebilir ve çift iplikli DNA'ya entegre olanları tespit etmez. Floresan mikroskopi kullanılarak, resected DNA dakik BrdU/ssDNA odakları şeklinde görselleştirilebilir. Bu odakların nükleer yoğunluğu, DNA hasarından sonra rezeksiyonu ölçmek için bir okuma olarak kullanılabilir. Bu makalede, çoğu memeli hücre hattına uygulanabilen bu yöntemin süreçleri adım adım açıklanmaktadır. Bu yöntem, kavram kanıtı olarak selüloda DNA ucu rezeksiyonunu izlemenin basit bir yolu olarak geniş bir yardımcı olmalıdır.

Protokol

1. Hücre kültürü, tedavileri ve kapak hazırlığı

NOT: Işıtratlamanın yanı sıra tüm hücre kaplamaları, transeksiyonlar ve tedaviler steril bir hücre kültürü başlığı altında gerçekleşmelidir.

  1. 1. Gün
    1. 6 kuyulu bir plakaya, gerektiği kadar çok koşul için her kuyuya tek bir kapak kılıfı yerleştirin. Plaka ~150,000 HeLa hücreleri transfection veya ilaç tedavisi için, istenildiği gibi.
      NOT: Transfecting ise, kaplama anında ters transfeksiyon yapılması önerilir veya yapışmaya izin vermek için kaplamadan birkaç saat sonra ileri transfeksiyon yapılması mümkündür. Hücreler eklenmeden önce transfeksiyon karışımının kapak kılıflarına eklenmesiyle ters transfeksiyon gerçekleştirilir; böylece, hücreler bağlılaşmaya başlamadan önce transfeksiyon başlar. Bunun aksine, ileri bir transfeksiyon, transfeksiyon karışımının genellikle ertesi gün yüzeye yapışması sonrası eklenmesidir. Bununla birlikte, hücrelerin yapışmasını sağlamak için yeterli zaman verilmesi koşuluyla, bunu aynı gün yapmak mümkündür.
    2. Bu yöntem için 4 kuyu kullanın: Kuyu 1: siRNA kontrolü (siCTRL olarak terimli); Peki 2: PARP-1'e karşı siRNA (siPARP-1); Peki 3: tedavi edilmemiş; Kuyu 4: Işınlamadan önce 5 μM BMN673 1 saat ile tedavi edilecek hücreler.
      NOT: Bu protokolde tüm testler ışınlanmış koşullarda yapılmıştır (bkz. bölüm 1.3).
    3. Transfection protokolü 3 güne kadar inkübasyona izin verse de, hücreleri bir gecede% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de kuluçkaya bırakın. BrdU tedavisinden önceki kuluçka süresi siRNA transfeksiyon verimliliğine bağlı olacaktır. Transfection yoksa, kapak kapağına yapışmaya ve bazı hücre büyümesine izin vermek için 16 saat kuluçka yeterlidir.
      NOT: İnkübatör koşulları kullanılan hücre hattına göre değiştirilebilir.
  2. 2. Gün
    1. BrdU'yu uygun kült ortama 10 μM'lik son konsantrasyonda ekleyin ve 16 saat (bir hücre döngüsü) boyunca kuluçkaya yatırın.
      NOT: BrdU çözeltisi dimetilsüllfoksit olarak hazırlanır; kullanılan stok çözeltisi 10 mM'dir ve -20 °C'de aliquotlarda saklanır.
  3. 3. Gün
    1. Plakaları toplam 5 Gy X-ışını ışınlama dozu ile ışınlayın (ışınlayıcı tipine bağlı olarak ışınlama dozunu değişir, örneğin, küçük hayvan ışınlayıcıları ve tezgah üstü ışınlayıcılar). Kullanılan ışınlayıcının markası ve modeli için Malzeme Tablosuna bakın.
    2. Plakaları inkübatöre geri verin ve hücreleri 3 saat boyunca serbest bırakın.
    3. 3 saatlik kuluçka süresi boyunca, 1x fosfat tamponlu salinde (PBS) A ve B olmak üzere iki tamponu ve %4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın.
      NOT: A ve B tamponları ve sakkaroz, kontaminasyonu önlemek için taze sakkaroz çözeltisi kullanılarak sabitlenme günü taze olarak hazırlanmalıdır.
      1. Tablo 1'de açıklanan sıraya (30 mL) göre A tamponu (Çıkarma Öncesi Arabellek) hazırlayın.
        NOT: 1M sakkaroz, kontaminasyonu önlemek için kullanım günü hazırlanmalıdır.
      2. Tablo 1'de (30 mL) açıklanan sıraya göre B tamponu (Sitoskeleton Sıyırma Tamponu) hazırlayın.
        NOT: Ara-20 ve sodyum deoksikolat çözeltisinin çökeltilmesini önlemek için belirtilen sırada B tamponu hazırlanmalıdır.
      3. Kimyasal bir davlumbazın (Tablo 1) altına % 4 PFA, durum başına 2 mL (10 mL) hazırlayın.

2. Ön ekstraksiyon ve fiksasyon

NOT: Tüm ön ekstraksiyon ve fiksasyon, buz üzerinde veya 4 °C'de doku kültürü plakasında kalan kapakçıklarla gerçekleştirilir; kapak parçası yalnızca montajın son adımında kaldırılır (bkz. tartışma).

  1. Ön ekstraksiyon
    1. Ortamı emiş edin, hücreleri 1x PBS ile iki kez dikkatlice yıkayın ve PBS'yi çıkarın. 2 mL Ön Ekstraksiyon TamponU A ekleyin ve hemen 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: A arabelleğindeki inkübasyon süresinin uzatılmaması önemlidir. Ekstraksiyon öncesi tamponlarda genişletilmiş inkübasyon, kapak kapağından ayrılan hücre sayısının artmasına neden olur. Alternatif olarak, 4 °C'de kuluçka yerine, buz üzerinde kuluçka yapılabilir.
    2. Aspirasyon aracılığıyla A Arabelleği'nin kaldırılmasını kaldırın.
      NOT: A tamponu çıkardıktan sonra kapak örtülerini yıkamayın.
    3. 2 mL Cytoskeleton Sıyırma Tampon B ekleyin ve hemen 4 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın. B Tamponu'na dikkatlice emiş ve hücreleri 1x PBS ile bir kez dikkatlice yıkayın. 1x PBS'i dikkatlice aspire edin.
  2. Fiksasyon
    1. Kimyasal kaputun altına %4 PFA'nın 2 mL'sini ekleyerek hücreleri sabitle.
      NOT: PFA toksiktir ve kimyasal bir başlık altında manipüle edilmelidir.
    2. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Kapakları 1x PBS ile iki kez yıkayın ve fazlalığı emiş edin.
    3. Kapakları% 100 soğuk metanol ile örtün ve kapakları 5 dakika boyunca -20 ° C'de kuluçkaya yatırın. 1x PBS ile iki kez yıkayın.
      NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Kapaklar 4 °C'de 1x PBS olarak saklanabilir ve gerekirse plaka alüminyum folyoya sarılabilir. Hücreler IF protokolüne devam etmeden önce 5 günden fazla tutulmamalıdır.

3. Permeabilizasyon

  1. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 0,5 Triton X-100 içeren 2 mL 1x PBS ile kuluçkaya yatırın. Kapak kapaklarını 2 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.

4. İmmünasyon

  1. Engelleme adımı
    1. Kapak kapağı başına 2 mL kullanmak için yeterli taze engelleme tamponu (1x PBS'de %3 BSA) hazırlayın.
      NOT: Antikor çözeltilerini yapmak için ekstra bir 5mL blokaj tamponu hazırlayın.
    2. Her kuyuya 2 mL blokaj tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
  2. Primer antikor inkübasyonu
    1. Birincil antikor çözeltisini taze blokaj tamponunda hazırlayın: BrdU RPN202 1:1000 ve çoğalyan hücre nükleer antijeni (PCNA) 1:500, kapak kapağı başına 100 μL.
      NOT: Antikorun korunması için 22 x 22 mm kapak için 75-100 μL, 18 x 18 mm kapak için 50-75 μL daha küçük bir hacim kullanılabilir.
    2. Her kapak parçasına 100 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin. Kapakları cımbız kullanarak bir parafilm karesi ile örtün ve parafilimi kabarcıklar oluşturmamak için dikkatlice konumlandırın.
    3. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve birincil antikoru nemlendirilmiş bir odada 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
    4. Parafilm karelerini çıkarın ve kapakları 2 mL steril 1x PBS ile üç kez yıkayın.
  3. İkincil antikor inkübasyonu
    1. Taze blokaj tamponunda yeterli ikincil antikor çözeltisi hazırlayın: anti-fare 488 floresan ikincil A11011 (BrdU için) seyreltme 1:800 ve anti-tavşan 568 floresan ikincil A11011 (PCNA için) seyreltme 1:800.
      NOT: Kullanılan renkler deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde değiştirilebilir. Kullanılan özel marka Malzeme Tablosunda bulunabilir.
    2. Her kapak 100 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin, kapakları cımbız kullanarak bir parafilm karesi ile örtün ve parafilmi kabarcıksız dikkatlice yerleştirin.
    3. İkincil antikorun oda sıcaklığında alüminyum folyo ile kaplanmış plaka ile 1 saat kuluçkaya yatırın.
    4. Kapak kapaklarını 2 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
  4. Nükleer boyama
    1. 1 μg/mL (1:1000) son konsantrasyonda 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren 1x PBS kapak kapağı başına 2 mL'lik bir hacim hazırlayın.
    2. DAPI çözümünün her kapak 2 mL'sini ekleyin. Kapakları oda sıcaklığında alüminyum folyo ile kaplanmış plaka ile 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kapak kapaklarını 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    3. Kapak kapaklarını 1x PBS ile örtün ve kapak kapağını kuyunun altından kaldırmak için bir iğne veya ince cımbız kullanın. Bir kenarı kağıt havluya hafifçe dokunarak fazla sıvıyı dikkatlice lekeleyin.
      NOT: Slaydı düşürmemeye veya yapışık hücrelerin olduğu düz yüzeyin kağıda dokunmasına izin vermemeye dikkat edin.
    4. KAPAKLARI 10-20 μL IF'ye özgü montaj ortamı kullanarak slaytlara monte edin.

5. Görüntü alma ve analiz

NOT: Görüntü alımı çeşitli floresan mikroskop türlerinde yapılabilir. 63x yağ hedefine sahip bir epifluoresans mikroskobu kullanılmıştır; marka ve model için Malzeme Tablosu'na bakın. Hücre çizgisine ve mitokondriyal lekelenme seviyesine bağlı olarak kullanımda olsalar da, Z yığınları gerekli değildir.

  1. Görüntü analizi
    1. Her görüntü için birden çok tiff dosyası oluşturun; tüm düzlemleri birleştirin, ancak renk kanallarını ayrı tutun. Bu dosyaları Cell Profiler'a (The Broad Institute https://cellprofiler.org/home) alın ve Benek Sayma ardışık düzeni (Ek Video 1) kullanarak analiz edin.
    2. Resimleri yükleyin (Ek Şekil S1A).
      1. Projeyi oluşturmaya başlamak için, benek sayım boru hattını programa ve sağlanan alanda analiz edilecek görüntülere yükleyin.
      2. Diğer modüllerin it-C01: Representing BrdU Channel'a başvuracağı her görüntüye anlamlı bir ad atamak için NamesAndTypes modülünü kullanın; C02: PCNA Kanalini TemsilEn; C03: DAPI Kanalini temsil ediyor.
        NOT: Bu tanımlayıcılar mikroskopa bağlı olacaktır; kanallar arasında ayrım yapmak için dosya adında bir tanımlayıcı olmalıdır.
    3. Çekirdeği tanımlamak ve adlandırmak için hangi dosyanın kullanılacağını belirleyin (bu adı gerektiği gibi değiştirin) (bkz. Ek Şekil S1B ve Ek Şekil S1C).
      1. Çekirdeğin kabul edilebilir boyut aralığı olan 50 ile 300 piksel arasındaki nesnenin çapını seçin, ancak değeri görüntüdeki çekirdeğe sığacak şekilde değiştirin.
        NOT: 50 çok büyük bir değer olabilir ve daha küçük çekirdeklerin tanımlanmasını önler; aynı şekilde, 300 çekirdeklerin büyük gruplandırmalarının 1 olarak sayılmasına izin verebilir.
      2. Yalnızca ölçütlerle eşleşenlerin sayılabilmesini sağlamak için çap aralığının dışındaki nesneleri atın.
      3. Yalnızca kısmen alanda olabilecek hücreleri kaldırmak için kenarlıklara dokunan nesneleri atın.
      4. Belirli görüntülere sığacak şekilde eşiği uygulayın. Örnek olarak aşağıdaki ayarlara dikkat edin. Eşikleme stratejisinin ne kadar sıkı olacağına bağlı olarak eşik düzeltme faktörünü değiştirin. Diğer ayarlar arasında eşik stratejisi: Genel; eşikleme yöntemi: Otsu; iki sınıf veya üç sınıf eşiği: İki sınıf; eşik yumuşatma ölçeği: 1; eşik yumuşatma faktörü: 1; eşikteki alt ve üst sınırlar: 0.0 ve 1.0; kümelenmiş nesneleri ayırt etme yöntemi: Şekil; ve topaklanmış nesneler arasında ayrım çizgileri çizme yöntemi: Yay.
        NOT: Her parametre için hücre profil oluşturucu, değişken ayarı için tamamlayıcı tanımlar ve kullanılabilir olasılık sağlar.
    4. Odakları tanımlamak için birincil nesneyi tanımlayın (Ek Şekil S2A).
      1. Aşağıdaki ayarları kullanın: giriş görüntüsünü seçin: Maskedgreen; tanımlanacak birincil nesneyi adlandırdı: BrdUFoci; nesnenin tipik çapı: 1-15; nesneyi çap aralığının dışına atın: Evet; görüntünün kenarlık kısmına dokunan nesneyi atın : Hayır; eşik stratejisi: Uyarlanabilir; eşikleme yöntemi: Otsu; iki sınıf veya üç sınıf eşiği: Üç sınıf; eşik yumuşatma ölçeği: 1; eşik yumuşatma faktörü: 3; ve yumuşatma filtresinin boyutu: 4.
    5. Ölçü yoğunluğu (Ek Şekil S2B).
      1. Ölçülecek görüntüyü seçin: OrigGreen.
      2. Başka bir resim ekle'ye tıklayın. Ölçülecek görüntüyü seçin: PCNA. Ölçülecek nesneleri seçin: Çekirdek.
        NOT: Bu, BrdU ve PCNA yoğunluğunu-grafiklenecek nihai verileri ölçmek için kullanılacaktır.

Sonuçlar

Bu protokolde Bromodeoxyuridine (BrdU) bazlı test, HeLa hücrelerinin ışınlama kaynaklı hasara rezeksiyon yanıtını nicel olarak ölçmek için kullanılmıştır. Oluşturulan ssDNA izleri immünofluoresans lekelemeden sonra farklı odaklar olarak görselleştirilir (Şekil 1A). Tanımlanan odaklar daha sonra ölçüldü ve çekirdekteki BrdU lekelemenin toplam entegre yoğunluğu olarak ifade edildi (Şekil 1B, Ek Şekil S1, Ek Şekil S2

Tartışmalar

Bu makalede, selülodaki DNA rezeksiyonundaki varyasyonları ölçmek için IF boyamadan yararlanan bir yöntem açıklanmaktadır. DNA rezeksiyonu üzerindeki etkiyi gözlemlemek için mevcut standart RPA boyamasıdır; ancak bu, DNA replikasyondan etkilenebilecek dolaylı bir yöntemdir. Daha önce, BrdU pozitif ve BrdU negatif hücrelerde ortaya çıkan yoğunlukları sınıflandırmak için başka bir BrdU kuruluş tabanlı DNA rezeksiyonU tekniği tanımlanmıştır. Bu yöntem, hr geçirmeyen hücrelerin a...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Marie-Christine Caron'a olağanüstü teknik tavsiyeler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri J.Y.M (CIHR FDN-388879) tarafından finanse edilen fonlarla desteklenmektedir. J.-Y.M. DNA Onarımı ve Kanser Terapötikleri'nde Tier 1 Kanada Araştırma Başkanı'nın sahibidir. J.O'S bir FRQS doktora öğrencisi ve S.Y.M frqs doktora sonrası öğrencisidir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa 568 goat anti-rabbitMolecular probesA110111:800
Alexa Fluor 488 goat anti-mouseMolecular probesA110011:800
Anti PARP1 (F1-23)Homemade1:2500
Anti PCNA (SY12-07)NovusNBP2-673901:500
Anti-Alpha tubulin (DM1A)AbcamAb72911:100000
anti-BrdUGE HealthcareRPN2021:1000
Benchtop X-ray IrradiatorCell Rad
BMN673MedChem ExpressHY-16106
Bromodeoxyuridine (BrdU)SigmaB5002
BSASigmaA7906
Cell profilerBroad InstituteV 3.19https://cellprofiler.org/
Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ftFisher scientific13-374-12
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Invitrogen Life TechnologyD1306
DMEM high glucoseFisher scientific10063542
EGTASigma-AldrichE3889
Fetal Bovine serumGibco12483-020
Fisherbrand Cover Glasses: Squares 22 x 22Fisher scientific12 541B
Fluorescent microscopeLeicaDMI6000B63x immersion objective
HeLaATCCCCL-2
HERACELL 160I CO2 INCUBATOR CU 1-21 TC 120VVWR5103040837% CO2
MgCl2BioShop CanadaMAG520.500
NaClBioShop CanadaSOD002.10
Needle
PBS 1xWisent Bio Products311-010-CS
PFA 16%Cedarlane Labs15710-S(EM)
PIPESSigma-AldrichP6757-100G
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogen Life TechnologyP-36930
RNAiMAXInvitrogen13778-075
siPARPiDharmaconAAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT
siRNA controlDharmaconUUCGAACGUGUCACGUCAA
Sodium DeoxycholcateSigma-AldrichD6750-100G
SucroseBioShop CanadaSUC507.5
Tris-baseBioShop CanadaTRS001.5
Trition X-100Millipore SigmaT8787-250ML
Tween20Fisher scientificBP337500
Tweezers

Referanslar

  1. Mouw, K. W., Goldberg, M. S., Konstantinopoulos, P. A., D'Andrea, A. D. DNA damage and repair biomarkers of immunotherapy response. Cancer Discovery. 7 (7), 675-693 (2017).
  2. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (11), 698-714 (2019).
  3. Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).
  4. Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).
  5. Ronato, D. A., et al. Limiting the DNA double-strand break resectosome for genome protection. Trends in Biochemical Science. 45 (9), 779-793 (2020).
  6. Hu, Y., et al. PARP1-driven poly-ADP-ribosylation regulates BRCA1 function in homologous recombination-mediated DNA repair. Cancer Discovery. 4 (12), 1430-1447 (2014).
  7. Satoh, M. S., Lindahl, T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair. Nature. 356 (6367), 356-358 (1992).
  8. Sugimura, K., Takebayashi, S., Taguchi, H., Takeda, S., Okumura, K. PARP-1 ensures regulation of replication fork progression by homologous recombination on damaged DNA. Journal of Cell Biology. 183 (7), 1203-1212 (2008).
  9. Bryant, H. E., et al. Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).
  10. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  11. Zhou, P., Wang, J., Mishail, D., Wang, C. Y. Recent advancements in PARP inhibitors-based targeted cancer therapy. Precision Clinical Medicine. 3 (3), 187-201 (2020).
  12. Noordermeer, S. M., van Attikum, H. PARP inhibitor resistance: a tug-of-war in BRCA-mutated cells. Trends in Cell Biology. 29 (10), 820-834 (2019).
  13. Caron, M. C., et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 antagonizes DNA resection at double-strand breaks. Nature Communications. 10 (1), 2954 (2019).
  14. Zhou, Y., Caron, P., Legube, G., Paull, T. T. Quantitation of DNA double-strand break resection intermediates in human cells. Nucleic Acids Research. 42 (3), 19 (2014).
  15. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  16. Sartori, A. A., et al. Human CtIP promotes DNA end resection. Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).
  17. Huertas, P., Cruz-García, A. Single molecule analysis of resection tracks. Methods in Molecular Biology. 1672, 147-154 (2018).
  18. Soniat, M. M., Myler, L. R., Kuo, H. -. C., Paull, T. T., Finkelstein, I. J. RPA phosphorylation inhibits DNA resection. Molecular Cell. 75 (1), 145-153 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 170BrdU odaklarmm nofluoresansDNA sonu rezeksiyonuhomolog rekombinasyonPARP 1PARP inhibit rleriPARP inhibit r direnciBMN673

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır