Haemophilus Influenzae'ye Solunum İmmün Yanıtlarının Değerlendirilmesi

Özet

Haemophilus influenzae solunum yollarında inflamasyona neden olur. Bu makalede, bu bakteriye yanıt olarak fagositler ve lenfositler tarafından immün yanıtları tanımlamak için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopinin kullanımı üzerinde durulacaktır.

Özet

Haemophilus influenzae (Hi), çeşitli solunum koşullarında bulunan yaygın bir bakteridir. Bu bakteriye solunum immün / enflamatuar yanıtı değerlendirmek için çeşitli farklı tahliller / teknikler kullanılabilir. Akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi, biyolojik yanıtların ayrıntılı karakterizasyonunu sağlayan floresan tabanlı teknolojilerdir. Hücre duvarı bileşenleri, öldürülmüş / inaktive edilmiş preparatlar ve canlı bakteriler dahil olmak üzere Hi antijeninin farklı formları kullanılabilir. Hi, zenginleştirilmiş ortam gerektiren titiz bir bakteridir, ancak standart laboratuvar ortamlarında yetiştirilmesi genellikle kolaydır. Hi ile stimülasyon için doku örnekleri periferik kan, bronkoskopi veya rezeke akciğerden elde edilebilir (örneğin, akciğer kanseri tedavisi için ameliyat edilen hastalarda). Makrofaj ve nötrofil fonksiyonu, fagositoz, reaktif oksijen türleri ve hücre içi sitokin üretimi dahil olmak üzere ölçülen çeşitli parametrelerle akış sitometrisi kullanılarak kapsamlı bir şekilde değerlendirilebilir. Lenfosit fonksiyonu (örneğin, T hücresi ve NK hücre fonksiyonu), esas olarak hücre içi sitokin üretimi için akış sitometrisi kullanılarak spesifik olarak değerlendirilebilir. Hi enfeksiyonu, hem nötrofiller (NET'ler) hem de makrofajlar (MET'ler) tarafından hücre dışı tuzak üretiminin güçlü bir indükleyicisidir. Konfokal mikroskopi, proteaz aktivitesini değerlendirmek için de kullanılabilecek NET ve MET ekspresyonunu değerlendirmenin tartışmasız en uygun yoludur. Haemophilus influenzae'ye karşı akciğer bağışıklığı, akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanılarak değerlendirilebilir.

Giriş

Haemophilus influenzae (Hi), çoğu sağlıklı yetişkinin farenksinde bulunan normal bir kommensal bakteridir. Hi, polisakkarit kapsüle sahip olabilir (A-F tipleri, örneğin B veya HiB tipi) veya bir kapsülden yoksun olabilir ve yazılamaz (NTHi)¹. Mukozanın bu bakteri ile kolonizasyonu erken çocukluk döneminde başlar ve farklı kolonize edici suşların devri^{vardır 2}. Bu bakteri aynı zamanda hem üst hem de alt solunum yollarının istilasını da yapabilir; bu bağlamda immün yanıtın aktivasyonunu ve inflamasyonu indükleyebilir ^3,4. Bu inflamatuar yanıt klinik hastalığa neden olabilir ve sinüzit, otitis media, bronşit, kistik fibroz, pnömoni ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) dahil olmak üzere çeşitli önemli solunum koşullarına katkıda bulunabilir. Bu koşulların çoğu NTHi suşları^{2'den kaynaklanmaktadır}. Bu makalede, Hi'ye karşı solunum immün yanıtlarını değerlendirmek için akım sitometrisi ve konfokal mikroskopi kullanarak yöntemler açıklanacaktır.

Aşağıda açıklanan yöntemler, Hi'ye enflamatuar yanıtı değerlendirmek için modifiye edilmiş köklü tekniklerden uyarlanmıştır. Hi'nin uygun bir antijenik formunun seçimi bu değerlendirmenin önemli bir parçasıdır. Antijenik preparatlar hücre duvarı bileşenlerinden canlı bakterilere kadar uzanır. Tahlilleri oluşturmak ve standartlaştırmak için, periferik kan örneklerinin kullanımı başlangıçta çok yararlı olabilir.

Akış sitometrisi, hücresel düzeyde bir numuneden çeşitli parametrelerin ve fonksiyonel testlerin ölçülmesini sağlar. Bu teknik, spesifik hücresel yanıtların (örneğin, reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimi veya hücre içi sitokin üretimi), enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) veya ELISspot gibi diğer daha genel yöntemlerle karşılaştırıldığında değerlendirilebilmesi avantajına sahiptir.

Hücre dışı tuzaklar nötrofiller (NET'ler)^5,6,7 ve makrofajlar (MET'ler)⁸ gibi diğer hücreler tarafından eksprese edilir. Özellikle akciğer^9'daki enfeksiyonda anahtar inflamatuar yanıt olarak giderek daha fazla tanınmaktadırlar. Konfokal floresan mikroskopi ile değerlendirilebilirler. Bu teknik, NET'lerin / MET'lerin kesin olarak tanımlanmasını sağlar ve ifadelerini diğer hücre ölümü biçimlerinden ayırır⁶.

Hem akım sitometrisi hem de konfokal mikroskopi floresan bazlı tahlillerdir. Başarıları, biyolojik örneklerin optimal gerilme protokollerine bağlıdır. Bu yöntemlerin öğrenilmesi biraz zaman alır ve uygun denetim uzmanlığı gerektirir. İlgili enstrümanlar da hem satın almak hem de çalıştırmak için pahalıdır. Kullanımları için en uygun ayar, büyük üniversiteleri ve üçüncül sevk hastanelerini içerir.

Bu protokolde kullanılan yöntemler, solunum yolu hastalığında rol oynayan diğer benzer organizmaların (örneğin, Moxarella catarrhalis ve Streptococcus pneumoniae) incelenmesi için aktarılabilir. NTHi ayrıca diğer yaygın solunum bakterileri ile etkileşime girer¹⁰.

Protokol

Bu çalışma Monash Health'in insan araştırma etik komitesi tarafından onaylandı. Protokol, insan araştırma etik komitesinin yönergelerini takip eder.

1. Antijenik preparat

NOT: Hi'ye karşı immün yanıtı değerlendirmek için üç farklı antijenik preparat kullanılabilir. Bunlar 1) bir hücre altı bileşenidir (tipik olarak bakteriyel hücre duvarından); 2) öldürülmüş ve etkisiz hale getirilmiş bakteriler; ve 3) canlı bakteriler. Herhangi bir deneyin başlatılmasından önce her antijenik preparatın kullanımını belirleyin.

1. Alt hücre bileşenleri
   1. Ticari preparatlar, şirket içi geliştirilmiş bileşenler ve / veya diğer araştırmacılardan dahil olmak üzere kaynaklardan hücre altı bileşenler elde edin.
      NOT: Genellikle bakteriyel hücre duvarından gelen alt hücresel bileşenler kullanılabilir ve P6 ve lipooligosakkarit (LOS) ^11,12 gibi dış zar proteinlerini içerir. Bu hücre altı bileşenler genellikle uzmanlaşmış merkezlerde türetilir. Nasıl yapıldığının açıklaması bu makalenin kapsamı dışındadır. Bu bileşenleri elde etmek için bu alandaki uzmanlarla doğrudan temas halinde olmanız önerilir.
2. Öldürülmüş/inaktive edilmiş bakteriler
   1. Bakterileri uygun numuneden alın (örneğin, balgam veya bronkoskopi). Uygun bir mikrobiyoloji laboratuvarı kullanarak suşu H. influenzae olarak onaylayın. Yazılamaz olduklarını doğrulamak için H. influenzae örneklerinin tiplemesini gerçekleştirin (uzman bir mikrobiyoloji laboratuvarı tarafından).
   2. Temsili bir antijen elde etmek için, havuzlanmış bir antijen yapmak için birden fazla NTHi suşu (her biri yaklaşık olarak aynı miktarda en az 5) kullanın. Suşları mikrosantrifüj tüplerinde gliserol suyunda -70 ° C'de saklayın.
      NOT: Bu deneyde, on farklı suş kullanılmıştır.
   3. Suşları (her seferinde bir mikrosantrifüj tüpü) çikolata agar plakalarına çözün ve% 5 CO₂ ile 37 ° C'lik bir inkübatörde gece boyunca büyüyün. Bakterileri 500 μL fosfat tamponlu saline (PBS) ekleyin ve iki kez yıkayın (5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün). NTHi'yi 10⁸ mL'lik bir konsantrasyona (5 mL'lik bir kap veya eşdeğeri kullanarak) alikot etmek için bir MacFarland standart¹⁰ veya spektrofotometre¹³ kullanın.
   4. Isı, bakterileri 10 dakika boyunca 56 ° C sıcaklıkta bir su banyosuna yerleştirerek etkisiz hale getirin.
   5. 30 s için düşük-orta aralıklı bir hızda sürekli bir sonikasyon ayarı kullanarak bakterileri sonikleştirin.
   6. Aliquot uygun hacimdeki numuneleri mikrosantrifüj tüplerine dönüştürün. 10⁸ mL'lik bir numune için, 50 μL'lik alikotlar kullanın (yani, mL başına 20 numune), gerekli^14'e kadar -70 ° C'de dondurun.
3. Canlı bakteriler
   1. İlk olarak, canlı bakterileri adım 1.2.1'de belirtildiği gibi karakterize edin. İyi karakterize edilmiş bir suş kullanın. Suşun ayrıca yedek olarak -70 ° C'de gliserol suyunda depolandığından emin olun.
   2. Bakterileri çikolatalı agar plakaları veya et suyu gibi zenginleştirilmiş ortamlarda büyütün.
      1. Çikolatalı agar plakalarını kullanmak için, bakterileri steril serpiciler ile en az 3-4 günde bir yayın.
      2. Alternatif olarak, bakterileri büyütmek için X (hemin) ve V (β-nikotinamid adenin dinükleotid) faktörleri ile zenginleştirilmiş Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) suyu kullanın. NTHi'yi, hem hemin hem de β-nikotinamid adenin dinükleotid (her ikisi de 10 μg / mL) ve kültürle desteklenmiş 5-10 mL BHI suyundaki gece plakalarından 5-10 mL'lik bir_CO2 inkübatöründe bir gecede aşılayın.
         NOT: Bu, tekrarlanabilirlik, daha yüksek koloni oluşturan birimler (CFU) sayıları ve tüm bakterilerin benzer bir kütük büyümesi aşamasında olması avantajına sahiptir (plakalarda, bakteri canlılığı kültürdeki konuma bağlı olarak daha büyük olabilir)^13,15.
   3. Hücresel canlılığı korurken güçlü bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarmak için bir hücreye 100 bakterilik çok sayıda enfeksiyon (MOI) kullanın. Bakteri sayısını değerlendirmek için MacFarland Standard¹⁰ veya spektrofotometre^13'ü kullanın.
   4. Canlı NTHi testleri için kullanılan medyanın herhangi bir insan serumundan arındırılmış olduğundan emin olun, çünkü bu bakterileri öldürür¹⁶. Hayvan serum örnekleri (örneğin, fetal buzağı serumu) genellikle herhangi bir soruna neden olmaz.
      NOT: Periferik kan, bronkoskopi örnekleri (özellikle bronkoalveoler lavaj (BAL)) ve rezeke edilmiş akciğer dokusu gibi standart doku örneklerini analiz etmek için aşağıda açıklanan yöntemleri kullanın. Örnekleri Hi antijeni ile 10 dakikadan 24 saate veya daha fazlasına kadar inkübe edin.

2. Fagositik fonksiyonun akım sitometrisi ile değerlendirilmesi

NOT: Bu tahlil, çözelti içindeki hücreleri gerektirir ve tipik olarak tam kanda veya BAL sıvısı kullanılarak yapılır. Bu tahlil, inaktive edilmiş Staphylococcus aureus preparatı ve Pansorbin^17'nin kullanımına dayanan daha önce yayınlanmış bir protokolden değiştirilmiştir. İnaktive edilmiş tam kan ve sabit H. influenzae , Pansorbin¹⁷ ile değiştirilir.

1. Öldürülmüş, inaktive edilmiş NTHi (1.2) ile 100 μg / mL'de propidium iyodür (PI) ile fosfat tamponlu salin (PBS) içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 1: 1 oranında karıştırın. 5 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj yapın ve ardından 500 μL PBS içinde yıkayın. 5 dakika boyunca 450 x g'de döndürün ve peleti 500 μL PBS'de yeniden askıya alın.
2. 450 μL periferik kanı (bir insan deneğinin veneponksiyonundan), 50 mL'lik bir tüpte 37 ° C'de bir su banyosunda 20 dakika boyunca H. influenzae etiketli 50 μL inaktive PI ile inkübe edin.
3. Numuneleri su banyosundan çıkarın ve 5 μL dihidrorodamin-1,2,3 (DHR) ekleyin. 10 sn boyunca vorteks yapın ve daha sonra 10 dakika daha su banyosuna geri yerleştirin.
4. Numuneleri su banyosundan çıkarın ve eritrositleri (yukarıda adım 2.2'de listelenen 500 μL hacim) 10:1 (yani 5 mL)% 0.8 amonyum klorür (150 mM NH₄Cl, 1 mM NaHCO₃ ve 0.1 mM EDTA) çözeltisi ile lize edin.
   NOT: Alternatif olarak, Q-prep gibi otomatik bir sistem kullanılabilir.
5. Numuneleri bir saat içinde bir akış sitometresinde analiz edin. Temsili sonuçlar elde etmek için her örneklemden en az 3.000-5.000 hücreyi (ilgilenilen her bir alt kümeden) analiz edin (Şekil 1).
   1. Fagositoz örneklerini analiz etmek için, etiketli bakterileri yutan hücrelerin oranını belirleyin (floresan boyasına sahip hücrelerin oranını ölçün).
   2. ROS'u, bir floresan sinyaliyle sonuçlanan DHR'nin oksidasyonu ile ölçün (medyan floresandaki değişim, taban çizgisi ve uyarılmış numuneler arasında karşılaştırılır).
      NOT: Nötrofiller daha granülerdir ve daha fazla yan saçılmaya sahipken, makrofajlar daha büyüktür ve daha fazla ileri saçılmaya sahiptir.
   3. Nötrofiller ve makrofajları morfolojik olarak birbirlerinden büyüklüklerine (makrofajlar daha büyüktür) ve granülerliklerine (nötrofiller daha granüler) göre ayırt eder.
      NOT: Nötrofiller ve makrofajlar için spesifik belirteçler genellikle kullanılmaz, ancak CD14 kan monositlerini etiketlemek için kullanılabilir. Akış sitometrisi, monositlerin ve makrofajların farklı fonksiyonel formlarını (örneğin, M1 ve M2 alt kümeleri)¹⁸ ayırt etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.
6. Tahlili uygun şekilde değiştirin (örneğin; fagositleri uyarmak ve DHR bölünmesi ile ROS ekspresyonunu ölçmek için canlı etiketsiz NTHi kullanın).
   1. Periferik kan mononükleer hücrelerini yoğunluk gradyanı santrifüjleme ile izole edin. Kanı yoğunluk gradyanı santrifüjleme için belirlenen polimerin üzerine katlayın ve 30 dakika boyunca 2300 x g'de döndürün. Mononükleer tabakayı bir pipet kullanarak çıkarın, PBS ile iki kez yıkayın ve PBS'deki hücreleri mL başına 10⁶ hücrede yeniden askıya alın.
   2. Alternatif olarak, BAL makrofajlarını kullanın.
   3. Monositleri / makrofajları kültür ortamında (RPMI) 10⁶ hücre / mL konsantrasyonunda askıya alın. Onlara adım 1.3'te açıklandığı gibi 1 saat boyunca 100:1'lik bir MOI'de canlı NTHi bulaştırın.
   4. DHR'yi 10 dakika boyunca adım 2.3'te açıklandığı gibi süspansiyona ekleyin. Akış sitometrisini kullanarak ROS analizini gerçekleştirin.

3. Periferik kanda lenfosit fonksiyonunun değerlendirilmesi

1. Akış sitometri testleri için tam kan veya mononükleer hücre preparatları kullanın¹⁴.
2. Venaponktur ile her konudan örnekler alın. Bir lityum heparin tüpünde periferik bir damardan 4 mL kan toplayın ve kontrol ve antijen stimülasyonu için örnekleri alikotlara bölün.
3. Her iki örneğe de kostimülatör antikorlar (anti-CD28 ve CD49d, 1 μL / mL) ekleyin. Antijen örneğine NTHi ekleyin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin. Öldürülen NTHi preparatı için, 2 mL kana 200 μL antijen ekleyin. Canlı NTHi için, beyaz hücrelere 100: 1'lik bir MOI'de canlı NTHi hücreleri ekleyin (hemositometre ile ölçüldüğü gibi).
4. Golgi bloke edici ajan Brefeldin A'yı (10 μL / mL) numunelere ekleyin ve 5 saat daha inkübe edin.
   NOT: Golgi aparatının bloke edilmesi, sitokinlerin hücre dışına ihraç edilmesini önler.
5. Tam kan kullanılıyorsa, çözelti içinde sadece lökositler bırakmak için% 0.8 amonyum klorür (adım 2.4) ile eritrositleri lize edin. Lökositleri 1 saat boyunca 500 μL% 1-2% paraformaldehit kullanarak sabitleyin.
6. Hücreleri hemositometre ile sayın, 15 dakika boyunca 100 μL% 0.1 saponin ile 10⁶ hücreyi geçirgenleştirin ve hücreleri floresan etiketli antikorlarla inkübe edin. Hücreleri yıkayın ve bir akış sitometresi kullanarak analiz edin.
   NOT: Floresan etiketli antikorların miktarı her sitokin için spesifik olacaktır. Üreticilerin talimatlarını izleyin. Tipik olarak, 100 μL çözelti içindeki 10⁶ hücre 1 saat boyunca boyanır. Ticari olarak elde edilen antikorların çoğu 25-100 test yapmak için yeterli olacaktır.
7. Antijene yanıt veren hücrelerin oranını, Şekil 2'de gösterildiği gibi ilgili lenfosit popülasyonunu (hücreler CD45, daha sonra CD3 ve daha sonra CD4 veya CD8 ekspresyonu ile geçitlenir) kapatarak belirleyin. Analiz edilecek tüm sitokinler için uyarılmamış hücreler üzerinde arka plan boyama yapın. Hem uyarılmış hücreler hem de kontrol için her bir sitokini analiz etmek için 100.000 hücreyi tarayın.

4. Akciğer dokusunda lenfosit fonksiyonu/inflamatuar mediatörlerin değerlendirilmesi

1. Bronkoskopiden yeterli lenfosit elde etmek genellikle mümkün değildir; bu nedenle lobektomi örneklerinden akciğer dokusunu kullanın. Akciğer dokusu örneklerinin optimizasyonu, anatomik patoloji servisi ile yakın ilişki gerektirir. Dokunun tümörden en az 3 cm'lik bir kenar boşluğuna sahip olduğundan ve önemli amfizemi olmayan hücresel doku olduğundan emin olun (patolog tarafından belirlendiği gibi).
2. Akciğer dokusunu, akış sitometri testleri için kullanılmadan önce hücresel bir süspansiyona ayırın. Akciğer dokusunu kimyasal olarak sindirin (örneğin, kollajenaz ile) veya mekanik olarak ayrıştırın.
   NOT: Dokunun mekanik olarak ayrıştırılması, hücrelerin daha iyi yüzey boyanması ile ilişkili olduğu için tercih edilebilir (örneğin, CD3/4 etiketleme)¹⁹.
   1. Bir patologdan lobektomi örnekleri alın (genellikle akciğer kanseri tedavisi gören hastalardan elde edilir). Numunenin yaklaşık 20-40 gramını 3-5 mm³ bölümlere dilimleyin. Uygun bir ayrıştırıcı kullanılarak mekanik olarak parçalanmadan önce steril bir 50 μL haznenin içine yerleştirin.
   2. Doku ayrışmasından sonra, kırmızı kan hücrelerini adım 2.4'te belirtildiği gibi% 0.8 NH₄Cl ile lize edin.
   3. Hücreleri steril RPMI'da yeniden askıya alın (hacim hücre numaralarına bağlı olacaktır ve genellikle 10-20 mL'dir) ve ardından bunları 100 μm steril naylon ağdan filtreleyin. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak uygulanabilir hücrelerin sayısını sayın.
3. NTHi enfeksiyon testi
   1. Akciğer hücrelerini, tüp başına 4 x 10⁶ hücre / mL'lik bir son hücre konsantrasyonuna (kontrol ve uyarılmış örnekler) yeniden askıya alın.
   2. (Negatif) kontrol tüpü için 1 mL RPMI'da 4 x 10^6-6 x 10⁶ hücreli bir süspansiyon kullanın. NTHi tüpü için aynı miktarı kullanın (herhangi bir ek numune SEB ile pozitif kontrol olarak kullanılabilir). NTHi tüpündeki hücreleri, hücre başına 100 bakterilik bir MOI'de enfekte edin. Tüplerde gaz transferine izin vermek için kapağı yarım rotasyonla gevşetin.
   3. Hücreleri bir tüp rotatöre yerleştirin ve 12 rpm'de dönerken 37 ° C'de inkübe edin.
   4. Sitokinlerin hücre dışı ihracatını önlemek için, 10 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona stimülasyondan 1 saat sonra hücre süspansiyonlarına bir Golgi blokeri (Brefeldin A) ekleyin. Hücre süspansiyonlarını rotasyonda 16-22 saatlik bir inkübasyon için iade edin (adım 4.3.3).
   5. Hücre süspansiyonunu% 1 sığır serum albümini (BSA) ve% 0.01 NaN3 içeren 500 μL PBS ile yıkayın. Hücreleri sırasıyla adım 3.5 ve adım 3.6'da açıklandığı gibi sabitleyin ve geçirgenleştirin.
   6. Hücre içi sitokin boyama için antikorları ekleyin (antikorların seçimi, adım 3.6'daki NOT'ta listelendiği gibi, araştırmacı tarafından belirlenmelidir). Spesifik insan lenfosit hücre yüzey belirteçleri (örneğin, CD45, CD3, vb.) için hücre süspansiyonunu 1 saat boyunca sabitleyin. Hücreleri PBS ile yıkayın, 3.5-3.6 adımlarında açıklandığı gibi sabitleyin ve geçirgenleştirin.
   7. Hücreleri hücre içi sitokin boyama antikorları (örneğin, IFN-γ ve TNF-α veya IL-13 ve IL-17A) ile 1 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Önce yüzey belirteçlerinin boyanması, daha sonra hücre içi olarak boyanması önerilir, çünkü fiksasyon, antikorların bağlandığı yüzey proteinlerinde konformasyonel değişikliklere neden olabilir.
   8. Hücreleri 500 μL PBS ile yıkayın ve bir akış sitometresinde veri toplamadan önce 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
4. Adım 3.2'de açıklanan süpernatantı analiz etmek için bir boncuk dizisi testi birlikte kullanılabilir (Bunu Brefeldin A olmadan gerçekleştirin). Bu, çok çeşitli farklı enflamatuar mediatörlerin (potansiyel olarak 40-50 arabulucuya kadar) analizine izin verir. Süpernatantı 100 μL alikotlarda toplayın ve analize hazır olana kadar -70 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, multipleks kemilüminesan tahliller²⁰ kullanılabilir.
   1. Çözülmüş örnekleri analiz etmek için multipleks boncuk dizileri kullanın. Üreticinin talimatlarını izleyerek sitokin üretimini analiz etmek için depolanan süpernatantı kullanın.
   2. Bir akış sitometresinde multipleks boncuk dizisinin alımını gerçekleştirin. Aşağı akış veri analizini gerçekleştirmek için ilgili yazılımı kullanın.
      NOT: Bu boncuk dizisi testi, periferik kan ve / veya BAL örneklerinden süpernatant üzerinde de yapılabilir.

5. Akciğer proteolizisinin konfokal mikroskopi ile değerlendirilmesi

NOT: Floresan konfokal mikroskopi, akış sitometrisine tamamlayıcıdır ve proteaz ve ROS enflamatuar yanıtlarını değerlendirmek için kullanılabilir. NET'ler ve MET'ler gibi hücre dışı tuzaklar, diğer inflamatuar mediatörlerle, özellikle nötrofil elastaz (NE) ve matriks metalloproteinazlar (MMP) gibi proteazlarla birlikte hücre dışı kromatinden (DNA) oluşur. Konfokal mikroskopi kullanılarak BAL ve akciğer dokusunda değerlendirilebilirler ve bu daha önce Sharma, R. ve ^ark.21 tarafından tanımlanmıştır.

1. Konfokal mikroskopi ve in situ zimografi 15,17 kullanarak akciğer dokusunda doğrudan proteaz ekspresyonunu (adım 4.2.1'de açıklandığı gibi) değerlendirin.
   1. Taze veya dondurulmuş sabitlenmemiş akciğer dokusu kullanın. 4 μm kalınlığa kadar kesilmiş kesitleri süperdon/yapışma kızaklarına monte edin. Bölümleri 1x reaksiyon tamponunda 5 dakika önceden ısıtın.
   2. Metalloproteinazların etkisiyle proteolizi ölçmek için floresein etiketli jelatin substratını (bölüm başına 30 μg / mL) doğrudan ayrı slaytlara ekleyin.
   3. Slaytları yatay konuma yerleştirin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de ışık korumalı, nemlendirilmiş bir odada inkübe edin.
   4. Bölümleri monte etmeden önce 1x reaksiyon tamponunda durulayın.
   5. Negatif kontrol olarak, bölümlere floresan jelatin içermeyen sadece reaksiyon tamponunu ekleyin.
   6. Substratın lizisini inceleyerek analiz etmek için bir konfokal mikroskop kullanın. Proteoliz kanıtı ile akciğerin alanını belirlemek için ImageJ kullanın. Bunun için, söndürülmüş numunenin arka planının üzerinde lekelenme olan akciğer alanını ölçün. Başka bir kontrol olarak, floresan jelatin eklenmemiş akciğer dokusunu¹⁵ olarak kullanın.
      NOT: Bunu, her örnek için en az 10 yüksek güçlü görüş alanında (FOV) gerçekleştirin.
2. Akciğer dokusundaki hücre dışı ROS ekspresyonunu, 3-nitrotirozin (toksik oksidatif stres ürünü) için immünoreaktivite ile ^ölçün13.

Sonuçlar

Temsili sonuçlar, NTHi'ye inflamatuar immün yanıtların akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi ile nasıl değerlendirilebileceğini / nicelleştirilebileceğini göstermektedir. Sonuçların yorumlanmasının önemli bir kısmı, kontrol ve uyarılmış numuneler arasındaki floresan karşılaştırmasıdır. Numunelerin boyanmasını optimize etmek için genellikle bir dizi ön deney gereklidir. Aynı anda kaç farklı rengin incelenebileceği, akış sitometresi / konfokal mikroskopta bulunan kanal sayısına ba...

Tartışmalar

Burada listelenen yöntemler, Hi'ye inflamatuar akciğer yanıtı hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için birlikte kullanılabilecek floresan bazlı akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi tekniklerini kullanır.

Kullanılacak Hi'nin uygun antijenik formülasyonunun oluşturulması kritik öneme sahiptir ve bu konuda bir mikrobiyologdan spesifik girdi alınması tavsiye edilir. Live Hi daha güçlü bir tepki verirken, öldürülen Hi preparatları ve Hi bileşenleri daha standartlaştır...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium chloride	Sigma Aldrich	213330
Brefeldin	Sigma Aldrich	B6542
CD28	Thermofisher	16-0289-81
CD49d	Thermofisher	534048
DAPI prolong gold	Thermofisher	P36931
DHR123	Sigma Aldrich	109244-58-8
Filcon sterile nylon mesh	Becton Dickinson	340606
Gelatin substrate, Enzchek	Molecular probes	E12055
MACS mix tube rotater	Miltenyi Biotec	130-090-753
Medimachine	Becton Dickinson		Catalogue number not available
Medicons 50 µm	Becton Dickinson	340592
Pansorbin	Sigma Aldrich	507858
Propidium iodide	Sigma Aldrich	P4170
Saponin	Sigma Aldrich	8047152
Superfrost slides	Thermofisher	11562203