JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kardiyak yeniden programlama değerlendirmesi için bir Tg (Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıdaki αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare muhabir hattının kurulmasını ve uygulanmasını açıklıyoruz. Fare zorlanmasından izole edilen yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) dönüştürülerek, kalsiyum (Ca2+) akı yoluyla iCM'lerin yeniden programlama verimliliğinin ve fonksiyonel olgunlaşmasının rahat ve verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Kardiyak yeniden programlama, hasarlı bir kalbi onarmak için potansiyel olarak umut verici bir tedavi haline geldi. Fibroblastlar, Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) dahil olmak üzere birden fazla transkripsiyon faktörü sunarak indüklenmiş kardiyomiyositlere (iCM' ler) yeniden programlanabilir. Bu iCM'ler, enfarktüslü bir kalpte yerinde üretildiğinde, elektriksel ve mekanik olarak çevredeki miyokardla bütünleşir ve yara izi boyutunda bir azalmaya ve kalp fonksiyonunda iyileşmeye yol ederim. iCM'lerin nispeten düşük yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi nedeniyle, iCM'lerin karakterizasyonu bir zorluk olmaya devam etmektedir. Akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere bu alanda şu anda kullanılan yöntemler, esas olarak kardiyak gen ve protein ekspresyonine odaklanır, ancak iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasına odaklanmaz. Eylem potansiyelleri tarafından tetiklenen kardiyomiyositlerde voltaj kapılı kalsiyum kanallarının açılması hücreye hızlı bir kalsiyum akınına yol açar. Bu nedenle, kalsiyum akını oranını ölçmek kardiyomiyosit fonksiyonunu değerlendirmek için umut verici bir yöntemdir. Burada, protokol iCM işlevini kalsiyum (Ca2+) akı ile değerlendirmek için bir yöntem sunar. Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (Myh6-olarak adlandırılır) geçilerek bir αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare suşu kuruldu Aşağıdaki cre) gt (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (aşağıda Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fareler ile. P0-P2 yenidoğan farelerinden yenidoğan kardiyak fibroblastlar (NCF'ler) izole edildi ve in vitro olarak kültürlendi ve NCF'lere MGT'nin polistronik bir yapısı tanıtıldı ve bu da iCM'lere yeniden programlanmalarına yol açtı. Sadece başarıyla yeniden programlanan iCM'ler GCaMP3 muhabirini ifade edeceğinden, iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşması floresan mikroskopi ile Ca2+ akı tarafından görsel olarak değerlendirilebilir. Yeniden programlanmamış NCF'lerle karşılaştırıldığında, NCF-iCM'ler CD'lere benzer şekilde önemli kalsiyum geçici akı ve spontan kasılma gösterdi. Bu protokol, fare zorlanması kuruluşu, yenidoğan fare kalplerinin izolasyonu ve seçimi, NCF izolasyonu, kardiyak yeniden programlama için retrovirüs üretimi, iCM indüksiyonu, muhabir hattımız kullanılarak iCM Ca2+ akısının değerlendirilmesi ve ilgili istatistiksel analiz ve veri sunumunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Burada açıklanan yöntemlerin kardiyak yeniden programlama çalışmaları için iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için değerli bir platform sağlaması beklanmaktadır.

Giriş

Miyokard enfarktüsü (MI) dünya çapında ağır bir hastalıktır. Kardiyovasküler hastalıklar (CVD' ler) dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve 20191,2'de yaklaşık 18,6 milyon ölüme neden olmaktadır. CvD'lerin toplam mortalitesi son yarım yüzyıl içinde azaldı. Bununla birlikte, bu eğilim bazı gelişmemiş ülkelerde yavaşlatıldı ve hatta tersine çevrildi1, bu da CVD'lerin daha etkili tedavilerini gerektiriyor. CVD'nin ölümcül tezahürlerinden biri olarak MI, Amerika Birleşik Devletleri'ndeki CVD'lere atfedilen tüm ölümlerin yaklaşık yarısını oluşturmaktadır2. İskemi sırasında, koroner arterlerin bloke edilmesi ve hem besin hem de oksijenin sınırlı tedariki ile miyokard ciddi metabolik değişikliklere uğrar, kardiyomiyositlerin (CM' ler) sistolik işlevini bozar ve CM ölümüne yol açar3. Kalp yaralanmasını onarmak ve yaralı kalbin işlevini geri kazandırmak için kardiyovasküler araştırmalarda çok sayıda yaklaşım araştırıldı4. Doğrudan kardiyak yeniden programlama, hasarlı kalbi onarmak ve işlevini geri kazandırmak için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır5,6. Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT) tanıtılarak fibroblastlar iCM'lere in vitro ve in vivo olarak yeniden programlanabilir ve bu iCM'ler yara bölgesini azaltabilir ve kalp fonksiyonunu iyileştirebilir7,8.

Kardiyak yeniden programlama MI tedavisi için umut verici bir strateji olsa da, bir dizi zorluk devam etmektedir. İlk olarak, yeniden programlama verimliliği, saflığı ve kalitesi her zaman beklendiği kadar yüksek değildir. MGT indüksiyonu, in vitro7'deki iCM'lere yeniden programlanacak toplam CF'lerin sadece% 8.4'ünü (cTnT+) veya% 24.7'sini (αMHC-GFP +) veya uygulamasını sınırlayan% 35'e kadar in vivo8 elde edebilir. Hand29 veya Akt1/PKB10 gibi sistemde daha fazla faktör indüklenmiş olsa bile, yeniden programlama verimliliği klinik bir ortamda kullanılmak üzere hala tatmin edici değildir. Bu nedenle, bu alanda yeniden programlama verimliliğini artırmaya odaklanan daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır. İkincisi, iCM'lerin elektrik bütünlüğü ve kasılma özellikleri kalp fonksiyonunun verimli bir şekilde iyileştirilmesi için önemlidir, ancak bunların değerlendirilmesi zordur. Şu anda, bazı önemli CD genlerinin ekspresyonunun akış sitometrisi, immünositokimya ve qPCR dahil olmak üzere alanda yaygın olarak kullanılan değerlendirme yöntemleri, iCM'lerin ve CD'lerin benzerliğine odaklanmıştır, ancak iCM'lerin fonksiyonel özellikleriyle doğrudan ilişkili değildir. Ayrıca, bu yöntemler nispeten karmaşık prosedürlere sahiptir ve zaman alıcıdır. Yeniden programlama çalışmaları genellikle iCM'lerin olgunlaşmasını teşvik eden potansiyel yeniden programlama faktörlerinin taranması içerir11, kardiyak yeniden programlama iCMs işlevine dayalı hızlı ve kullanışlı bir yöntem gerektirir.

CD'ler, her büzülme döngüsü sırasında sitomembran üzerindeki voltaj kapılı kalsiyum iyon kanallarını açar ve bu da miyofilament kasılmasına katılmak için hücreler arası sıvıdan sitoplazmaya geçici bir kalsiyum iyonu (Ca2+) akınına yol açar. Böyle bir Ca2+ akını ve dış döngü miyokard kasılmasının temel özelliğidir ve CMs12'nin normal işlevini oluşturur. Bu nedenle, Ca2+ akınını algılayan bir yöntem, iCM'ler de dahil olmak üzere CD'lerin ve CM benzeri hücrelerin işlevini ölçmenin potansiyel bir yolu olabilir. Ayrıca, iCM'ler için, böyle bir yöntem yeniden programlama verimliliğini değerlendirmek için başka bir yol sağlar.

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) geliştirilmiş ve başta eylem potansiyelleri olmak üzere hücre aktivitelerini belirtmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Genellikle, GECI'ler calmodulin gibi bir Ca2+ bağlama etki alanından ve GFP gibi floresan bir etki alanından oluşur ve GCaMP3 yüksek benzeşim ve floresan yoğunluğuna sahip bir etki alanıdır. GCaMP3'ün floresan etki alanı, lokal kalsiyum konsantrasyonu değiştiğinde etkinleştirilecektir13. Bu makalede, Myh6+ hücrelerinde özellikle bir GCaMP3 muhabirini ifade eden bir fare suşu açıklanmıştır. MGT'yi bu türün yenidoğanlarından izole edilmiş NCF'lere tanıtarak, yeniden programlama, başarılı bir şekilde yeniden programlanan iCM'lerin sergileyeceği floresan ile izlenebilir. Böyle bir fare zorlanması ve yöntemi, kardiyak yeniden programlamayı araştırmak için değerli bir platform sağlayacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler ve uygulamalar Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı. Hücre kültürünü içeren tüm deneysel prosedürler ve uygulamalar steril koşullarda BSL2 Biyolojik Güvenlik Kabini yapılmalıdır. Virüslerle ilgili prosedürler ve uygulamalar için, çevresel ve sağlık açısından tehlike riskini önlemek için transfected hücrelerin, pipet uçlarının ve tüplerin uygun şekilde bertaraf edilmesi kılavuzuna uyulur.

1. Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) fare suşu (Şekil 1)

  1. Sırasıyla Tg(Myh6-cre)1Jmk/J fare suşu (Myh6-Cre olarak adlandırılan Jackson laboratuvar stok 009074) ve Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J fare suşu (Jackson laboratuvar stok 014538, Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 olarak adlandırılır) hazırlayın.
  2. Sırasıyla yetişkin Myh6-Cre ve Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fareleri elde etmek için her bir suş 8 haftalık kadar yetiştirin.
  3. Yetişkin Myh6-Cre ve Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 farelerini melezledi.
    NOT: Myh6-Cre erkek / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 kadın veya tam tersi ayarlayın. Torunları arasında önemli bir fark yoktur. Tipik olarak, dişi fareler melezlemeden 19-21 gün sonra 8-10 yavru doğurur.

2. Yenidoğan Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare kalplerinin izolasyonu ve seçimi.

  1. P0-P2 yavruları alın. Bu protokolle 10 milyon NCF'yi izole etmek için 8-10 yavrunun bulunduğundan emin olun.
  2. Yavruları hipotermi ile derinden uyuşturdum. Yavruları lateks eldivene yerleştirin ve boynuna kadar ezilmiş buz ve suya (2°C - 3°C) daldırin.
  3. Yavruları kısaca% 75 etanol ile sterilize edin.
  4. Kısır makasla kafalarını keserek yavruları kurban edin.
  5. Kalbin yakınında yatay bir kesi yapın, kalbi sıkın ve ardından aortu kökünden makasla ayırarak izole edin.
  6. Floresan mikroskop altında kalbin atışını gözlemleyin. Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 genotipi ile kalplerin GCaMP3 tarafından kalp atışlarıyla gösterilen Ca2+ akısını gösterdiğine emin olun. Diğer genotipler floresan göstermez (Şekil 2, Video 1 ve Video 2).

3. Yenidoğan kardiyak fibroblastların (NCF'ler) izolasyonu

NOT: Bu bölüm için, Dr. Li Qian's Lab14 protokolü, bu çalışmaya uygun olduğunda küçük optimizasyonlarla benimsenmiştir.

  1. αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 kalplerinin izolasyonundan sonra, gevşek bir şekilde bağlı olan dört parçaya bölün. İzole hücrelerdeki kan hücresi kirliliğini sınırlamak için onları buz gibi DPBS'de 6 cm'lik bir plakada birkaç kez iyice yıkayın.
  2. Kalpleri 15 mL konik bir tüpe aktarın.
  3. 10 dakika boyunca 37 °C'de 8 mL sıcak % 0.25 Trypsin-EDTA ile kalpleri sindirin.
  4. Tripsin süpernatantı atın ve HBSS'ye 5 mL sıcak tip-II kollajenaz (0,5 mg/mL) ekleyin.
  5. Karışımı iyice girdaplayın ve 5 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  6. Kuluçkadan sonra, iyice girdap ve sindirilmemiş dokunun yerçekimi ile yerleşmesine izin verin.
  7. Süpernatantı 5 mL soğuk fibroblast (FB) orta (%20 FBS ve %1 penisilin/streptomisin içeren IMDM) ile 15 mL konik tüpte toplayın.
  8. Sindirilmemiş doku için 3.4-3.7 adımlarını 4-5 kez tekrarlayın.
  9. Tüm süpernatantı bir araya toplayın ve süpernatantı 40 μm süzgeçle filtreleyin.
  10. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
  11. Hücreleri 10 mL Manyetik aktive hücre sıralama tamponunda (MACS arabelleği; 2 mM EDTA ve% 0,5 BSA ile 1x PBS) yeniden biriktirin.
  12. Trypan mavi boyama ile uygun hücre numarasını belirleyin.
    1. Adım 3.11'de 10 mL hücre süspansiyonundan 10 μL hücre alın.
    2. 10 μL%0,4 trypan mavi çözelti ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Karışımı bir hemositometreye ekleyin ve uygun hücre numarasını belirleyin. Ölü hücreler maviye boyanırken, canlı hücreler lekesizdir.
  13. Hücreleri 200 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın.
  14. 10 milyondan az canlı hücre için 90 μL soğutulmuş MACS tamponunda 10 μL Thy1.2 mikrobead ile hücreleri yeniden biriktirin. 10 milyondan fazla canlı hücre varsa orantılı olarak daha fazla boncuk ekleyin. Karışımı iyice pipetleyin ve 30-60 dakika boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  15. 10 mL MACS tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.
  16. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj, süpernatantı atın.
  17. 3.15-3.16 arası adımları bir kez yineleyin.
  18. Hücreleri ve boncukları 2 mL MACS arabelleği ile yeniden biriktirin.
  19. Kaputa bir MACS ayırıcısı kurun. Ayırıcıya bir LS sütunu yerleştirin ve sütunu 3 mL MACS arabelleği ile dengelayın.
  20. LS sütunu dengelendiğinde, hücreleri sütundan geçirin.
  21. LS sütununu 2 mL MACS arabelleği ile üç kez yıkayın.
  22. Sütunu ayırıcıdan alın, üç kez 2 mL MACS tamponu ile elüte edin ve ardından elution'ı 50 mL'lik bir tüpe toplayın.
  23. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.
  24. Hücreleri 5 mL FB ortamla yeniden biriktirin.
  25. Hemositometre ile hücre numarasını belirleyin.
  26. Hücreleri FB ortamı ile seyreltin ve hücreleri istediğiniz gibi tabaklara veya tabaklara tohumlayın. Hücre tohumlama yoğunluğunun 2-2,5 x 104 hücre/cm2 civarında olduğundan emin olun (yoğunluğu bireysel deneylere göre optimize edin). Ekli fibroblastların tohumlamadan sonraki ikinci günde ovalden yuvarlak şekle sahip olduğundan emin olun (Şekil 3).

4. Kardiyak yeniden programlama için retrovirüs kodlama polisistronik MGT vektör üretimi

  1. Plat-E'yi 37 °C'de %5 CO2 ile Plat-E kültür ortamı (%10 FBS, 1 μg/mL puromycin ve 10 μg/mL blasticidin ile desteklenmiş DMEM) ile koruyun.
  2. 1. günde, Plat-E'yi yaklaşık 4-5 x 105 hücre / kuyu yoğunluğunda 6 kuyulu bir tabağa bölün.
  3. 2. günde, Plat-E genellikle% 80 izdiah eder. Hücreleri aşağıdaki yordamlarla transfect. Burada bulunan her elemanın hacmini ve miktarını 6 kuyulu bir plakadaki her kuyuya göre ayarlayın.
    1. 2 μg pMX-puro-MGT polisistronik retrovirüs ekspresyon plazmid vektörünü (Addgene 111809) TE tamponu ile 500 ng/μL'ye seyreltin.
    2. 10 μL Lipofectamin'i 150 μL azaltılmış serum ortamı ile karıştırarak transfeksiyon karışımını hazırlayın. İyice karıştırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatmak için dikkatlice pipet. Pipetleme yaparken kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin.
    3. Bu arada, plazmidi 150 μL azaltılmış serum ortamı ile karıştırarak bir plazmid karışımı hazırlayın. İyice karıştırmak ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatmak için dikkatlice pipet. Pipetleme yaparken kabarcıklardan kaçınmaya dikkat edin.
    4. İki karışımı dikkatlice karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın. Çözüm bulutlu görünebilir.
    5. Karışımı transfected olacak hücrelere damla damla ekleyin.
    6. Hücreleri bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
  4. 3. günde, ortamı puromycin ve blasticidin eksikliği olan taze bir tam hücre kültürü ortamına değiştirin.
  5. Transfectiondan 4, 48 saat sonra, retrovirüs içeren süpernatant toplayın ve 4 ° C'de saklayın.
  6. Transfectiondan 5, 72 saat sonra, retrovirüs içeren süpernatant toplayın.
  7. 48 h ve 72 h süpernatantı 0,45 μm filtre ile filtreleyin, %8 PEG'lik son konsantrasyonu yapmak için %40 Poli (etilen glikol) (PEG) çözeltisinin 1/5 hacmini ekleyerek 4 °C'de bir gecede çökelin.
  8. Virüsü çökeltmek için 30 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj.
    NOT: PEG8000-virüs küçük beyaz yağış oluşturur.
  9. İstenildiği gibi 8 μg/mL polibren içeren iCM ortamı ile virüsü yeniden dirildirin. Retrovirüsü hemen kullanın.

5. MGT kodlama retrovirüs enfeksiyonu ile NCF'leri iCM'lere yeniden programlama

  1. Virüs bulaşmadan önce NCF'leri büyütün veya geçiştirin.
    NOT: Genellikle NCF iki kez geçiş yapılabilir.
  2. 0. günde, FB ortamında 1-2 x 104 hücre/cm2 civarındaki yoğunluğa tohum NCF.
  3. 1. günde, kültür ortamını her biri için istenen kadar virüs içeren bir ortamla değiştirin. 24 kuyulu bir tabakta iki kuyuya bulaştırmak için virüsü bir kuyu Plat-E'den 6 kuyulu bir tabakta kullanın. En uygun virüs konsantrasyonu belirlemek için virüsü titret.
    NOT: MGT retrovirüs ile birlikte ilgi çekici diğer yeniden programlama faktörlerini içeren virüsler de tanıtılabilir.
  4. Gece boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatır.
  5. 2. günde, virüs enfeksiyonundan 24 saat sonra, virüs içeren ortamı normal bir iCM ortamına değiştirin.
  6. GCaMP3 ifadesini izlemek için ters floresan mikroskobu altında plakalayın. GFP kanalında 10x'in altında, hücrelerin bir kısmının hafif bazal GCaMP3 floresanını 5.
  7. Yeniden programlama sırasında ortamı her 2-3 günde bir değiştirin. Gerekirse, 3 gün boyunca kültür ortamına 2 μg/mL puromisisin ekleyerek ve 1 μg/mL'de tutarak MGT retrovirüs enfekte hücreleri için pozitif bir seçim gerçekleştirin.
    NOT: Orta değişimle birlikte ilgi çekici kimyasalları (örneğin, IGF-1, MM589, A83-01 ve daha önce bildirdiğimiz gibi IMAP olarak adlandırılan PTC-209) tanıtın.
  8. 14 günlük enfeksiyondan sonra, iCM olgunlaşmasını daha da teşvik etmek için ortamı B27 ortamı ile değiştirin.

6. iCM fonksiyonel olgunlaşma ve yeniden programlama verimliliğinin Ca2+ akı ile değerlendirilmesi

NOT: Gerekirse değerlendirmeden önce değerlendirilecek hücrelere 1 μM izoproterenol ekleyin.

  1. Ca2+ akısını oda sıcaklığında ters floresan mikroskopla değerlendirin.
  2. GFP kanalında, GCaMP3+ hücrelerini 10x hedefi altında gözlemleyin. Parlak alan kanalında spontan hücre çırpma gösterdiğine emin olun.
  3. 20x'in altındaki üç alanı rastgele seçin ve iCM'lerin Ca2+ akısını her alan için 3 dakika boyunca kaydedin.
    NOT: Burada, Ca2+ akısı spontan hücre çırpığı ile senkronize edildi (Şekil 4, Şekil 5 ve Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8).
  4. Hücreleri Ca2+ akı ile manuel olarak ölçün.

7. İstatistiksel analiz ve veri sunumu

  1. Gruplar arasındaki farklılıkları tek yönlü varyans analizi (ANOVA) analiz etmek ve Student-Newman-Keuls çoklu karşılaştırma testlerini gerçekleştirmek.
    NOT: Sonuçlar, istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilen p < 0.05 ile S.E ± ortalamadır. Her deney en az üç kez gerçekleştirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 fare zorlanması ve transgenik farelerin gen yapısını oluşturmak için deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Fare zorlanması kurulurken, yavruların kalpleri izole edildi ve genotipi doğrulamak için ters floresan mikroskop altında gözlemlendi. Doğru genotipli kalpler Ca2+ akıyı atmakla senkronize eder, GCaMP3 floresan olarak görselleştirilirken, kontrol kalplerinde floresan gözlenmedi (Şekil ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Kardiyak yeniden programlama alanı için iCM'lerin değerlendirilmesi gereklidir. Bu yazıda, protokolde bir Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J fare suşu, iCM'lere yeniden programlama için yenidoğan farelerden izole edilen NCF'lerin bu suşta nasıl kullanılacağı ve iCM işlevinin Ca2+ fluks tarafından değerlendirilmesi açıklanmaktadır. Bu, iCM'lerin fonksiyonel olgunlaşmasını değerlendirmek için bir de novo yöntemidir.

Bu y?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Leo Gnatovskiy'nin bu makalenin İngilizce metnini düzenleme çabalarını takdir ediyoruz. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu çalışma, Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından Dr. Wang'a verilen hibe (1R01HL109054) tarafından desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-70C
50mL Conical Centrifuge TubesThermo Fisher Scientific14-959-49A
6 Well Cell Culture PlatesAlkali ScientificTP9006
A83-01Stemgent04–0014
All-in-One Fluorescence MicroscopeKeyenceBZ-X800EInverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum freeThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)Thermo Fisher ScientificA1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free PowderThermo Fisher ScientificBP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2Thermo Fisher ScientificNC9693955
Counting ChamberThermo Fisher Scientific02-671-51BHemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamineThermo Fisher Scientific11960069
DPBS, calcium, magnesiumThermo Fisher Scientific14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)Thermo Fisher Scientific04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)Thermo Fisher ScientificE478-500
Fetal Bovine SerumCorning35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol redThermo Fisher Scientific14025092
IMDM mediaThermo Fisher Scientific12440053
IX73 Inverted MicroscopeOlympusIX73P2FInverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11-668-019
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
Medium 199, Earle's SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS Separator and Starting KitsMiltenyi Biotec130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilizedMillipore SigmaSLHV033RB
MM589Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31-985-070
PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell LineCell BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
Poly(ethylene glycol)Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
Polybrene Infection / Transfection ReagentMillipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143–5MG
Puromycin DihydrochlorideThermo Fisher ScientificA1113803
Recombinant Human IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093
ST 16 Centrifuge SeriesThermo Fisher Scientific75-004-381
Sterile Cell StrainersThermo Fisher Scientific22-363-54740 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture DishesThermo Fisher ScientificFB012921
TE BufferThermo Fisher Scientific12090015
Trypan Blue solutionMillipore SigmaT8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher Scientific25300054
Vortex MixerThermo Fisher Scientific02215365

Referanslar

  1. Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
  2. Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
  3. Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).
  4. Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
  5. Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
  6. Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
  7. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  8. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  11. Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036(2016).
  12. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  13. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  14. Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426(2015).
  15. Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  17. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  18. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  19. Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505(2011).
  20. Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır