UV Radyasyonu ve Kimyasallarının Primer ve Ölümsüzleştirilmiş İnsan Kornea Epitel Hücreleri Üzerindeki Toksisitesinin Belirlenmesi

Özet

Bu makalede, birincil ve ölümsüzleştirilmiş bir hücre hattında UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır.

Özet

Bu makalede, primer (pHCEC) ve ölümsüzleştirilmiş (iHCEC) insan kornea epitel hücre kültürleri üzerinde ultraviyole (UV) radyasyon ve oküler toksinlerin toksisitesini ölçme yöntemleri açıklanmaktadır. Hücreler UV radyasyonuna ve toksik dozlarda benzalkonyum klorür (BAK), hidrojen peroksit (_H2O2) ve sodyum dodesil sülfat (SDS) dozlarına maruz bırakıldı. Metabolik aktivite metabolik bir tahlil kullanılarak ölçüldü. İnflamatuar sitokinlerin salınımı multipleks interlökin (IL)-1β, IL-6, IL-8 ve tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) testi kullanılarak ölçüldü ve hücreler floresan boyalar kullanılarak canlılık açısından değerlendirildi.

UV'nin hücre metabolik aktivitesi ve sitokin salınımı üzerindeki zararlı etkileri, iHCEC için 5 dakika UV maruziyetinde ve pHCEC için 20 dakika UV maruziyetinde meydana gelmiştir. İHCEC ve pHCEC'in metabolik aktivitesindeki benzer yüzde düşüşleri, BAK, H2_O2veya SDS'ye maruz kaldıktan sonra meydana geldi ve sitokin salınımındaki en önemli değişiklikler IL-6 ve IL-8 için meydana geldi. Floresan olarak boyanmış iHCEC ve pHCEC BAK'a maruz kalan hücrelerin mikroskopisi,% 0.005 BAK maruziyetinde hücre ölümü gösterdi, ancak iHCEC'lerde etidyum boyama derecesi pHCEC'lerden daha büyüktü. Mikroskopi kullanarak toksik etkileri değerlendirmek, metabolik aktivitenin değerlendirilmesi ve sitokin üretimi için birçok yöntem kullanılarak, UV radyasyonunun ve kimyasal toksinlerin toksisitesi hem birincil hem de ölümsüzleştirilmiş hücre hatları için belirlenebilir.

Giriş

Hücrelere zarar verebilecek kimyasalların ve diğer ajanların toksik etkilerini tahmin etmek için in vitro toksikoloji çalışmaları yapılmaktadır. Korneaya toksisitenin değerlendirilmesinde, insan kornea epitel hücreleri (HCEC'ler) bu etkilerin değerlendirilmesi için modellerde kullanılmıştır 1,2,3,4. Bu modeller tipik olarak hücrenin metabolik aktivitesindeki değişiklikler, hücre proliferasyonu ve enflamatuar sitokinlerin üretimi ve salınımı gibi diğer hücre fonksiyonları gibi fizyolojik etkileri değerlendirir. Bu toksikoloji çalışma....

Protokol

1. pHCEC'lerin ve iHCEC'lerin kültürü

1. İnsan oküler epitel besiyerinde (HOEM) pHCEC'leri ve iHCEC'leri aşağıdaki takviyelerle büyütün: 6 mM L-glutamin,% 0.002 hücre ortamı takviyesi O (Malzeme Tablosu), 1.0 μM epinefrin,% 0.4 hücre ortamı takviyesi P (Malzeme Tablosu), 5 μg / mL rh insülin, 5 μg / mL apo-transferrin ve kollajen-1 kaplı kültür şişelerinde 100 ng / mL hidrokortizon hemisuksinat (75^cm2 kültür şişesinde 18 mL).
2. Şişelerdeki ortamı her 2-3 günde bir, hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştıktan sonra ortamı çıkararak değiştirin. Fenol kırmızısı olmadan ayrışma çözeltisi ekleyin ve hücreler tamamen ayrı....

Sonuçlar

Hücre boyutu
Birincil ve ölümsüzleştirilmiş HCEC'ler, hücre canlılığının üç farklı aşamasını yansıtan üç floresan boya ile görselleştirildi. Canlı hücreler yeşildir (kalsein-), ölü hücreler kırmızıdır (ethidium homodimer-1) ve apoptotik hücreler sarıdır (floresan sinyalinin daha iyi görselleştirilmesi için ek V-bilgisayar ayarlı renk). Canlı hücreler, hücre sitoplazmasında esterazlar içerir ve kalsein-'yi kalseine dönüştürür. Ölü hücreler, ethidium .......

Tartışmalar

İki tip HCEC'in kullanımındaki potansiyel farklılıklar değerlendirildi. Hücreler aynı ortama (HOEM) aynı hücre konsantrasyonlarında yerleştirildi ve daha sonra kısa ve uzun süreli UV radyasyonuna ve üç oküler toksine maruz bırakıldı. UV radyasyonu ve kimyasalların dozları, karşılaştırılabilecek ara tepkiler üretmek için hücrelere yeterince zarar veren fizyolojik etkilerine dayanarak seçildi. UV radyasyonu için 5 ve 20 dakika ve seçilen BAK (% 0.001), SDS (% 0.0025) ve H2_O2(% 0........

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
75 cm2 Vented Flask	Corning	354485	This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate	costar	3370
alamarBlue	Fisher Scientific	dal 1025
Annexin Staining buffer solution	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system	Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates	Corning	354505	This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5	BioTek	CYT5MPV	Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum	Hycone	SH30396.03
glass bottom coverslips	MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells	University of Ottawa	N/A	SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements:	Millipore, Billerica, MA, USA	SCMC001	Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer	Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument	Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay	Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140-122	100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells	Millipore, Billerica, MA, USA	SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution)	Fisher Scientific	12605036