Alerjen Gücü için Okuma Olarak İnsanlaştırılmış Arabulucu Sürümü Tahlil

Özet

Burada, tipik olarak tip 1 alerjik reaksiyonlarda gözlenen efektör hücrelerin degranülasyonunu simüle etmek için insan IgE reseptörü ile transfected bir sıçan bazofilik lösemi hücre hattı kullanarak mediatör salınım testini sunuyoruz. Bu yöntem, alerjenlerin biyolojik aktivitesini son derece hassas, tekrarlanabilir ve uyarlanabilir bir şekilde araştırır.

Özet

Mediator salınım tahlilleri in vitro immünoglobulin E (IgE)- aracılı degranülasyonu ve mast hücreleri ve bazofiller gibi efektör hücreler tarafından, putatif alerjenlerin seri seyreltmeleri ile uyarılma üzerine sektirme analiz eder. Bu nedenle, bu tahliller, duyarlı hastalarda veya cilt iğnesi testlerinde alerjen maruziyeti üzerine ortaya çıkan in vivo degranülasyon sürecini taklit eden önemli bir aracı temsil eder. Ek olarak, bu tahliller genellikle proteinlerin alerjenik potansiyelini ve hastaların sera reaktivitesinin reaktivitesini araştırmak için kullanılır. Burada, insan yüksek benzeşimi IgE plazma-membran reseptörü (FcφRI) ile transfected ve insanlaştırılmış ölümsüzleştirilmiş bir sıçan bazofil lösemi hücre hattı kullanarak basit bir 2 günlük protokolü açıklıyoruz. Mediator salınım testinin bu varyantı, antijeni katı matrislere hareketsiz hale getirmek için gerek kalmadan sağlam, hassas ve tekrarlanabilir bir in vitro hücre tabanlı sistemdir. Protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) insan serasının inaktivasyonunu tamamlamak, (2) hücrelerin toplanması, tohumlanması ve pasif duyarlılığı, (3) arabulucu salınımına neden olmak için antijen ile uyarılması ve (4) histamin gibi serbest bırakılan enflamatuar mediatörler için taşıyıcı olarak β-heksazanidaz aktivitesinin ölçülmesi. Test, hücre degranülasyonunu tetiklemek için alerjen-IgE çapraz bağlama kapasitesini değerlendirmek için yararlı bir aracı temsil eder ve alerjen özlerini standartlaştırmak için uygulanabilir, hastaların reaktivitesini küçük veya majör alerjenlerle ve alerjenik özlerle (polen, kedi dander, vb.) karşılaştırmak, alerjen homologlarının, izoformların ve kat-varyantlarının (örneğin hipoalerjeniklik) gücünü ve ligandların alerjenik aktivite üzerindeki etkilerini araştırmak. Daha yeni bir uygulama, alerjen immünoterapisi boyunca tedavi etkinliğini izlemek için test kullanımını içerir.

Giriş

İlgili bir antijene özgü Immunoglobulin E (IgE) üretimi ile karakterize tip I aşırı duyarlılık reaksiyonları, dünya nüfusunun yaklaşık üçte birini etkiler. Bu reaksiyonlar astım ve rinokonjonktivit gibi çeşitli alerjik belirtilerle ilişkilidir ve hatta sistemik yaşamı tehdit eden reaksiyonlara yol açabilir¹. In vivo testlerin aksine, enzime bağlı immünorbent testi (ELISA) gibi immünokimyasal yaklaşımlar sadece antikorların hedef bağlanmasını araştırmak için uygundur, ancak proteinlerin hemen aşırı duyarlılık reaksiyonlarına neden olabilecek fonksiyonel yönünü ele almaz. Alerjenlerin katı desteklerde (örneğin ELISA plakaları) hareketsiz hale getirilmesi yapısal bütünlüklerinde değişikliklere ve alerji ile ilgili epitopların tahrip olmasına neden olabilir². Bazı alerjenlere karşı duyarlılığı doğrulamak için en yaygın araç olan cilt dikeni testlerinin bile (SPT), semptomatik IgE aracılı gıda alerjisinin veya alerjen kullanılabilirliğinin tespiti ile ilgili sınırları vardır^3,4. Alerjenlerin biyolojik gücünü test etmek için etik, son derece spesifik, hassas ve uygun maliyetli bir yöntem bulmak için, bir tip I aşırı duyarlılık reaksiyonuna neden olmak için, sözde arabulucu salınım tahlilleri oluşturulmuştur.

Bu tahlillerin prensibi, duyarlılık evresini takip eden olaylara ve IgE'nin mast hücreleri ve bazofiller gibi efektör hücrelerin yüzeyinde ifade edilen yüksek benzeşimli reseptörlerin α zincirine bağlanma yeteneğine dayanır. IgE esas olarak mukozal ilişkili lenfoid dokudaki plazma hücreleri tarafından üretilir. Kandaki en az bol immünoglobulin olmasına rağmen (atopik olmayan bireylerde yaklaşık% 0.05), alerjik semptomların ana nedeni olan olağanüstü yüksek bir biyolojik aktiviteye sahiptir. IgE'nin yarı ömrü, efektör hücreler üzerindeki reseptörlerine bağlandığında 2-3 günden birkaç haftaya ve hatta aya kadar artabilir. Bir antijenin daha sonra iki reseptöre bağlı IgE molekülünün değişken bölgesine bağlanması, çapraz bağlamalarına ve ardından efektör hücrede degranülasyona yol açan aşağı akış sinyal basamaklarının indüksiyonuna ve vazodilasyona neden olan birkaç pro-enflamatuar mediatörün salınmasına yol açar, histamin, serine proteazlar (örneğin, triptaz) ve prostaglandinler^5,6^,7gibi. Interlökin 4 (IL-4) ve IL-13 gibi sitokinlerin salgılanması, enflamatuar T yardımcı 2 (Th2) yanıtının sürdürülmesinden ve B hücrelerinin IgE üreten plazma hücrelerine sınıf geçişinden^{sorumludur 5,8,9}. Öte yandan, salınan tromromksan bronkokonstriksiyona neden olur ve lökotrienler düz kas kasılmasının yanı sıra damar kaçağını uyarır ve astım veya alerjik rinite yol açan hava yolu iltihabında önemli bir rol oynar^10,11.

Yukarıda belirtilen arabulucuların çoğunu analiz etmek için araştırma araçları, bazı büyük dezavantajları olmasına rağmen kurulmuştur. Triptaz tahlilleri mast hücre aktivasyonu yoluyla sistemik anafilaksi ölçümü için uygun klinik yaklaşımlardır ancak alerji tanılarındaki duyarlılıkları ve özgüllükleri SPT gibi altın standart yöntemlere göre çok yanlıştır. Öte yandan, sisteinil lökotrien tahlilleri β-laktamlara veya nonsteroidal antienflamatuar ilaçlara alerji tanısı koyamadı¹². Alerjik reaksiyonlarda salınan önemli bir arabulucu olarak histamin ölçümü için protokoller 1960'larda zaten belirlenmiştir. Periferik kanda salındıktan sonra, histamin metiltransfeazlar tarafından hemen bozulur ve sadece birkaç dakikalık bir plazma yarı ömrü ile sonuçlanır, bu da analizini oldukça zor hale getirir¹³. kararsızlığının yanı sıra, histamin izlenmesinin ilaç alerjilerinin yanı sıra ticari gıda proteinleri ve yaban arısı zehirleri için düşük özgüllüğe ve hassasiyete sahip olduğu gösterilmiştir¹².

İntrofik hücre hatlarına sahip in vitro modeller, salınım tahlillerini gerçekleştirmek için alerjik hastalardan bazofillerin doğum yoğun izolasyon ve ekim prosedürlerine alternatif olarak tanıtılmıştır. Bu nedenle, RBL-2H3 hücre hattını kullanan sıçan bazofilik lösemi - (RBL-) bazlı tahlil³kurulmuştur. Bu hücre hattı insan IgE'yi bağlama yeteneğine sahip olmadığından, ilk olarak insan IgE plazma-membran reseptörünün (FCφRI) α, β ve γ zinciri ile transktrid edildi. RBL-30/25 klonunun in vitro test için en umut verici aday olarak ortaya çıktığı insan α zincirinin ekspresyon seviyeleri ve homojenliği için çeşitli klonlar oluşturulmuş ve test edilmiştir. Transfected klonun reseptör aktivasyonu üzerine indüklenen sinyal basamaklı kalsiyum mobilizasyon testleri ile test edildi. Degranülasyon için bir gösterge ve histamin salınımı için taşıyıcı olarak, daha yüksek stabilitenin önemli avantajına sahip olan lizozomal enzim β-hexosaminidaz ölçüldü¹⁴. RBL-30/25 hücreleri kullanılarak yapılan arabulucu salınımı %100'e kadar ulaşır ve bu nedenle alerjik hastalardan elde edilen serayı test etmek için kullanılır. Test, ticari alerjen özleri ile hassaslaştırılmış hücrelere meydan okuduktan sonra arabulucu salınımı için test edildi. Bu, farklı üreticilerden elde edilen ve tanılama (örneğin, SPT) veya terapötik yaklaşımlar 3^,15 ,¹⁶için kullanılan alerjen özlerinin bileşiminde (toplam protein içeriğine göre⁶⁰kata kadar) muazzam bir varyasyon olduğunun^bulunmasınayol açtı.

Burada, alerjik donörlerden serum kullanarak arabulucu salınımı testini gerçekleştirmek için RBL protokolünün ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz. Pasif duyarlılık sırasında serumdaki IgE, bazofilik hücrelerin yüzeyinde ifade edilen yüksek benzeşim fcφR1 reseptörü tarafından yakalanır. Antijen stimülasyonu üzerine, antijene özgü bağlı IgE'ler çapraz bağlanır, hücre degranülasyonunu ve arabulucu β-heksazinindazının salınımını tetikler. β-hexosaminidaz aktivitesi daha sonra uygun bir substrat kullanılarak ölçülür. Tahlil için huRBL-2H3 hücreleri kullanıldı ve aşağıdaki protokolde huRBL olarak ad verildi. Protokol, 1 μg/mL ile 0,1 pg/mL alerjen arasında değişen 8 adım seyreltilmiş 1:10 ile standart bir antijen seyreltme serisini tanımlar.

Protokol

Huş poleni alerjik hastalardan elde edilen sera kullanımına etik onay Hollanda etik komitesinden alınmıştır (onay numarası: NL65758.018.18).

1. Güvenlik prosedürleri

1. Deneyin ilk günü boyunca biyolojik güvenlik sınıfı 2 tezgahı kullanarak steril koşullar altında çalışın (Biyogüvenlik Seviye 2). İnsan serumu kullanımı için kurumun güvenlik yönergelerine uyun.

2. İnsan serasının tamamlayıcı inaktivasyonu

1. Hücre kültürü şişesinden yoğun bir P3X63Ag8.653 hücresi (bundan böyle Ag8 hücreleri olarak addedilir) toplayın ve bunları bir santrifüj tüpüne aktarın.
   1. Bu hücreler için aşağıdaki kültür ortamını kullanın: Azaltılmış serum konsantrasyonuna sahip Modifiye Kartalların Minimum Esansiyel Ortamı, %1 Penisilin-Streptomisin (100 birim Pen., 0.1 mg/mL Strep.), %5 ısı inaktive fetal baldır/sığır serumu (FCSi).
2. Oda sıcaklığında 250 x g'da 5 dakika boyunca Santrifüj Ag8 hücreleri.
3. Hücre peletini huRBL ortamında yaklaşık 1 x 10⁶ hücre/mL'lik son konsantrasyona yeniden askıya alın (Alfa Modifikasyonlu Minimum Esansiyel Orta Kartal, 4 mM L-Glutamin, %5 FCSi, %1 G418 (%100 stok: 10 g/125 mL dH₂O).
   NOT: Ag8 hücrelerini ileride kullanmak üzere geçirerek koruyun.
4. Ag8 hücre süspansiyonunda insan sera 1:10'unda seyreltin. Testteki son serum seyreltme 1:20 olacak.
   NOT: Düşük spesifik IgE'ye sahip sera için 1:5 (1:10 son seyreltme) kullanılabilir.
5. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın ve %5-%7 CO_2.

3. HuRBL hücrelerinin toplanması ve tohumlması

1. Ortamı bir T-75 hücre kültürü şişesinden huRBL hücrelerine dokunmadan dikkatlice epire edin (huRBL hücreleri yapışır). Hücrelerin %50-%90 civarında birleştiğine emin olun.
   NOT: Hücre birleşmesi bağlı olarak, yoğun bir T-75 hücre kültürü şişesinin hücre içeriği genellikle bir ila iki 96 kuyu plakası için yeterlidir.
2. Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininin (DPBS) 10 mL'lik kısmını ekleyerek hücreleri iki kez yıkayın. DPBS'yi doğrudan hücrelere değil, şişenin karşı tarafına ekleyin.
3. DPBS'yi aspire edin ve hücre müfrezesi için önceden ısıtılmış 1x tripsin-EDTA (%0,05/%0,02 DPBS'de seyreltilmiş EDTA) ekleyin.
4. Şişeyi 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
5. Şişeye dikkatlice dokunarak hücreleri ayırın.
6. Hücre süspansiyonunu 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve tripsin-EDTA'yı seyreltmek için huRBL orta veya DPBS ile doldurun.
7. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüj edin.
8. Süpernatantı aspire edin ve peletin hücre sayımı için 5 mL huRBL ortamında yeniden dirildi.
9. Hücreleri sayın ve 2 x 10⁶ hücre / mL'lik son bir konsantrasyon elde etmek için huRBL ortamında seyreltin.
10. Steril bir 96 kuyu plakası kullanın ve kuyu başına 1 x 10 5 hücreye / kuyuya eşdeğer^{50 μL} huRBL hücre süspansiyonu ekleyin.

4. HuRBL hücrelerinin pasif duyarlılığı

1. Önceden inkübe ag8 / serum süspansiyonu 250 x g'da5 dakika santrifüj.
2. Ag8 hücre peletini bozmadan, santrifüjlü Ag8/serum süspansiyonunun 50 μL'lik kısmını huRBL hücrelerini içeren her kuyuya aktarın.
   1. Hassaslaştırılmış, ancak uyarılmamış hücreler (antijen eklemeyin) alt sinyal platosu / arka plan için bir gösterge görevi gören antijen olmayan kontrolü ekleyin. Arka plan ve maksimum lizis kontrol kuyularının serum ile hassaslaştırılmasına gerek yoktur. Bunun yerine kuyuları kontrol etmek için 50 μL huRBL ortam ekleyin.
3. Plakayı kapakla örtün ve 37 °C ve%5-%7 CO_2'degece boyunca kuluçkaya yatırın.

5. Antijen uyarılmış degranülasyon ve arabulucu salınımı

1. Antijen seyreltmesini önceden 1x Tirot tamponunda (9,5 g/L Tyrode'un tuzları, %0,1 sığır serum albümini (BSA), 0,5 g/L Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO₃₎dH₂O'da) hazırlayın. Kuyu başına son bir miktar 100 μL gereklidir.
   NOT: Doğal kaynaklardan arındırılmış veya rekombinant olarak üretilen her alerjen 1x Tyrode tamponunda stabil olmayabilir. Bu nedenle, test işlemi öncesinde 1x Tyrode tamponunda stabilite testleri yapın. Alternatif olarak, 1x Tyrode'un tamponu döteryum oksitte (D₂O) seyrelterek testlerin sinyal-gürültü oranını artırın.
2. 10 veya 1 μg / mL protein ile başlayan reaksiyon tüplerinde 1:10 seyreltme serisinin ilgi antijeninin 8 seyreltilmesini yapın.
   NOT: Seyreltme serisini her zaman önceden test edin. Alternatif olarak, 1:10 seyreltme serisini (örneğin, 1:5, 1:20 veya 1:30) tam serbest bırakma eğrisini kapsayacak şekilde uyarla. Ek olarak, başlangıç konsantrasyonu deneysel kuruluma bağlı olarak değişebilir.
3. 96 kuyu plakasına kaplanmış huRBL hücrelerini yıkamak için, emici kağıda dikkatlice aspirasyon yaparak, ters çevirerek ve plakaya dokunarak önce sera içeren hücre ortamını çıkarın.
4. Kuyu başına 200 μL 1x Tyrodes tamponu ile hücreleri yıkayın. Tüm kuyulara benzer şekilde davranin.
   NOT: Yıkama sokunu rahatsız etmemek için hücrelere yavaşça ekleyin.
5. Yaklaşık 30 s'ye bırakın ve yıkama adımını toplamda üç kez tekrarlayın.
6. Yıkama çözeltisini son kez ekledikten sonra, çözeltiyi antijen seyreltme eklemeye devam etmeye hazır olana kadar kuyularda bırakın.
   NOT: Hücreleri çok uzun süre havaya maruz kalmaktan kaçının.
7. Önceden hassaslaştırılmış huRBL hücrelerini içeren her kuyuya 100 μL antijen çözeltisi aktarın.
   NOT: Birkaç farklı parametreyi analiz ediyorsanız, seyreltme serisinin tek tek örneklerini bağlayıcı olmayan ek bir 96 kuyu plakasına aktarın (huRBL plakasındakiyle aynı düzeni kullanın) ve daha sonra doğrudan huRBL hücre plakasına çok kanallı bir pipetle aktarın. Bu şekilde, hücrelerin çok uzun süre havaya maruz kalmaması önlenebilir, bu da zayıf test performansına (daha düşük / sinyalsiz) neden olabilir.
8. 1x Tyrode tamponunun 100 μL'si ile kontrol kuyularını (maksimum lizis ve duyarlı olmayan arka plan hücreleri) örtün. Bu kontrol kuyularını antijen ile uyarmayın.
   1. Ek olarak, veri analizi sırasında hassaslaştırılmış hücrelerin antijenden bağımsız spontan salınımını dikkate almak için gerekli olan seyreltme serisinin hassaslaştırılmış antijensiz kuyularına 1x Tyrode tamponunun 100 μL'sini ekleyin.
9. HuRBL hücrelerini 37 °C'de 1 saat ve %5-%7 CO₂için kuluçkaya yatırın.

6. β-heksazanidaz aktivitesinin floresan ölçümü

1. Maksimum lizis kontrolünün kuyularını kuyu başına % 10 Triton X-100'ün 10 μL'si ile tedavi edin ve hücreleri tamamen lyse etmek ve β-hexosaminidaz'ın% 100 salınımını elde etmek için düzgün bir şekilde karıştırın.
2. Bağlayıcı olmayan yeni bir 96 kuyu plakasına 50 μL substrat çözeltisi ekleyin. Bir 96 kuyu plakası için substrat çözeltisi: 5 mL 0,1 M sitrik test tamponu, pH 4,5; ve 80 μL 10 mM 4-metilumbelliferyl N-asetil-β-D-glukozamininid.
3. Tüm kuyuların 50 μL hücre süpernatantını substrat çözeltisini içeren yeni plakaya aktarın.
   NOT: HuRBL hücrelerini bozmamak için süpernatantı huRBL plakasından dikkatlice kapatın.
4. Florojenik substratın dönüştürülmesine izin vermek için plakayı substrat çözeltisi ve hücre süpernatant ile 37 °C'de 1 saat kuluçkaya bırakın.
   NOT: Hücre canlılığı tahlilleri için huRBL plakasını saklayın.
5. Kuyu başına 100 μL durdurma çözeltisi (15 g/L glisinin, dH₂O'da çözünmüş 11,7 g/L NaCl, pH 10,7) ekleyin.
6. Bir plaka okuyucu kullanarak floresan 360 nm eksitasyon ve 465 nm emisyonda ölçün.

7. Veri analizi

1. Yüzde sürümünün temel hesaplamaları için herhangi bir elektronik tablo yazılımı kullanın.
2. Arka plan çıkarma/taban çizgisi kaldırma için, arka plan kuyularının ortalamasını diğer tüm kuyulardan çıkarın.
3. Maksimum lizis kuyularının ortalamasını hesaplayın ve seyreltme serisinin verilerini yüzde olarak ifade edin. Bu şekilde, verileri hücre lizizinin neden olduğu maksimum enzim salınımı için normalleştirilmiş hücre salınımının bir yüzdesi olarak ifade edebilirsiniz.
4. Tam doz-yanıt mediatör salınım eğrileri, X eksenindeki bir günlükte antijen konsantrasyonu ve Y eksenindeki arabulucu salınımının yüzdesi ile XY grafikleri olarak en iyi şekilde temsil edilir.
5. Arka planı veya alt platoyu belirtmek için antijensiz denetimin değerlerini kesikli bir çizgi olarak ekleyin.
   NOT: Benzer şekilde tedavi edilen birkaç sera, bu normalleşme stratejisi kullanılarak karşılaştırılabilir. Doğrudan karşılaştırma için, eğri başına maksimum ve minimum değerlerin ortalaması olarak tanımlanan yarı maksimum salınım için gerekli antijen konsantrasyonu (ng / mL'de) olan yarı maksimum salınımın hesaplanması önerilir. Yarı maksimal salınımı uyarmak için antijen konsantrasyonu, yarı maksimal salınım değerinin logaritmik bir regresyon hattına enterpolasyonu ile hesaplanır.

Sonuçlar

HuRBL hücrelerine (Şekil 1A ve B)dayanan arabulucu salınım tahlilleri, çan şeklinde bir doz-yanıt eğrisi(Şekil 1C)ile sonuçlanır. Basitleştirilmiş veri gösterimi için, yarım maksimum mediatör salınımı için gerekli antijen konsantrasyonu doğrusal regresyon kullanılarak hesaplanabilir (Şekil 1D). Duyulaştırıcı serumdan veya stimülasyon için kullanılan antijenden elde edilen sitotoksik etkileri dışlamak için bir hücre canlılığı tahlili yapılır (Şekil 1E). Test, belirli bir antijene farklı seranın reaktivitesini test etmek için kullanılabilir. Olgumuzda huş poleni alerjik hastalardan elde edilen 5 seradan 4'ü Bet v 1 stimülasyonuna yanıt verdi. Serum #1 en yüksek arabulucu salınımını gösterdi (Şekil 2). Serum #5, Bet v 1 stimülasyonuna yanıt vermedi ve bu nedenle diğer huş polen alerjenlerine (örneğin, Bet v 2, profilin) tepki verebilir. Bu veriler Bet v 1'in IgE aracılı alerjik semptomlardan sorumlu güçlü bir alerjen olduğunu göstermektedir. HuRBL testini kullanarak, IgE'nin homolog alerjenlere çapraz reaktivitesi değerlendirilebilir (Şekil 3). Burada, her iki huş poleni alerjik hasta da Bet v 1'e iyi yanıt verdi, ancak sadece #2 hastası, fındıkta bulunan Bet v 1-homolog gıda alerjeni olan Cor a 1'e de yanıt verdi. Bu verilere dayanarak, hasta #2 büyük olasılıkla hasta #1'den daha yüksek Cor 1 çapraz reaktif IgE seviyelerine sahiptir ve bu da fındık tüketimi üzerine oral alerji semptomlarına neden olmaktadır. Alerjenlerin mutant varyantlarının hipoalerjenik doğasının değerlendirilmesi bile (azaltılmış potens) analiz edilebilir ve vahşi tip muadilleriyle karşılaştırılabilir (Şekil 4). Sağlanan örnekte, katlama varyantının serbest bırakma eğrisi, vahşi tip alerjene kıyasla daha yüksek bir antijen konsantrasyonuna doğru kaymış ve yarı maksimal salınımı kışkırtmak için gerekli olan önemli ölçüde daha yüksek bir antijen konsantrasyonuna neden sonuçlanmıştır (Şekil 4B). Bu veriler, oluşturulan mutant/katlama varyantın vahşi tip proteine kıyasla daha az alerjenik olduğunu ima ediyor. IgE aracılı degranülasyonu tetiklemek için bu azaltılmış güç, katlama varyantının hipoalerjenik karakterini vurgular. Bu teste dayanarak, kat varyantı alerjene özgü immünoterapi için ilginç bir adaydır, çünkü tedavi sırasında IgE ile ilişkili yan etkilerin azalmasına neden olabilir.

Şekil 1: İnsanlaştırılmış RBL hücreleri ve IgE-alerjen çapraz bağlama kaynaklı β-hexosaminidaz salınımının temsili çan şeklindeki eğrisi. RBL hücreleri, kendilerini bağlamaya çalışırken onlara çubuk benzeri bir şekil veren kültür şişelerine yapışır (A). Hasat edilecek hücreler için ideal bir izdiham seviyesi% 90'dan fazla değildir (B). Hücreler sırasıyla 40x ve 10x büyütme altında gösterilir. Rekombinant Bet v 1 (rBet v 1), ana huş poleni alerjeni(C)ile meydan okuma üzerine tepki veren huş poleni alerjik bireyin insan serumu ile hassaslaştırılmış hücreler. Arabulucu salınımı için taşıyıcı olarak, β-heksazanidaz aktivitesi hücre süpernatantlarında ölçülür. Çan şeklindeki eğri, yüksek antijen konsantrasyonlarında alerjen-IgE çapraz bağını rekabetçi bir şekilde inhibe eden alerjen fazlalığı nedeniyle IgE'deki antijen epitoplarının monovalent bir işgalinden kaynaklanır. Yüksek alerjen konsantrasyonlarında düşük salınımın bir başka açıklaması, aşırı antijen varlığında hücre içi yolların inhibisyonudur. Yarı maksimal salınım elde etmek için gerekli alerjen konsantrasyonunun belirlenmesi için, mediatör serbest bırakma eğrisinin eğiminin doğrusal kısmını temsil eden deneysel değerlere dayanan logaritmik bir regresyon hattı kullanılmıştır (D). Kırmızı noktalı çizgi, hesaplama için kullanılan logaritmik regresyon çizgisini temsil eder. Regresyon çizgisinin formülü kırmızı renkte gösterilir. Yarı maksimal sürüm şu şekilde tanımlanır: yarı maksimal sürüm = (minimum sürüm değeri + maksimum serbest bırakma değeri)/2. Örnekte, hesaplanan yarı maksimum sürüm% 20.6 idi. Bu deneyde kullanılan temsili insan serumu huRBL hücreleri ile inkübasyon için 1:20 seyreltildi ve stimülasyon için kullanılan antijen konsantrasyonu 100 μg / mL ila 0.004 pg / mL Bet v 1 arasında değişmektedir. Bir hücre canlılığı tahlil, bu durumda bir MTT tahlil, duyarlı serumun yanı sıra antijen seyreltmenin hücre canlılığı ve hücre sayısı(E)üzerindeki etkisini değerlendirmek için antijen stimülasyonundan sonra kalan hücrelerle birlikte gerçekleştirildi. Tedavi edilmemiş arka plan hücreleri ve lize hücreler (maksimum lizis) noktalı çizgi olarak gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Beş farklı insan serasının β-heksazanidaz yüzde salınımının temsili eğrileri. rBet v 1'in aynı antijen konsantrasyon aralığı, farklı huş polen duyarlı bireylerin serası ile hassaslaştırılmış huRBL hücreleri ile inkübe edildi. Semptomlarının şiddetine karşılık gelen farklı hastalar arasında yüzdelik salınım farkı vardır. #5 hastasının ana huş poleni alerjen Bet v 1'e tepkili olmadığına dikkat edin. Bu arabulucu salınım eğrilerini elde etmek için kullanılan beş insan serası da huRBL hücreleriyle inkübasyon için eşit olarak 1:20'de seyreltildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bet v 1 homolog fındık alerjeni Cor a 1 ile huş polen duyarlı hastaların serasından elde edilen IgE'nin çapraz reaktivitesi. Huş polenine duyarlı hastaların iki temsili serası Bet v 1'e ve homolog alerjen Cor a 1'e daha az derecede güçlü bir şekilde tepki verir. Hasta 2, Cor a 1'e önemli bir reaksiyon gösterir ve bu nedenle, arabulucu salınımın neredeyse ihmal edilebilir olduğu hasta 1'e kıyasla, fındık tüketimi üzerinde oral alerji semptomları gösterecektir. Noktalı çizgi, insan serası ile duyarlı olan ancak bir alerjenle uyarılmasın hücreler olan antijen olmayan kontrolü temsil eder ve bu nedenle alt sinyal platosu / arka plan için endikasyon görevi görür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: rBet v 1 vahşi tipi ile hipoalerjenik kat-varyant arasındaki yüzde salınımının karşılaştırılması. Huş poleni duyarlı bir bireyin aynı serumu rBet v 1 vahşi tip (wt) ve ana huş polen alerjeninin(A)hipoalerjenik kat-varyantı ile inkübe edildi. Her iki antijende de arabulucu salınımı görülse de, aynı yüzde salınımı için katlama varyantını vahşi tip rBet v 1 ile karşılaştırırken daha yüksek antijen konsantrasyonlarına doğru net bir kayma vardır. Farklı antijenlerin yüzde salınımındaki farkı karşılaştırmanın standart bir yolu, yarım maksimum salınıma(B)elde etmek için gereken antijen konsantrasyonunun hesaplanmasıdır. Bu genellikle biyolojik çoğalmalarda gerçekleştirilir (farklı insan serasındaki her alerjen için aynı antijen aralığının test edilir). Genellikle önemli sonuçlar çıkarmak için en az 8 ila 10 farklı hastadan sera ile arabulucu salınımı yapılır. Burada dört farklı seranın sonuçları örnek olarak çizilmiştir. İstatistiksel analiz için eşleştirilmiş bir t-testi kullanılmıştır. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; s ≤ 0.001; s ≤ 0.0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Olası sorular ve sorun giderme	Çözüm
Değişen hücre yanıt hızı nedeniyle tahlilden teste değişkenlik	Hücre geçiş döngüsü sayısının 20 ila 30 pasajı aşmamasını sağlayın. Gelecekteki deneyler için erken geçişlerde dondurulmuş stoklar yapın.
	Aksine, teknik olanlardan ziyade biyolojik kopyalara (farklı sera kullanımı) güvenin.
Sera, belirli IgE'nin düşük seviyelerini içerir	1:20 yerine daha düşük bir son serum seyreltme (yani 1:10) kullanılabilir. Tersine, yüksek düzeyde spesifik IgE içeren sera daha da seyreltilebilir (1:30 veya 1:40).
Tahlil yapmak için yeterli hücre yok	Bir T-75 şişeski izdiahın% 50-90 civarında olduğundan emin olun. Daha fazla şişe pasajı.
Seranın sitotoksik etkileri, yani eksik kompleman inaktivasyonu nedeniyle	Arabulucu serbest bırakma testine ek olarak bir hücre canlılığı tahlilini gerçekleştirin. Tamamlanmamış kompleman inaktivasyonini önlemek için Ag8 konsantrasyonu artırın.
Düşük sinyal	1x Tyrode tamponunudH2 O yerine duterium oksitte (D2O) seyrelterek veya ilgi alerjeni için daha yüksek özel IgE seviyelerine sahip bir sera kullanarak testlerin sinyal-gürültü oranını artırın.
Alerjen Tyrode'un tamponunda stabil değildir (örneğin yağış)	Test işlemi öncesinde 1x Tyrode tamponunda stabilite testleri yapın. Tyrode'un tamponunun değiştirilmesi önerilmez.
İlgili alerjen için doğru başlangıç konsantrasyonu bulma sorunları	Seyreltme serisinin tam serbest bırakma eğrisini kapsayacak şekilde uyarlanması (daha fazla seyreltme adımı, 1:10 yerine 1:20 seyreltme).
Düşük/hiç sinyalle belirtilen zayıf test performansı	Sera veya antijen stimülasyonundan (örneğin enzimatik alerjenler) sitotoksik etkilerden kaçının. Hücreleri dikkatlice yıkayın ve ıslatın. Havaya çok uzun süre maruz kalmaktan kaçının ve hücrelerin kurumasını önleyin.
Dip sinyal platosunda ulaşılıp ulaşılamazsa nasıl anlarım?	Tabağınıza "antijen yok" kontrolleri ekleyin. Bunlar sadece 1x Tyrode'un tamponu ile uyarılan ancak alerjen içermeyen duyarlı hücrelerdir.
Maksimum liziz kuyularına ek olarak pozitif bir kontrole ihtiyacım var mı?	Ek pozitif kontrol olarak, degranülasyona neden olduğu bilinen bir serum ve antijen kombinasyonu veya bir anti-FcφR1 antikoru kullanılabilir.
Kaç kuyuya ihtiyacım var?	Bu, titrasyon serinize, analiz etmek istediğiniz antijenlerin ve sera sayısına bağlıdır.  96 kuyu plakalarının düzenini kaç sera/antijen test edeceğinize göre planlayın. "Antijen kontrolleri yok", arka plan hücrelerini (duyarlı olmayan, uyarılmamış) ve maksimum liziz kuyularını eklemeyi unutmayın.
Kaç sera test etmeliyim? Kopyalara ihtiyacım var mı?	Test oldukça sağlam olmasına rağmen, değiştirilmiş hücre yanıt verme özelliği nedeniyle bazı tahlilden teste değişkenlik vardır. Bu nedenle, teknik çoğaltmalardan ziyade biyolojik çoğaltmalara (farklı sera kullanarak) güvenmeniz önerilir. Alerjenleri analiz etmek için en az sekiz farklı sera yeterlidir. Bununla birlikte, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, daha az sera kullanılarak önemli sonuçlar elde edilebilir.

Tablo 1: Sorun giderme.

Tartışmalar

Burada açıklanan huRBL hücre bazlı mediator salınım tahlil, herhangi bir laboratuvarda kolayca gerçekleştirilebilen ve uygulanabilen sağlam bir yöntemdir. Tek gereklilik, hücrelerin steril koşullar altında yetiştirilmesi gerektiğidir. Test, hastaların IgE-crosslinking ve bazofil degranülasyonunu çağrıştırmak için alerjen veya alerjenik bir kaynağın olasılığını değerlendirmek için kullanılır¹⁷. Test, hastanın serumu, ilginin alerjenini tanıyan yüksek düzeyde spesifik IgE ile mevcut olduğu sürece herhangi bir alerjen veya alerjenik kaynağa kolayca uyarlanabilir. Zayıf tahlil performansına neden olabilecek olası sitotoksik etkileri hesaba katmak için arabulucu salınım testine ek olarak bir hücre canlılığı tahlilinin yapılması önerilir. Bunun nedeni seranın tamamlanmamış kompleman inaktivasyonu veya diğer serum türevli sitotoksik etkiler olabilir. Antijenin kendisi bile, örneğin proteolitik / enzymatic aktivite nedeniyle, huRBL hücrelerine zarar verebilir. Potansiyel sitotoksik etkileri değerlendirmek için genellikle MTT (3-(4,5-Dimetilthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromür) ile hücre canlılığı tahlilini kullanıyoruz. Test, hücre süpernatantı toplandıktan ve aktarıldıktan sonra bırakılan huRBL hücreleri ile kolayca gerçekleştirilebilir (bkz. protokolün 6.3. adımı). Alerjen-IgE bağlamasına dayalı bireysel alerjenlerin veya karmaşık özlerin alerjenik potansiyelini belirlemek için ELISA'lar ve batı şişkinliği gibi diğer immünokimyasal yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu test sadece IgE'nin bir alerjene bağlanmasını tespit etmekle kalmaz, aynı zamanda IgE aracılı bazofil degranülasyonu kışkırtmak için hem insan IgE hem de alerjenin işlevselliğini ölçebilir¹⁸. Böylece, hastaların serasını kullanarak alerjik semptomların şiddetini incelemeye yardımcı olabilir. Testin klasik pasif keseleme anafilaksi testlerinden daha tutarlı ve verimli olduğu bildirilmektedir, çünkü test, mast hücreleri veya insan bazofilleri^19,20 gibi birincil hücrelere kıyasla sonuçlarda kullanımı ve daha az değişkenlik üreten RBL-2H3 hücrelerini kullanır. Buna ek olarak, test alerjenlerin biyolojik aktivitesinin iyi bir temsilini sağlar ve belirli bir karmaşık örnekteki toplam alerjen içeriğini doğru bir şekilde tahmin edebilir³. Protokoldeki belirli adımlarda sorun gidermek için lütfen Tablo 1'e bakın.

Arabulucu serbest bırakma tahlilinin bu versiyonunun uygulanabilirliği ile ilgili olarak, çoğunlukla araştırma amacıyla değil, aynı zamanda alerjenik özlerin biyolojik faaliyetlerine göre standartlaştırılması için kullanılmıştır. Bu, farklı SPT çözeltilerinin, provokasyon test çözeltisinin yanı sıra alerjene özgü immünoterapi için kullanılan ekstraktların analizini içerir; polen, kedi dander, ev tozu akarı ve yer fıstığı özlerinin yanı sıra arı zehiri^3,17,21için gösterildiği gibi. Teknik, özellikle gıda alerjilerinin teşhisinde uygulanabilir, çünkü yer fıstığı, süt, buğday ve yumurta gibi karmaşık gıda ürünlerinde minimum miktarda alerjenik bileşenleri bile tespit edebilir²². Bu bakımdan, tropomyosinler gibi hayvansal gıda alerjenlerinin alerjenikliğinin değerlendirilmesi için değerli bir araç olarak bildirilmiştir ve güçlü alerjenlerin alerjen olmayanlardan ayırt edilmemesine yardımcı olabilir²³. Bir araştırma aracı olarak, test gıda işlemenin etkisini incelemek ve ligand bağlanmasının alerjenlere etkisini ve alerjeniklik üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılır^24,25. Örneğin, Bet v 1'in ligandlara bağlanmasının alerjen-IgE çapraz bağlantısını etkilemediği gösterilmiştir, ancak termal ve proteolitik stabilitesinde bir artışa neden oldu²⁵. Test, bet v 1 ve homolog gıda alerjeni Cor a 1 (Şekil 3)kullanarak örneğimizde gösterildiği gibi, hastanın reaktivitesini küçük ve majör alerjenlerle karşılaştırmak ve alerjen homologların ve izoformların çapraz reaktivitesini araştırmak için kullanılabilir. Alerjen izoformları ile ilgili olarak, alarjen salınımı tahlili, majör amb amb a 1.01'i ragweed polenlerinde(Ambrosia artemisiifolia)en güçlü IgE reaktif izoform olarak tanımlamak için kullanılmıştır. Buna karşılık, ragweed polen özlerinde tanımlanan diğer iki izoform, Amb a 1.02 ve Amb a 1.03, hastaların IgE^26'sınareaktivitenin azaldığını gösterdi.

Son yıllarda, test, alerjene özgü immünoterapi için uygun adayların belirlenmesine yardımcı olan potansiyel anti-alerjik bileşikleri ve alerjenlerin yeni hipoalerjenik varyantlarını incelemek için uygulanmıştır^27,28. Bir diğer yeni yaklaşım ise alerjene özgü immünoterapinin seyrinde tedavi etkinliğini izlemek için tahlilden yararlanmaktır. Bu bağlamda, araştırma grubumuz alerjene özgü immünoterapi sırasında hastanın semptom puanının azalmasıyla iyi ilişkili bir huRBL tahlil inhibisyon sistemi geliştirdi²⁹. Test ayrıca TGFβ1'in alerjen kaynaklı IgE aracılı degranülasyon³⁰üzerindeki immünsüpresif etkilerini incelemek için önerilmiştir.

Tahlillerin sınırlamaları, huRBL hücrelerinin mast hücrelerinin veya bazofillerin bazı özelliklerine sahip olmasına rağmen, bu efektör hücrelerin doğal işlevini tamamen taklit etmemeleridir. Örneğin, mast hücreleri patojen tanıma için gerekli olan örüntü tanıma reseptörü Toll benzeri reseptör 4'ü (TLR4) yaygın olarak ifade ederken, RBL-2H3 hücrelerinde tamamen^{eksiktir 31}. İşlevsellikteki bu farklılık nedeniyle, test, verileri yorumlarken akılda tutulması gereken gerçek hayattaki durumu tam olarak taklit etmez. Ek olarak, huRBL hücreleri kanserli bazofilik hücreler olduğundan, kültür koşullarındaki değişiklikler ve uzun süreli kültleme, farklı laboratuvarlar arasında değişen sonuçlara yol açan fenotipik farklılıklara yol açabilir²⁰. Diğer bir husus, bu yöntemi uyarlarken dikkate alınması gereken alerjen konsantrasyonu seçimidir, çünkü yüksek alerjen konsantrasyonları, yüksek miktarda proteaz veya endotoksin varlığı nedeniyle IgE aracılı olmayan degranülasyona neden olabilir¹⁸. Diğer sınırlamalar, nispeten yüksek spesifik IgE seviyelerine sahip insan serasına bağımlılık (RAST sınıfı 5-6) ve tekniğin günlük klinik rutinde uygulanabilmesi için aşılması gereken bir engel olmaya devam eden hücre kültürü sistemlerine duyulan ihtiyaçtır.

Bu sınırlamaların dışında huRBL tahlili alerjik hastalıkların tanı ve tedavisi için değerli bir araştırma aracını temsil eder ve çok çeşitli uygulamalarda kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	M2133
96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate)	ThermoFisher Scientific	167008
96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates)	Fisher Scientific	655101
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	10735078001
Citric acid	Applichem	131018
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium)	Sigma	D8537
G418	Sigma	A1720
Glycine	Applichem	A3707
Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi)	Sigma	F0804
L-Glutamine (200 mM)	Sigma	G7513
Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture	Sigma	M8042
Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement	Gibco/ThermoFisher Scientific	51985034
Penicillin-Streptomycin (10K units Pen.  10 mg/mL Strep.)	Sigma	P4333
Sodium chloride (NaCl)	Applichem	A2942
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)	Applichem	131638
Triton X-100	Sigma	X100
Trypsin-EDTA	Sigma	59418C
Tyrode’s salt	Sigma	T2145