JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein sindirimi ölçümü için protokolleri açıklıyoruz. Çift florofor oranmetrik mikroskopiye ve nüfusa dayalı tekniklere göre sunduğu avantajlara vurgu yapılır.

Özet

Son yıllarda makropinositoz alanı hızla artmıştır. Makropinositoz, doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin organizma homeostaz ve bağışıklığı koruduğu merkezi bir mekanizma olarak ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda ve homeostatik rolünün aksine, kanser ve viral enfeksiyonlar da dahil olmak üzere çeşitli patolojileri de yönlendirebilir. Diğer endositoz modlarının aksine, makropinozomların olgunlaşmasını incelemek için geliştirilen araçlar az gelişmiş kalır. Burada protokol, erken ve olgunlaşan makropinozomların lümen içindeki redoks ortamını incelemek için yeni geliştirilen araçları açıklar. pH'ın değerlendirilmesinde ratiometrik floresan mikroskopisi, reaktif oksijen türlerinin üretimi ve canlı hücrelerdeki bireysel makropinozomların lümeni içindeki bozunma kapasitesi için metodolojiler açıklanmıştır. Tek organel ölçümler, genellikle nüfusa dayalı yaklaşımlarla kaybedilen mekansal heterojenliği ortaya çıkarma avantajı sunar. Prob seçimi, enstrümantasyon, kalibrasyon ve tek hücreli ve popülasyon tabanlı yöntemler de dahil olmak üzere çift florofor oranmetrik mikroskopinin temel ilkelerine vurgu yapılır.

Giriş

Makropinositoz, makropinozomlar1,2adı verilen membran bağlı sitoplazmik organellere büyük miktarlarda hücre dışı sıvı alımını ifade eder. Amip Diktyostelium sppgibi serbest yaşayan tek hücreli organizmalar tarafından gerçekleştirilen son derece korunmuş bir süreçtir. 3, yanı sıra antozooans4 ve metazoans2. Çoğu hücrede makropinositoz indüklenen bir olaydır. Hücre yüzeyi reseptörlerinin ligasyonu, fırfırlar olarak adlandırılan aktin tahrikli plazma membran uzantılarının çıkıntısını teşvik eder. Bu fırfırların bir kısmı, bazı kötü anlaşılmış mekanizma tarafından, makropinozom oluşturmak için distal uçlarını mühürler (bu yöntem kağıdının kapsamının ötesinde, makropinositoz mekaniği hakkında ayrıntılı incelemeler için, lütfen 1,2 ,5,6,7referanslarına bakın). Makropinositozu indükleyen hücre dışı uyaran en sık çözünür bir büyüme faktörüdür5,8. Buna göre, makropinositik olay, hücrenin büyümeyi kolaylaştırmak için yararlı metabolitler türetebileceği hücre dışı malzeme bolusunun yutulmasını sağlar. Ne yazık ki, besin dağıtımı için bu yol patolojiyi de yönlendirebilir. Bazı kanser hücreleri, sürekli veya konssitütif makropinositoz ile sonuçlanan mutasyonları barındırır. Besinlerin sürekli verilmesi kanser hücrelerinin kontrolsüz çoğalmasını kolaylaştırır ve özellikle agresif tümörler9, 10,11,12,13ile bağlantılıdır. Benzer şekilde, virüsler konak hücrelere erişmek için makropinositozu teşvik edebilir, böylece viral patolojiyi yönlendirebilir14.

Makropinositoz ayrıca patojenlere karşı bağışıklığın korunmasında da işlev gösterir. Makrofajlar ve dendritik hücreler gibi bazı doğuştan gelen bağışıklık hücreleri, makropinositoz 6,15,16yoluyla hücre dışı sıvının constitutive ve agresif örneklemesine girer. Bu makropinositoz modu inanılmaz derecede aktiftir ve tek bir dendritik hücre, her saat kendi ağırlığına eşdeğer bir hücre dışı sıvı hacmi ile kendini engorge edebilir17. Bu konsitültasyonel örneklemeye rağmen, makrofajlar ve dendritik hücreler tümör hücreleri gibi kontrolsüz bir şekilde çoğalmazlar, bunun yerine hücre dışı materyali potansiyel tehditlerin varlığını veya gerçekten yokluğunu bildirmek için bilgi çıkarılacak şekilde işliyor gibi görünürler. Bilgiler i) hücre içi patojen tanıma reseptörleri tarafından okunabilen patojen ilişkili moleküler desenler ve ii) uyarlanabilir bağışıklık sisteminin hücreleri tarafından taranmaya hazır başlıca histocompatibility moleküllerine yüklenebilen kısa amino asit esnemeleri16,18,19olarak çıkarılır. Patojenlerin bağışıklık hücreleri tarafından bilgi işleme için bu yolu altüst edip etmediği şu anda belirsizdir.

Makropinositoz için hem bağışıklık hem de homeostazın sürdürülmesinde ve daha yaygın olarak çalışılan diğer endositoz modlarının aksine, makropinozomların iç (luminal) çalışmalarının çok azı bilinmektedir. Makropinozomların armatür biyokimyasını incelemek için standartlaştırılmış protokoller ve araçlar geliştirmek, sadece benzersiz biyolojilerini daha iyi anlamamıza yardımcı olmakla kalmayacak, aynı zamanda ilaç dağıtımı da dahil olmak üzere yeni terapötik stratejiler için yararlanabilecek içgörü sağlayacaktır20. Bu yöntem el yazması, makropinozomların luminal biyokimyasının çeşitli yönlerini tek organel düzeyde parçalamak için yakın zamanda geliştirilen araçlara odaklanacaktır.

Floroforlar, i) tercihen ilgi alanına bölünürlerse ve/veya ii) ilgi parametresine yanıt olarak spektral değişikliklere uğrarlarsa organellerin spesifik biyokimyalarını ölçmek için kullanılabilir. Örneğin, pH durumunda, acridine portakal, cresyl violet ve LysoTracker boyaları gibi floresan zayıf bazlar tercihen asidik organellerde birikir. Bu nedenle, göreceli yoğunlukları etiketli organellerin asidik olduğunun kaba bir göstergesidir. Floresan, pHrodo ve cypHer5e gibi diğer pH duyarlı floroforlar protonlara bağlanınca spektral değişikliklere uğrar (Şekil 1A-C). Bu nedenle pH'a duyarlı floroforların floresan emisyonundaki değişiklikler pH'ın yararlı bir yaklaşık örneğini sağlayabilir. Bununla birlikte, tek floroforların kullanımı bir dizi dezavantaj sunar. Örneğin, odak düzleminde yapılan değişiklikler, fotobleaching ve makropinozomlarda yaygın bir olay olan tek organellerin hacmindeki değişiklikler21, tek floroforların floresan yoğunluğunda değişikliklere neden olabilir ve bu22için kolayca düzeltilemez. Tek dalga boyu değerlendirmeleri, asidik bölmeleri görselleştirmek için yararlı olsa da, bu nedenle tamamen niteldir.

Daha nicel bir yaklaşım, parametreye duyarlı floroforu ve ilgi organeline bir referans floroforu hedeflemektir. Referans florofor, organel içindeki biyokimyasal değişikliklere karşı ideal olarak duyarsızdır (Şekil 1D-F) ve bu nedenle odak düzleminde, organeller hacimde ve bir dereceye kadar fotobleaching23'teki değişiklikleri düzeltmek için kullanılabilir. Çift florofor ratiometrik floresan olarak adlandırılan bu yaklaşım kullanılarak, parametreye duyarlı floroforun floresan emisyonunun referans florofora oranı oluşturularak düzeltme sağlanabilir.

Burada protokol, makropinozomlarda pH, oksidatif olaylar ve protein bozulmasını ölçmek için çift florofor oranımetrik görüntüleme prensibini kullanacaktır. Her durumda, ilgi parametresine duyarlı bir florofor ve bir referans florofor seçilecektir. Floroforları özellikle makropinozomlara hedeflemek için, tercihen makropinoomlara dahil edilen 70 kDa dektran ile eşçekimli olarak birleştirilecektir24. Tüm tahliller Raw264.7 hücrelerinde yapılacaktır ancak diğer hücre tiplerine uyarlanabilir. Mümkün olduğunda, floresan oranları mutlak değerler kazanmak için bir referans eğriye göre kalibre edilecektir. Daha da önemlisi, makropinozomların ışıklı ortamının dinamik ve nicel değerlendirilmesi için tüm ölçümler canlı hücrelerde yapılacaktır.

pH'a duyarlı floroforlar seçilirken, bir dizi dikkat edilmesi gereken husus tartılmalıdır. Birincisi, probun en hassas olacağı pH değerleri aralığını gösteren floroforun pK a'dır. Oluşumdan kısa bir süre sonra, makropinozomun pH'ının hücre dışı ortamınkine (~pH 7.2) yakın olacağı ve geç endozomlar ve lizozomlarla (~pH 5.0) etkileşimler yoluyla aşamalı olarak asitleşeceği varsayılırsa, bu aralıkta hassas olan pK a içerenbir prob seçilmelidir (Şekil 2C). pK'ı 6.4 olan florofor floresan, bu aralıkta en hassas olanıdır. Fagozomlar gibi diğer benzer organelleri ölçmek için yaygın olarak kullanılmıştır ve bu yazıda tercih edilen florofor olacaktır22,25. Referans florofor olarak, pH'a duyarsız olan tetrametilrhodamin kullanılacaktır (Şekil 1E). pHrodo ve cypHer5e gibi diğer floresanlar, floresanın spektral özelliklerinin diğer deneysel değişkenlerle eşleştiği floresan yerine geçebilir. pHrodo ve cypHer5e için önerilen bazı referans floroforları Şekil 1'de gösterilmiştir.

İkinci bir husus, iki floroforun özellikle makropinozomlara hedeflenecekleri yöntemdir. Kabaca 7 nm hidrodinamik yarıçapı olan 70 kDa büyüklüğündeki dektran, hücrelere özel olmayan yapışmaz ve makropinoomlara dahil edilir, ancak clathrin kaplı çukurlara veya caveolae'ye dahil değildir ve bu nedenle makropinozomları işaretler (Şekil 2A ve Şekil 3A,B)16,24,26. Bu protokolde pH'a duyarlı ve referans problar olarak sırasıyla floresan etiketli 70 kDa dektran ve tetrametrinhodamin (TMR) etiketli 70 kDa dektran kullanılacaktır.

Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde, makropinositoz ve fagositoz, adaptif immün yanıtın hücrelerine işlenmek ve daha sonra sunul için eksojen materyalin içselleştirilmesi için iki ana yolu temsil eder27. Fagozomların ve makropinozomların lümeninin redoks kimyasının dikkatli ve koordineli kontrolü, eksojen malzemenin bağlama özgü işlenmesi için kritik öneme sahiptir. Fagozomlarda oksidatif olayların belki de en iyi çalışılmış düzenleyicisi, fagozomların lümeninde büyük miktarlarda reaktif oksijen türleri (ROS) üreten büyük bir çok alt ünez kompleksi olan NADPHoksidazdır 28. Gerçekten de, aktivitesi fagozomlar içinde uygun antijen işleme merkezidir29,30. Yine de, NADPH oksidazının makropinosomal zarlar üzerindeki aktivitesi araştırılmamıştır.

Bu protokolde, H2DCFDA süksinimsal ester makropinozom içindeki oksidatif olayları ölçmek için kullanılır. Bu, azaltılmış formunda minimal floresan olan modifiye bir floresan formudur (2',7'-diklorodihydrofluorescein diasetat). Oksidasyon üzerine floresan emisyonu önemli ölçüde artar. Bununla birlikte, H2DCFDA'nın önemli bir uyarısını belirtmek gerekir - florofor floresanlara dayandığı için, floresan asidik bölmelerde de söndürülür ve deneyler tasarlarken bu değişkenin kontrolüne özen edilmelidir28. pH ölçümü yaklaşımına benzer şekilde, H2DCFDA süksinidil ester kovalent olarak 70 kDa dektrana bağlanacak ve referans florofor olarak TMR etiketli 70 kDa dektran kullanılacaktır (Şekil 3A).

Floresan ovalbumin makropinozomlar içindeki protein bozulmasını ölçmek için kullanılacaktır. Burada kullanılan ovalbumin yoğun bir şekilde kendiliğinden söndürülen 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL boyası ile etiketlenmiştir. Sindirim üzerine, güçlü floresan boya etiketli peptitler serbest kalır. Ovalbumin kolayca 70 kDa dektran'a konjuge edilemediği için, TMR etiketli 70 kDa dektran ve sıvı fazlı ovalbumin içeren hücreler birlikte inkübe edilecektir. TMR sinyali, görüntüleme sonrası analiz sırasında makropinozom maskesi oluşturmak için kullanılacak ve sindirilen ovalbuminden kurtarılan sinyal maske içinde ölçülecektir (Şekil 3B).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Hücrelerin hazırlanması

  1. Raw264.7 hücrelerini 37 °C'de ve %5 CO2 ila %70 oranında RPMI'de %10 ısı inaktive serum ile desteklenmiş olarak büyütün.
  2. Testten bir gün önce, tohum Raw264.7 hücreleri 96 kuyu plakasında kuyu başına 5 x10 4 hücre yoğunluğunda. Her kuyunun 100 μL büyüme ortamı içerdiğinden emin olun. 96 kuyu plakasının siyah kenarları ve görüntüleme için cam tabanlı olduğundan emin olun.
    NOT: Burada görüntüleme için 96 kuyu plakası kullanılmıştır. 96 kuyu plakaları, daha büyük görüntüleme odalarına göre daha az miktarda hücre ve reaktif kullanılmasına izin verir. Bununla birlikte, canlı hücreleri görüntülemek için tasarlanmış herhangi bir oda kullanılabilir ve reaktifler buna göre ölçeklendirilebilir.
  3. Tahlil günü, kuyuların en az% 70 birlikte olup olmadığını kontrol edin.

2. Makropinozom pH'larının ölçülmesi

  1. Hücreleri bölüm 1'deki gibi hazırlayın.
  2. Tüm kuyuları 37 °C'de 100 μL HBSS ile yıkayın.
  3. Her kuyuyu 0.025 mg/mL TMR etiketli 70 kDa dektran ve 0.025 mg/mL floresan etiketli 70 kDa dektran içeren 100 μL HBSS ile doldurun.
  4. Hücreleri 15 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
  5. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri 100 μL HBSS ile 6x yıkayın.
  6. Her kuyuyu 37 °C'de 100 μL HBSS ile doldurun.
  7. Plakayı ısıtılmış bir sahne ve hazne ile mikroskop üzerine yerleştirin.
  8. Her florofor için ekscitasyon/emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
    NOT: Görüntü alımı için ideal koşullar, kullanılan floroforlara ve bireysel mikroskop kurulumlarına göre değişecektir. Burada, görüntüler Leica SP5 lazer tarama konfokal mikroskopta elde edildi. TMR 543 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 610 nm'den 650 nm'ye toplandı. Floresan 488 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 500 nm'den 550 nm'ye toplandı. 63x yağ daldırma hedefi kullanıldı ve 0,5 μm aralıklarla 10 μm Z hacmi elde edildi.
  9. Her kuyudan, her kuyunun arasındaki floroforlar arasında değişen bir görüntü elde edin.
  10. İlk satın alma işleminden sonra, tüm kuyuların tüm plaka boyunca odakta kalıp kalmadığını kontrol edin.
  11. İstenilen süre boyunca her kuyunun görüntülerini 1-15 dakika aralıklarla elde edin.

3. Makropinozom pH'ının yerinde kalibrasyonu

  1. Görüntü alımı sırasında, 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mMCaCl2 ve 5 mM glikoz içeren 1 L potasyum bakımından zengin (K+-zengin) çözelti hazırlayın. 25 mM HEPES (1 M, pH 7.2 stok çözümünden) ve 25 mM MES ile ayrı bir 400 mL hacim (0.5 M, pH 6.0 stok çözümünden) ile K+zengin çözeltisinin bir 400 mL hacmini tamamlar.
  2. gerektiğinde 10 M HCl veya 10 M KOH kullanarak 25m HEPES ile tamponlanmış K+zengin çözeltisinin 50 mL'lik bir aliquot'ını pH 7.5'e ayarlayın.
  3. Gerektiğinde 10 M HCl veya 10 M KOH kullanarak 25mM MES ile tamponlanmış üç ayrı 50 mL'lik K+zengin çözeltisini pH 6.5, pH 5.5 ve pH 5.0'a ayarlayın.
    NOT: Daha düşük pH çözeltileri için asetat-asetik asit tamponu tercih edilebilir.
  4. Görüntü alımının tamamlanmasından sonra, HBSS'yi hücreleri içeren 96 kuyu plakasından çıkarın ve pH 7.5'teki K+bakımından zengin çözelti ile değiştirin.
  5. Nijerini 10 μg/mL'lik son konsantrasyona ekleyin.
    NOT: Nijerin, K + ileH+ 'yı değiş tokuş eden bir iyonoforedir. K+ -rich çözeltisinin K+konsantrasyonunu sitozolünün K+ konsantrasyonuna yakın bir değere ayarlayarak, nijerinin makropinozomun pH'ını sitozolunkine sıkıştırması sağlanabilir, bu da kalibrasyon tamponunun pH'ını yansıtır.
  6. Plakayı mikroskopa geri yerleştirin ve yukarıdakiyle aynı alım ayarlarını kullanarak her kuyunun görüntülerini alın.
  7. Her kalibrasyon arabelleği için 3.5 ve 3.6 adımlarını yineleyin.

4. Makropinozom pH için veri analizi

  1. FIJI yazılımını kullanarak, arka planı hem TMR hem de floresan kanalından çıkarın.
  2. TMR kanalında bir maske oluşturun. Maske oluşturmak için, > Eşiğini Ayarla > Uygula 'yıseçerek görüntüyü ikili görüntüye dönüştürün. Ardından, ikili görüntüyü vurgulayın ve Maske Oluştur '> > Seçimi Düzenle 'yiseçin.
  3. Hem TMR hem de floresan görüntülere uygulayın. Bunu yapmak için maskeyi vurgulayın ve Seçimi > Düzenle'> Seçim Oluştur 'useçin. TMR görüntüsüne tıklayın ve maskeyi TMR kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın. Benzer şekilde, floresan resmine tıklayın ve maskeyi OB kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın.
  4. Maskelerin içindeki her makropinozom için TMR ve floresan yoğunluğunu kaydedin.
  5. Zaman diliminden her zaman noktası için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  6. Yerinde kalibrasyonda yakalanan görüntüler için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  7. Floresan:TMR oranını oluşturmak için floresan yoğunluğunu TMR yoğunluğuna bölün.
  8. Kalibrasyon görüntüleri için pH'ı floresan:TMR oranlarına göre çizin.
  9. Kalibrasyon verilerine bir eğri sığdırın.
  10. Mutlak pH değerlerini almak için zaman kursundan her zaman noktası için verileri enterpolasyon.

5. Makropinozomlar içindeki oksidatif olayların ölçülmesi

  1. Hücreleri bölüm 1'deki gibi hazırlayın.
  2. Testlerden bir gün önce, 70 kDa dextran etiketli H2DCFDA süksinimimidyl esterini 10 mg 70 kDa dextran-amino'yu 0,1 M sodyum bikarbonat çözeltisinin (pH 8,3) 1 mL'sinde yeniden yağlayarak hazırlayın. Dektran-amino çözeltisine 1 mg H2DCFDA süksinimimidyl ester ekleyin ve 1 saat kuluçkaya yatırın. PBS'ye karşı H2DCFDA etiketli 70 kDa dektran'ı dialyze edin. H2DCFDA etiketli 70 kDa dextran depolama sırasında oksitlendireceğinden 1 günden fazla saklamayın.
  3. Tahlil gününde, tüm kuyuları 37 ° C'de 100 μL HBSS ile yıkayın.
  4. Her kuyuyu 0.025 mg/mL TMR etiketli 70 kDa dektran ve 0.025 mg/mL H2DCFDA etiketli 70 kDa dextran içeren 100 μL HBSS ile doldurun.
  5. Hücreleri 15 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
  6. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri 100 μL HBSS ile 6x yıkayın.
  7. Her kuyuyu 37 °C'de 100 μL HBSS ile doldurun.
  8. Plakayı ısıtılmış bir sahne ve hazne ile mikroskopa yerleştirin ve her florofor için eksitasyon/emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
    NOT: Görüntü alımı için ideal koşullar, kullanılan floroforlara ve bireysel mikroskop kurulumlarına göre değişecektir. Burada görüntüler Leica SP5 lazer tarama konfokal mikroskopta elde edildi. TMR 543 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 610 nm'den 650 nm'ye toplandı. H2DCFDA 488 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 500 nm'den 550 nm'ye toplandı. 63x yağ daldırma hedefi kullanıldı ve 0,5 μm aralıklarla 10 μm Z hacmi elde edildi.
  9. Her kuyudan, her kuyunun arasındaki floroforlar arasında değişen bir görüntü elde edin.
  10. İlk satın alma işleminden sonra, tüm kuyuların tüm plaka boyunca odakta kalıp kalmadığını kontrol edin.
  11. İstenilen süre boyunca her kuyunun görüntülerini 1-15 dakika aralıklarla elde edin.

6. Makropinozomlar içindeki oksidatif olaylar için veri analizi

  1. FIJI yazılımını kullanarak, arka planı hem TMR hem de H2DCFDA kanallarından çıkarın.
  2. TMR kanalında bir maske oluşturun. Maske oluşturmak için, > Eşiğini Ayarla > Uygula 'yıseçerek görüntüyü ikili görüntüye dönüştürün. Ardından, ikili görüntüyü vurgulayın ve Maske Oluştur '> > Seçimi Düzenle 'yiseçin.
  3. Maskeyi hem TMR hem de H2DCFDA görüntülerine uygulayın. Bunu yapmak için maskeyi vurgulayın ve Seçimi > Düzenle'> Seçim Oluştur 'useçin. TMR görüntüsüne tıklayın ve maskeyi TMR kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın. Benzer şekilde, H2DCFDA görüntüsüne tıklayın ve maskeyi H2DCFDA kanalına uygulamak için Shift + E tuşlarına basın.
  4. Maskelerin içindeki her makropinozom için TMR ve H2DCFDA yoğunluğunu kaydedin.
  5. Zaman diliminden her zaman noktası için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  6. H2DCFDA: TMR oranı oluşturmak için H2DCFDA yoğunluğunu TMR yoğunluğuna bölün.
  7. H2DCFDA: TMR oranını zamana karşı çizin.

7. Makropinozomlarda protein sindirimi ölçümü

  1. Hücreleri bölüm 1'deki gibi hazırlayın.
  2. Tahlil günü, tüm kuyuları 37 ° C'de 100 μL HBSS ile yıkayın.
  3. BODIPY etiketli ovalbumin'i HBSS'de 4 mg/mL konsantrasyonda çözün.
  4. Her kuyuyu 0.025 mg/mL TMR etiketli 70 kDa dektran ve BODIPY etiketli ovalbumin 0.2 mg/mL içeren 100 μL HBSS ile doldurun.
  5. Hücreleri 15 dakika boyunca 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin.
  6. Hücreleri inkübatörden çıkarın ve hücreleri 100 μL HBSS ile 6x yıkayın.
  7. Her kuyuyu 37 °C'de 100 μL HBSS ile doldurun.
  8. Plakayı ısıtılmış bir sahne ve hazne ile mikroskopa yerleştirin ve her florofor için eksitasyon/emisyon parametrelerini gerektiği gibi ayarlayın.
    NOT: Görüntü alımı için ideal koşullar, kullanılan floroforlara ve bireysel mikroskop kurulumlarına göre değişecektir. Burada, görüntüler Leica SP5 lazer tarama konfokal mikroskopta elde edildi. TMR 543 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 610 nm'den 650 nm'ye toplandı. BODIPY 488 lazer hattı ile heyecanlandı ve emisyon 500 nm'den 550 nm'ye toplandı. 63x yağ daldırma hedefi kullanıldı ve 0,5 μm aralıklarla 10 μm Z hacmi elde edildi.
  9. Her kuyudan, her kuyunun arasındaki floroforlar arasında değişen bir görüntü elde edin.
  10. İlk satın alma işleminden sonra, tüm kuyuların tüm plaka boyunca odakta kalıp kalmadığını kontrol edin.
  11. İstenilen süre boyunca her kuyunun görüntülerini 1-15 dakika aralıklarla elde edin.

8. Makropinozomlarda protein sindirimi için veri analizi

  1. FIJI yazılımını kullanarak, arka planı hem TMR hem de BODIPY kanallarından çıkarın.
  2. TMR kanalında bir maske oluşturun ve yukarıdaki 6.2 ve 6.3 adımlarında olduğu gibi hem TMR hem de BODIPY görüntülerine uygulayın (Şekil 3B).
  3. Maskelerin içindeki her makropinozom için TMR ve BODIPY yoğunluğunu kaydedin.
  4. Zaman diliminden her zaman noktası için 4.1-4.3 adımlarını yineleyin.
  5. BODIPY:TMR oranını oluşturmak için BODIPY yoğunluğunu TMR yoğunluğuna bölün.
  6. Bodipy:TMR oranını zamana göre çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Makropinozom pH'ı ölçerken, asitleşme dinamiklerinin ölçülemediği bir süre vardır. Bu süre dektran yükleme aşamasına (Şekil 2C ve Şekil 3C, D'dekigri kutu) karşılık gelir ve kullanılan hücre tipine bağlı olarak değişir. Yükleme aşamasının uzunluğu (i) hücrelerin makropinositik aktivitesi ve (ii) kullanılan aletin hassasiyetine göre değişir. Bu sürenin her deneyin başlangıcında hem floresan hem de TMR kanal...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Makrofajlarda, fibroblastlarda ve hatta Diktinostelium spp'de makropinositik alımın hem düşük hem de yüksek verimli ölçümleri için bir dizi protokol olmasına rağmen. 3,7,31,32,33, bu dinamik bölmelerin ışık biyokimyasını ölçmek için çok az girişimde bulunulmuştır. Bunun nedeni, diğer endosik bölmelerden kaçınırken makropi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Calgary Üniversitesi'ne desteği için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Robin Yates'e reaktiflere, ekipmanlara ve faydalı tartışmalara erişim için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Black-walled 96 well platePerkinElmer6005430
CypHer5e, NHS esterCytivaPA15401
Dextran-amino 70 kDaInvitrogenD1862
DQ-ovalbuminInvitrogenD12053
FITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1823
HBSSGibco14287
NigericinSigma AldrichN7143
OxyBurst Green-SEInvitrogenD2935
pHrodo Red, SEInvitrogenP36600
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI mediumGibco11875093
SP5 Confocal MicroscopeLeica-
TRITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1819
u-DishIbidi81156

Referanslar

  1. Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
  2. Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766(2017).
  3. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434(2018).
  4. Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
  5. Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180(2020).
  6. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
  7. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
  8. Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
  9. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  10. Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153(2019).
  11. Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
  12. Lee, S. -W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
  13. Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
  14. Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
  15. West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
  16. Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284(2016).
  17. Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
  18. Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112(2020).
  19. Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1(2015).
  20. Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156(2019).
  21. Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
  22. Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 185-199 (2017).
  23. Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, Clifton NJ. 227-239 (2017).
  24. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  25. Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
  26. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
  27. Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
  28. Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
  29. Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
  30. Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
  31. Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
  32. Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, Clifton NJ. 113-123 (2019).
  33. Lee, S. -W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, Clifton NJ. 171-181 (2019).
  34. Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 174makropinositozmakropinozomendositozpHV ATPaseproton pompasreaktif oksijen t rleriROSNADPH oksidazfagositmakrofajdendritik h cre

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır