JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada protokol, in vivo intraperitoneal uygulama için naringenin solüsyonunun hazırlanmasını sunmaktadır. Naringenin, dimetilsülfoksit, Aradaki 80 ve salin karışımında tamamen çözülür. Naringeninin antidiyabetik osteoporotik etkileri kan şekeri testi, tartarat dirençli asit fosfataz boyama ve enzime bağlı immünosorbent testi ile değerlendirildi.

Özet

Bir bileşik (fitokimyasal) çözeltinin hazırlanması, ilaç taraması gibi çalışmalarda uygulanmasından önce göz ardı edilen ancak kritik bir adımdır. Bileşiğin tamamen çözünmesi, güvenli kullanımı ve nispeten kararlı sonuçları için gereklidir. Burada, naringenin çözeltisinin hazırlanması için bir protokol ve yüksek yağlı bir diyette intraperitoneal uygulaması ve streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik model örnek olarak gösterilmiştir. Sırasıyla fizyolojik salinde (PS) yeniden oluşturulan etanol, dimetilsülfoksit (DMSO) ve DMSO artı Tween 80 dahil olmak üzere çözücülerde çözünmesini test etmek için az miktarda naringenin (3.52-6.69 mg) kullanıldı. Bileşiğin tam çözünmesi, çözeltinin rengini, santrifüjlemeden sonra çökeltilerin varlığını (30 s için 2000 x g) veya çözeltinin oda sıcaklığında (RT) 2 saat durmasına izin vererek belirlenir. Kararlı bir bileşik / fitokimyasal çözelti elde edildikten sonra, in vivo çalışmalar için gerekli olan bileşiğin nihai konsantrasyonu / miktarı, sadece çözücü (PS içermeyen) bir stok çözeltisinde hazırlanabilir ve daha sonra istenildiği gibi PS ile seyreltilebilir / karıştırılabilir. Naringeninin farelerde antidiyabetik osteoporotik etkileri (20 mg/kg b.w., 2 mg/mL'de intraperitoneal uygulama) kan şekeri, kemik kütlesi (mikro-BT) ve kemik rezorpsiyon hızı (TRAP boyama ve ELISA) ölçülerek değerlendirildi. Ayrıntılı organik / fitokimyasal çözelti preparatları arayan araştırmacılar bu teknikten yararlanacaktır.

Giriş

Fitokimyasal bileşiklerin ilaç taramasında kullanımı ile ilgili artan çalışmalarla, optimal etkilerini değerlendirmek için fitokimyasal çözeltiler hazırlama yaklaşımlarına dikkat edilmesi gerekmektedir. Çözünme metodolojisi, dozaj ve konsantrasyon gibi birçok husus, bileşik1'i hazırlarken dikkate alınmalıdır.

Solvent bazlı çözünme, organik bileşik hazırlama1 için yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılan çözücüler arasında su, yağ, dimetil sülfoksit (DMSO), metanol, etanol, formik asit, Ara, gliserin, vb.2 bulunur. Bileşik gastrik gavage tarafından uygulandığında çözünmemiş maddeler içeren bir süspansiyon kabul edilebilir olsa da, tamamen çözünmüş bir çözünmüş solut intravenöz uygulama için kritik öneme sahiptir. Yağ çözeltisi, süspansiyon ve emülsiyon kılcal embolilere neden olabileceğinden, özellikle intravenöz, intramüsküler ve intraperitoneal enjeksiyonlar uygulanırken bileşik hazırlama için sulu bir çözelti önerilmektedir3.

Etkili doz aralığı, bileşikler arasında ve hatta aynı bileşikle tedavi edilen hastalıklar arasında değişir. Etkili ve güvenli doz ve konsantrasyonun belirlenmesi literatüre ve ön deneylere bağlıdır4. Burada, bileşik naringeninin hazırlanması örnek olarak gösterilmiştir.

Polifenolik bir bileşik olan Naringenin (4,5,7-trihidroksi-flavanon), hepatoprotektif5, antidiyabetik6, anti-enflamatuar7 ve anti-oksidan aktiviteleri8 için hastalık tedavisinde incelenmiştir. İn vivo uygulamalar için, naringeninin oral uygulaması yaygın olarak kullanılır. Önceki çalışmalarda, oral gavage 9,10,11,12 ile uygulanan% 0.5-1 karboksimetil selüloz,% 0.5 metilselüloz dozu,% 0.0 DMSO ve% 0.5 metilselüloz dozunda,% 0.01 DMSO ve% 0.0 ila fizyolojik salin (PS) içinde naringenin çözeltisinin hazırlandığı bildirilmiştir. Ayrıca, diğer çalışmalar, 3.6 g / kg / d13,14'lük bir dozda oral alım için% 3'te (wt / wt) chow ile naringenin takviyesi yapıldığını bildirmiştir. Çalışmalar ayrıca 10-50 mg/ kg 15,16,17,18'de intraperitoneal enjeksiyon için naringenini çözmek için etanol (% 0.5 v / v), PS ve DMSO kullandığını bildirmiştir. Temporal lob epilepsisi ile ilgili bir çalışmada, farelere PS19'da çözünmüş% 0.25 karboksimetil selüloz içinde askıya alınmış bir naringenin enjeksiyonu verildi. Bu çalışmalar naringenin çözeltileri hazırlamak için farklı çözücülerin kullanıldığını bildirmesine rağmen, çözünme durumu ve hayvan tepkisi gibi daha fazla ayrıntı bildirilmemiştir.

Bu protokol, diyabetik kaynaklı osteoporozda in vivo uygulama için naringenin çözeltisi hazırlamak için bir prosedür sunar. Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanması, çözücülerin ve bileşiklerin hazırlanmasını, dozaj tahminini, çözünme işlemini ve filtrasyonu içerir. Dozaj, literatür araştırmasına ve ön deneylere dayanarak, 3 gün boyunca her gün enjeksiyon uygulandıktan sonra farelerin izlenmesi ve dozajın fare davranışlarına göre değiştirilmesiyle belirlendi. Son seçilen konsantrasyon (20 mg / kg b.w.), yüksek yağlı bir diyet ve streptozotosin (STZ) ile indüklenen diyabetik fareler20,21'de 8 hafta boyunca haftada 5 gün intraperitoneal olarak uygulandı. Naringeninin diyabetik osteoporozdaki etkileri kan şekeri testi, mikro-BT, tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) boyama ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile değerlendirildi.

Genel olarak, 40-400 mg / mL konsantrasyon aralığında naringeninin etanol veya DMSO veya% 5 (etanol veya DMSO) artı% 95 PS (v / v) içinde tamamen çözünmediği gözlendi. Bununla birlikte, naringenin% 3.52 DMSO,% 3.52 Tween 80 ve% 92.96 PS karışımında tamamen çözüldü. Ayrıntılı prosedür, araştırmacıların bileşiği in vivo uygulama için bir enjeksiyon çözeltisi olarak hazırlamalarına yardımcı olacaktır.

Protokol

Açıklanan araştırmalar, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Kılavuzlara uygun olarak tanımlandı ve Şangay Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Deneyler yapılırken, güvenlik amacıyla laboratuvar önlükleri, tek kullanımlık nitril eldivenler ve gözlükler gereklidir.

1. İn vivo uygulama için gerekli çözücülerin hazırlanması ve naringenin tahmini

  1. Aşağıdaki çözücüleri hazırlayın: Ara-80 (nihai konsantrasyon aralığı:% 0.5 -% 1), DMSO, gliserin (son konsantrasyon aralığı: % 15 -% 20), etanol (son konsantrasyon aralığı: kas içi enjeksiyon için% 12)22 ve% 0.9 PS.
  2. Gerekli naringenin miktarını doza, fare sayısına ve enjeksiyon sıklığına göre tahmin edin.
    1. 8 hafta boyunca haftada 5 gün naringenin uygulamak için 10 fare (C57BL / 6, erkek, 5 haftalık, SPF) sipariş edin. Fareleri belirli patojensiz (SPF) koşullarda tutun.
      NOT: İntraperitoneal enjeksiyon için gerekli doz 20 mg/kg b.w.23'tür.
    2. Aşağıdaki hesaplamaya göre 160 mg naringenin tartın: 20 mg/kg x 0,02 kg/fare x 10 fare x 5 gün/hafta x 8 hafta = 160 mg.
  3. İn vivo enjekte edilecek naringenin konsantrasyonunu hesaplayın.
    1. Farelerin vücut ağırlığına göre önerilen hacmi hazırlayın. Her fareye uygulanan önerilen naringenin hacmi, vücut ağırlığının% 1'idir (0.3 mL). Bu deneyde, fare başına 0.2 mL kullanılmıştır.
    2. Toplam hacmi hesaplayın: fare başına 0,2 mL x 10 fare x 5 gün/hafta x 8 hafta = 80 mL.
    3. Stoktaki Naringenin konsantrasyonunu hesaplayın: 160 mg / 80 mL çözücüler = 2 mg / mL.
    4. Her gün için hacmi hesaplayın: fare başına 0,2 mL x 10 fare = 2 mL.

2. Dağılma

  1. Etanol çözeltisi
    1. Naringenin çözeltisini 2 mg / mL'de hazırlamak için, 3.52 mg naringenin tartın ve 2.0 mL'lik bir tüpe ekleyin.
      NOT: 2 mg/mL'lik bir konsantrasyona ulaşmak için gereken toplam hacim 1760 μL olacaktır (hesaplama: 3.52 mg/1760 μL = 2 mg/mL).
    2. Naringenin tozunun tüpün dibine yerleşmesini sağlamak için hızla aşağı doğru dönün (30 s için 2000 x g) (Şekil 1A).
    3. Gerekli toplam hacme göre% 0.5'lik (v / v) bir çözelti hazırlamak için tüpe 8.8 μL% 100 etanol ekleyin2. Naringenin tamamen çözünmez (Şekil 1B).
    4. Gerekli toplam hacme göre% 5'lik (v / v) bir çözelti hazırlamak için tüpe 79.2 μL% 100 etanol eklemeye devam edin (hesaplama: (79.2 μL + 8.8 μL) / 1760 μL x% 100 =% 5). Naringenin tamamen çözünmez (Şekil 1B).
    5. Adım 2.1.4'te açıklandığı gibi% 5 etanol içeren tüpe 1672 μL% 0.9 PS ekleyin. Bu bir emülsiyon üretecektir (Şekil 1D). Santrifüj (30 s için 2000 x g) naringeninin çözelti içinde tamamen çözülüp çözülmediğini kontrol etmek için çözelti. Çözünmemiş naringeninin beyaz çökeltileri çözeltide görünür (Şekil 1E).
  2. DMSO çözümü
    1. Naringenin çözeltisini 2 mg / mL'de hazırlamak için, 3.95 mg naringenin tartın ve 2.0 mL'lik bir tüpe ekleyin.
      NOT: 2 mg/mL'lik bir konsantrasyona ulaşmak için gereken toplam hacim 1975 μL olacaktır (hesaplama: 3.95 mg/1975 μL = 2 mg/mL).
    2. Naringenin tozunun tüpün dibine yerleşmesini sağlamak için hızla aşağı doğru dönün (30 s için 2000 x g).
    3. %0,5'lik (v/v) bir çözelti hazırlamak için tüpe 9,8 μL DMSO ekleyin (hesaplama: 9,8 μL/1975 μL x %100 = %5). Naringenin tamamen çözülür (Şekil 2A).
    4. Gerekli toplam hacme göre% 5'lik (v / v) bir çözelti hazırlamak için tüpe 88.2 μL DMSO ekleyin (hesaplama: (88.2 μL + 9.8 μL) /1975 μL x% 100 =% 5). Naringenin tamamen çözülür (Şekil 2B).
    5. Adım 2.2.4'te hazırlanan çözeltiye %0,9 PS'lik 1877 μL (%95'in v/v) değerini ekleyin. Bir emülsiyon üretilir (Şekil 1C). Santrifüj (30 s için 2000 x g) naringeninin çözelti içinde tamamen çözülüp çözülmediğini kontrol etmek için çözelti. Çözünmemiş naringeninin beyaz çökeltileri çözeltide görünür (Şekil 1D).
  3. Ara-80 ve DMSO çözümü
    1. Naringenin çözeltisini 2 mg / mL'de hazırlamak için, 6.69 mg naringenin tartın ve 5.0 mL'lik bir tüpe ekleyin.
      NOT: 2 mg/mL'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için, gereken toplam çözelti hacmi 3345 μL olacaktır (hesaplama: 6.69 mg/3345 μL = 2 mg/mL).
    2. Naringenin tozunun tüpün dibine yerleşmesini sağlamak için hızla aşağı doğru dönün (30 s için 2000 x g).
    3. Gerekli toplam hacme göre %3,5'lik (v/v) bir çözelti hazırlamak için 117,7 μL DMSO ekleyin (hesaplama: 117,7 μL /3345 μL x %100 = %3,5). Naringenin tamamen çözünür (Şekil 3A)
    4. Adım 2.3.3'te hazırlanan çözeltiye 117,7 μL Tween 80 ekleyin ve %3,5 (v/v) DMSO'ya %3,5 (v/v) DMSO'ya ulaşın. Naringeninin tamamen çözünmesini gözlemleyin (Şekil 3B)
    5. Adım 2.3.4'te hazırlanan çözeltiyi, 3109.6 μL% 0.9 PS (% 93'ün v / v yüzdesi) içeren 5.0 mL'lik bir tüpe yavaşça ekleyin ve belirgin bir naringenin çözeltisi elde etmek için iyice sallayın (Şekil 3C).
    6. Adım 2.3.5'te hazırlanan çözeltinin 2 saat oda sıcaklığında (RT) kalmasına izin verin. Çözelti, görünür herhangi bir çökelti olmadan hala belirgindir (Şekil 3D).
  4. İn vivo uygulama için naringenin çözeltisinin hazırlanması
    1. Adım 1.2.2'ye göre, 160 mg naringenin (160 mg / 2 mg / mL = 80 mL) ağırlığındadır.
    2. %3,5 (v/d) çözelti elde etmek için 2,8 mL DMSO ekleyin (hesaplama: 2,8 mL / 80 mL x %100 = %3,5)
    3. Ardından, adım 2.4.2'de hazırlanan çözeltiye 2,8 mL Aralık 80 ekleyin ve %3,5 (v/v) DMSO'ya ulaşın.
    4. Adım 2.4.3'te hazırlanan çözeltiyi dört tüpe ayırın, tüp başına 1.4 mL [(2.8 mL + 2.8 mL) / 4 = 1.4 mL].
    5. Aliquot 18.6 mL% 0.9 PS ila beş 15 mL tüp.
    6. Adım 2.4.3'te (stok çözeltisi) ve 2.4.5'te hazırlanan çözeltiyi 4 °C'de (2,8 mL + 2,8 mL + 18,6 mL x 4 = 80 mL) saklayın.
    7. 140 μL stok çözeltisini alın (adım 2.4.3) ve 1 günlük uygulama için 2 mL naringenin çözeltisi hazırlamak için 1860 μL % 0.9 PS ile karıştırın.
    8. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtreden süzün.

3. Naringenin çözüm yönetimi

  1. Taşıma ve kısıtlama
    1. Kapağı açmadan önce kafese ve ellere% 70-75 alkol püskürtün. Fareyi kuyruğun tabanından kaldırın ve kuyruğunu yavaşça geriye doğru konumlandırmak için sağlam bir yüzeye yerleştirin.
    2. Boynun tırnağını kulakların arkasından sol baş parmağı ve işaret parmağı ile kavrayın ve kuyruğu küçük ve yüzük parmağı arasında konumlandırın. Fareyi, arka ucu hafifçe yükseltilmiş şekilde sırtüstü pozisyonda tutun.
  2. Enjeksiyon
    1. Farenin arka derisini kavrayın, böylece karın derisi gergin olur.
    2. Mesane, karaciğer veya diğer iç organlara çarpmamak için iğneyi (insülin şırıngası) iğne ile karın yüzeyi arasında, karnın sağ alt veya sol çeyreğinde 10 ° 'lik bir açıyla itin.
    3. İğneyi deri altından 3-5 mm boyunca kafatası yönünde çalıştırın ve ardından karın boşluğuna 45 ° 'lik bir açıyla yerleştirin.
    4. İğne karın duvarından geçtiğinde ve direnç kaybolduğunda, reflü materyalinin çekilmediğini doğrulamak için bir aspirasyon yapın. Ardından, çözümü yavaşça itin.
    5. Enjeksiyondan sonra, iğneyi yavaşça dışarı çekin ve sızıntıyı önlemek için hafifçe döndürün. Önerilen hacim 50-100 μL/10 g'dır.
    6. Artık Naringenin'i biyolojik tehlike kabına atın.

4. Kan şekeri testi

NOT: Enjeksiyondan 1 gün önce ve enjeksiyondan 1 ve 2 ay sonra kan şekerini test edin.

  1. Kan şekeri testinden önce fareleri 15 saat boyunca hızlandırın. Su sağlanmaya devam edilebilir.
  2. Test şeritlerini açın ve tarihi işaretleyin. Açıldıktan sonra, test şeritlerini 3 ay içinde kullanın. Test şeritlerini 2-30 °C'de saklayın. Nem oluşumunu önlemek için şeridi çıkardıktan sonra kapağı sıkıca kapatın.
  3. Hayvanı indüksiyon odasına yerleştirin. Buharlaştırıcıyı izofluran için% 4 ve oksijen için 4 L / dak indüksiyon seviyesinde açın. Hayvan tamamen anestezi altına alındıktan sonra, burun konisi ile anesteziyi ve anestezik dağıtımı izofluran için% 1.5 ve oksijen için 0.4 L / dak seviyesinde tutun.
  4. Kuyruğu% 70 -% 75 alkole batırılmış pamuk topları / çubuklarla silin.
  5. Kuyruğun en alçak noktasından başlayarak, 25G iğne dikeni ile yanal kuyruk damarında küçük bir delinme yapın ve bir damla kan sıkın.
  6. Kan damlasını bir kağıt mendille silin.
  7. Başka bir damla kan sıkın ve bir test şeridinin kenarında toplayın.
  8. Glikoz ölçüm cihazında görüntülenen sonucu okuyun ve kaydedin.
  9. Kanamayı durdurmak için, farenin kuyruğunu steril bir gazlı bezle sıkıştırın ve% 75 alkolle bölgeyi silin.
  10. Kuyruğu kraniyal olarak yukarı doğru hareket ettiren benzer bir teknikle ek örnekler elde edilebilir.

5. TRAP boyama

  1. Slayt hazırlama
    1. Farelerde haftada bir kez açlık kan şekeri testleri yapın. Kan şekeri seviyeleri 11.1 mmol / L'≥ olduğunda (başarılı tip II diyabet fareleri model 24'ün göstergesi), CO2 kullanarak fareleri ötenazi, ardından servikal disklokasyon ve Lomber 4'üncü-6'yı (L4-L6) toplayın (açlık kan şekeri testi yapılırken ötenazi yapılmaz).
    2. L4-L6 numunelerini 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin (paraformaldehit hacminin >dokunun hacminin 20 katı) olduğundan emin olun ve ardından sürekli musluk suyu akışında 2 saat boyunca yıkayın.
    3. Numuneleri dekalsifiye etmek için, numuneler yumuşayana kadar statik durumda RT'de 2 hafta boyunca% 10'luk bir etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisine batırın. Kireç çözücü çözeltinin hacminin, doku / numunenin hacminin 20-30 katı olduğundan emin olun. EDTA çözümünü her geçen gün değiştirin.
    4. Bir kurutucu kullanarak numuneyi kurutun.
      1. Örnekleri, kasetleri gömen doku işlemeye yerleştirin. Kaseti kalem kullanarak numaralandırın.
      2. Dehidratatör programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 2 saat için% 75 alkol, 1 saat için% 85 alkol, 1 saat için% 95 alkol, 2 saat için% 95 alkol, 2 saat için susuz etanol (I), 2 saat için susuz etanol (II), 2 saat için susuz etanol (III), 1 saat için ksilen (I), 1 saat için ksilen (II), 1 saat için ksilen (III), RT'de 2 saat boyunca parafin balmumu (I) ve 2 saat boyunca parafin balmumu (II).
    5. Örnekleri parafin mumuna gömün.
      1. Parafin gömme istasyonunun kaset tepsisine parafin mumu ekleyin ve 60 ° C'ye ısıtın. Susuz kalan örnekleri en az 2 saat batırın.
      2. Doku kasetini kaset tepsisine yerleştirin ve önceden ısıtın.
      3. Parafin rezervuarına parafin mumu ekleyin ve 60 ° C'ye ısıtın.
      4. 2 saat sonra, hem doku kasetini hem de örnekleri çalışma alanına götürün. Önceden ısıtılmış parafin mumunu parafin rezervuarından doku kasetine dökün. Numuneyi parafin mumuna yerleştirin, parafin mumunun dokuyu tamamen kapladığından emin olun ve ardından kaseti hemen bir buzlanma istasyonuna taşıyın.
      5. Parafin gömülü numuneleri 5-6 μm kesitlere ayırmak için bir mikrotom kullanın. Bölümleri 40 °C ılık suda 10 saniyeden daha kısa bir süre için açın. APS (amino silan) kaplı cam slaytlar üzerindeki bölümleri toplayın. Slaytları RT'de 1 saat kurutun ve ardından slaytları gece boyunca 60 ° C'de ayarlanmış bir fırına taşıyın.
  2. TRAP reaktif hazırlama
    1. Temel stok inkübasyon çözeltisi hazırlayın: 9.2 g sodyum asetat susuz, 11.4 g L-(+) tartarik asit ve 2.8 mL buzul asidini 1000 mL damıtılmış suda çözün. PH'ı 4.7-5.0'a ayarlayın ve RT'de 6 aya kadar saklayın.
    2. Naftol-eter çözeltisi hazırlayın: 0.1 g naftol AS-BI fosfatı 5 mL etilen glikol monoetil eter içinde çözün. 4 °C'de 5 haftaya kadar saklayın.
    3. Sodyum nitrit çözeltisi hazırlayın: 1 g sodyum nitriti 25 mL damıtılmış suda çözün. 4 °C'de saklayın.
    4. Pararosanilin boyasını hazırlayın: 20 mL 2N HCl'ye (417 mL suda 83 mL HCl) 1 g pararosanilin baz ekleyin. Tabanı çözmek için bir karıştırma plakası kullanın ve kullanmadan önce filtreleyin.
  3. TRAP boyama
    1. İki Coplin kavanozunu 50 mL temel stok inkübasyon çözeltisi ile doldurun ve 2 saat boyunca 37 °C'lik bir fırına koyun.
    2. Bir Coplin kavanoz alın ve 0,5 mL naptol-eter çözeltisi ekleyin.
    3. Slaytları Coplin kavanozuna yerleştirin ve 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
      NOT: Her grup için en az üç slayt hazırlayın.
    4. Kuluçka süresi bitmeden birkaç dakika önce, 1 mL sodyum nitrit çözeltisi ve 1 mL pararosanilin boyası ekleyin. 30 saniye boyunca hafifçe karıştırın ve 2 dakika bekletin.
    5. Adım 5.2.2'de hazırlanan çözeltiyi, temel stok çözeltisini içeren diğer önceden ısıtılmış Coplin kavanozuna ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırın ve slaytları Coplin kavanozundan adım 5.3.3'e yerleştirin.
    6. RT'de 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
    7. Dilimleri başka bir Coplin kavanozunda 200 mL PBS ile 5 dakika boyunca durulayın.
    8. Dilimleri bir Coplin kavanozunda 30 s boyunca% 100 hematoksilin ile karşı lekeleyin.
    9. Dilimleri her biri 2 dakika boyunca% 85,% 95 ve% 100 alkol (200 mL) ile dehidrate edin ve 3x için 2 dakika boyunca ksilen (200 mL) ile tedavi edin.
    10. Kapak camındaki bölümü reçine kullanarak bir kapak kayması ile sabitleyin. Hava kabarcıklarının sıkışmasını önlediğinizden emin olun.

6. ELISA

  1. Numune hazırlama
    1. Yumuşak dokuları femurdan ve farenin tibiasından çıkarın. Kemikleri gazlı bezle temizleyin.
    2. Kemik örneklerini 1 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpe yerleştirin ve numune tüplerini -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Numuneler ayrıca bir sıvı azot tankında en fazla 6 ay saklanabilir.
    3. Kemik örneğini tartın. 1:10 oranında %0,9 PS ile seyreltin. Örneğin, 0.1 g kemiği 1 mL PS ile seyreltin.
    4. Tüpe 3 mm zirkonya boncuk ekleyin ve numuneleri 70 Hz'de 30 sn boyunca 3 kat öğütün ve aralarında 20 s dinlendirin.
    5. Numuneleri 4 °C ve 12.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin. Süper natantı topla.
  2. ELISA tahlil kiti
    NOT: ELISA'yı üretici tarafından belirtilen tahlil protokolüne göre gerçekleştirin.
    1. Standart, boş ve numunenin her seyreltiminden 100 μL'sini uygun kuyucuklara ekleyin. 37 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin.
    2. Sıvıyı her bir kuyucuktan boşaltın ve 100 μL biyotinile tespit antikor çalışma çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    3. Çözeltiyi boşaltın, her bir oyuğa 350 μL yıkama tamponu ekleyin. 1 dakika bekletin, 3x tekrarlayın.
    4. Her bir kuyucuğa 100 μL HRP konjuge çalışma çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. Çözümü boşaltın. Yıkama işlemini adım 6.2.3'te açıklandığı gibi 5 kat tekrarlayın.
    6. Substrat reaktifinden 90 μL ekleyin. Işıktan korunan 37 °C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    7. Durdurma çözeltisinden 50 μL ekleyin.
  3. Her bir kuyucuğun emiciliğini 450 nm'de kaydetmek için bir plaka okuyucu kullanın.
  4. Standart eğri oluşturma
    1. İlgili ortalama absorbans değerlerini, seri olarak seyreltilmiş protein konsantrasyonlarına karşı çizin.
    2. En uygun eğriyi oluşturmak için noktaları birleştirin. Standart eğri denklemini oluşturmak için uygun herhangi bir bilgisayar uygulamasını (elektronik tablo) kullanın.
  5. İlgili numunenin konsantrasyonunu elde etmek için standart eğri denklemindeki her numunenin absorbans değerini değiştirin.

Sonuçlar

Yüksek yağlı diyetle beslenen ve STZ ile indüklenen diyabetik farelerin vücut ağırlığının, STZ tedavisinden 0-8 hafta sonra kontrol gruplarınınkine kıyasla azaldığı bulunmuştur. Naringenin ile tedavi edilen farelerin kilo kaybı, 4. haftada tedavi edilmeyen farelere (STZ grubu) kıyasla anlamlıydı. Kontrol ve STZ grupları aynı hacimde PS ile uygulandı (Tablo 1). Diyabetik farelerde kan şekeri seviyesi, STZ indüksiyonundan sonraki 1 ay içinde çarpıcı bir şekilde artmıştır....

Tartışmalar

Fitokimyasal çözeltinin hazırlanması, in vivo uygulamasının temelidir. Bu protokolde, naringenin çözeltisinin hazırlanması, etanol, DMSO, Ara% 80 ve% 0.9 PS gibi farklı çözücüler kullanılarak gösterilmiştir. Tamamen çözünmüş durumdaki çözeltinin, uzun saatler boyunca oda sıcaklığında kalmasına izin verilerek daha fazla izlenmesi ve daha sonra in vivo kullanılmadan önce filtrelenmesi gerekir.

Solvent tayini bu protokolde kritik bir adımdır. Bi...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973607 ve 81573992) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL  microtubesCorning Science (Wujiang) Co.23218392Holding liquid
Automatic DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA ASP 300SDehydrate samples
Blood glucose test stripsJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.4130392
CentrifugeMIULABMinute centrifugeCentrifugal solution
DehydratorLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA  ASP300SDehydration
DMSOSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E918BA0041Co-Solvent
ELISA assay kitElabscience Biotechnology Co.,LtdMouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c
Mouse  CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c
Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c
Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c
Ethanol absoluteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218Co-Solvent
Ethylene glycol monoethyl etherSangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.A501118-0500TRAP staining
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009617Decalcification
FilterMerck Millpore LTD.Millex-GP, 0.22 µmfilter solution
Glacial acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10000218TRAP staining
Glucose meterJohnson & Johnson (China) Medical Equipment Co.One Touch Ultra VueSerial number:COJJG8GW
GrinderShanghaijingxin Experimental TechnologyTissuelyser-24
HematoxylinNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteD005TRAP staining
Insulin syringeShanghai Kantaray Medical Devices Co.0.33 mm x 13 mm, RW LBIntraperitoneal injection
L-(+) tartaric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd100220008TRAP staining
MicroscopeOLYMPUSsz61Observation
MicrotomeLeica Microsystems (Shanghai) Trading Co.LEICA RM 2135Section
Mini centrifugeHangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. Mini-6KCCentrifuge
Naphthol AS-BI phosphateSIGMA-ALDRICHBCBS3419TRAP staining
NaringeninJiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd102764Solute
Paraffin Embedding stationLeica Microsystems (Shanghai) Co.LEICA  EG 1150 H, LEICA  EG 1150 CEmbed  samples
Pararosaniline baseBBI Life SciencesE112BA0045TRAP staining
Pipetteseppendorf2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL  transferre Liquid
Plate readerBioTek Instruments USA, Inc.BioTek CYTATION 3 imaging readerELISA
ResinShanghai Yyang Instrument Co., Ltd.Neutral balsamTRAP staining
saline (0.9 PS)Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,LtdA6E1323Solvent
Sodium acetate anhydrousSinopharm Chemical ReagentCo., LtdMerck-1.06268.0250 | 250gTRAP staining
Sodium nitriteSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10020018TRAP staining
Tween-80Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd.E819BA0006Emulsifier
Zirconia beadsShanghaijingxin Experimental Technology11079125z 454gGrinding

Referanslar

  1. Stoye, D. Solvents. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
  2. Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
  3. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
  4. Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
  5. Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
  6. Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
  7. Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
  8. Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
  9. Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
  10. Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
  11. Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
  12. Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat's brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
  13. Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
  14. Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
  15. Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
  16. Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
  17. Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
  18. Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
  19. Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
  20. Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
  21. Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
  22. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
  23. Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
  24. Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
  25. Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
  26. Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
  27. Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
  28. van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  29. Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
  30. Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
  31. Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single--and repeated--dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
  32. Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
  33. Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 174bile ikz cetanolDMSOAra 80naringenindiyabetik osteoporozkan ekeri testiTRAP boyamaELISA testifarein vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır