JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yüksek hücresel çözünürlüğe sahip bir ATP taşıyıcısı olan nonhidrolize floresan adenozin trifosfatın (ATP) içselleştirilmesini görselleştirmek için tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdik. Yöntemimizi bağımsız in vitro ve in vivo tahlil-insan tümör hücre hatları ve insan tümör dokusu ile ksinografted immün yetmezlikli fareler kullanarak doğruladık.

Özet

Hücre dışı ATP (eATP) de dahil olmak üzere adenozin trifosfatın (ATP) ilaç direnci, epitel-mezenkimal geçiş (EMT) ve metastaz gibi tümöregenezin çeşitli yönlerinde önemli roller oynadığı gösterilmiştir. İntratümoral eATP, konsantrasyonda normal dokulara göre 103 ila10 kat daha yüksektir. eATP, EMT indüksiyonu için pürinerjik sinyali etkinleştirmek için bir haberci olarak işlev görmekle birlikte, çok çeşitli biyolojik işlevleri yerine getirmek için belirli bir endositoz türü olan upregulated makropinositoz yoluyla kanser hücreleri tarafından içselleştirilir. Bu işlevler arasında ATP gerektiren biyokimyasal reaksiyonlara enerji sağlamak, sinyal transdüksiyon sırasında fosfat gruplarını bağışlamak ve transkripsiyonel bir kofaktör olarak gen ekspresyonunu kolaylaştırmak veya hızlandırmak saymaktadır. ATP hazır ve kanser ve diğer alanlardaki çalışmaları şüphesiz artacaktır. Bununla birlikte, eATP çalışması erken bir aşamada kalır ve eATP ve içselleştirilmiş hücre içi ATP tarafından oynanan önemli ve çok yönlü faaliyetler tam olarak çözülmeden çözülmemiş sorular cevapsız kalır.

Bu yazarların laboratuvarlarının bu erken eATP çalışmalarına katkıları arasında, eATP içselleştirme sürecini izlemek ve karakterize etmek için makropinositoz ve endositoz izleyicilerinin yanı sıra çeşitli endositoz inhibitörleri olarak hizmet veren yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı floresan dekstrans ile birlikte hidrolize edilemeyen floresan ATP'nin mikroskobik görüntülemesi yer almaktadır. Bu görüntüleme yöntemi tümör hücre hatlarına ve insan kanseri tümörleri ile ksinografe edilmiş immün yetmez farelere, eATP içselleştirme in vitro ve in vivoincelemek için uygulanmıştır. Bu makalede, makropinositoz-/endositoz aracılı eATP içselleştirme testlerinin farklı sistemlerde başarıyla yapılabilmesi için test koşullarının değiştirilmesi ve ince ayarlanmasına vurgu yaparak bu in vitro ve in vivo protokoller açıklanmaktadır.

Giriş

İntratümoral hücre dışı (yani) besinlerin fırsatçı alımı son zamanlarda kanser metabolizması için önemli bir ayırt edici işaret olarak adlandırılmıştır1. Bu önemli besinlerden biri ATP'dir, çünkü ieATP konsantrasyonu normal dokularda bulunandan 103 ve10 4 kat daha yüksektir, birkaç yüz μM ila düşük mM 2,3,4,5aralığındadır. Önemli bir enerji ve sinyal molekülü olarak ATP, kanserli ve sağlıklı hücrelerde hücresel metabolizmada merkezi bir rol oynar6,7,8. Hücre dışı ATP sadece kanser hücresi büyümesinde yer almaz, aynı zamanda ilaç direncini de teşvik eder9. Atp'nin hidrotropik aktivite gibi daha önce tanınmayan işlevleri yakın zamanda tanımlanmıştır, böylece ALZHEIMER10gibi hastalıklara ATP katılımını bu işe bulaşmıştır. Gerçekten de, ATP ve kanser hücrelerindeki, sağlıklı hücrelerdeki ve diğer hastalıklı hücrelerdeki işlevlerini anlamamız tamamlanmaktan uzak görünüyor. Bununla birlikte, ATP'nin kararsızlığı ve hücrelerdeki yüksek ciro oranları nedeniyle, ATP'nin hücre zarı boyunca ve hücre içine hareketini izlemek teknik olarak zordur.

Bu sorunu gidermek ve bu araştırma alanının ihtiyacını gidermek için, hem in vitro hem de in vivo11 ,12'de, ATP'nin içselleştirilmesini görselleştirmek ve içselleştirilmiş ATP'nin hücre içi mekansal lokalizasyonunu gözlemlemek için sulandırılamaz floresan ATP'nin (NHF-ATP)(Şekil1)taşıyıcı olarak kullanıldığı bir yöntem geliştirilmiştir. . NHF-ATP'nin, hem kanser hücre hatlarında hem de immün yetmez farelerde ksinografe edilen insan tümör dokusunda hayvan hücre zarları boyunca ATP hareketini araştırmak için endojen ATP'nin yerini11,12'ye koyduğu gösterilmiştir. Ayrıca, hücrelere makropinositoz inhibitörlerinin uygulanması eATP içselleştirmesini engelledi, eATP'nin hücre içi alımının makropinositotik bir mekanizma içerdiğini düşündürdü9,11,12. Bu protokol, hücreye özgü proteinlere karşı immünobaslı kolabelingine ve böylece hangi hücre tipinin NHF-ATP'yi içselleştirdiğine izin veriyor. In vivo tümör ksinograftları ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak, NHF-ATP doku örneğinde ve hatta tek bir hücre içinde mekansal olarak görselleştirilebilir. Bu yöntemler ayrıca hücresel alım yüzdesi, makropinositotik vezikül sayısı ve içselleştirme kinetiği gibi nicel analize izin sağlar. Bu makalede, NHF-ATP'nin, tek başına veya endositoz-izleyici floresan dekstrans13 , 14,15,16ile birlikte çalışarak, hücrelerdeki içselleştirmeyi takiben ATP'nin içselleştirmesini ve hücre içi lokalizasyonunu incelemek için farklı deneysel ortamlarda nasıl kullanılabileceği ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

figure-introduction-3385
Şekil 1: Yüksek moleküler ağırlık floresan dektran etiketli nonhidrolize floresan ATP ve tetrametrinrodamin yapıları. (A) NHF-ATP yapısı. (B) HMWFD'nin şematik gösterimi. Kısaltmalar: ATP = adenozin trifosfat; NHF-ATP = sulanamayan floresan ATP; TMR = tetrametilrhodamin; HMWFD = yüksek moleküler ağırlıklı floresan dektran. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Burada bildirilen tüm prosedürler Ohio Üniversitesi'nin IACUC ve NIH'ye uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Sulandırılamaz floresan ATP (NHF-ATP) ve dekstrans seçimi

  1. Florofor konjuge NHF-ATP (Şekil 1A) ve endositoz izleyiciler seçin, yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı floresan dekstrans (TMR-HMWFD ve TMR-LMWFD) (Şekil 1B), tercih edilen emisyon dalga boylarına (örneğin, uygun filtrelerle donatılmış görüntüleme sistemi) ve çalışılacak spesifik endositoz sürecine dayanmaktadır.

2. ATP lokalizasyon çalışmaları, in vitro (Şekil 2)

figure-protocol-787
Şekil 2: ATP içselleştirmesini incelemek için in vitro prosedür. Floresan mikroskopi kullanılarak kültürlü kanser hücrelerinde hücre dışı ATP'nin içselleştirilmesini görselleştirmek için protokolün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Hücre kültürü ve hücrelerin hazırlanması
    NOT: Doku kültürü başlığında steril koşullar altında hücre kültürünü gerçekleştirin.
    1. %10 (v/v) fetal sığır serumu (FBS) ve %1 (v/v) penisilin/streptomisin (bundan böyle D olarak anılacaktır) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) hazırını hazırlayınMEM/FBS), steril fosfat tamponlu salin (PBS) ve %0,25 tripsin/etileniaminetetraasetik asit (EDTA), 37 °C su banyosunda.
    2. DMEM/FBS'deki insan kanser hücrelerini 100 mm'lik doku kültürü çanasında kültür edin. %5 CO2 atmosferi ile hücreleri 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatörde sakla.
    3. Hücreler birleştiğinde, önce kültür ortamını çıkararak hücreleri geçiştirin. Ardından, yemeği 5 mL steril PBS ile durulayın, PBS'yi çıkarın ve% 0.25 tripsin 3 mL ekleyin. 5 dakika boyunca% 5 CO2 atmosferde 37 ° C'de kuluçkaya yaslanın.
    4. Çanağı alın, ardından trypnization durdurmak için 6 mL DMEM / FBS ekleyin. Süspansiyondaki hücreleri 15 mL konik bir tüpe ve hücreleri peletmek için 5 dakika boyunca 800 × g'da santrifüje aktarın.
    5. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı epire edin ve hücre peletini pipetleme ile yeniden kullanmak için 10 mL DMEM /FBS kullanın.
    6. Hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını sayın. Hücre süspansiyonu ~7,5 × 104 hücre/mL yoğunluğa seyreltmek için DMEM/FBS kullanın.
  2. Kapak örtülerinin ve tohumlama hücrelerinin hazırlanması
    1. 12 mm kapakları% 70 etanol ile yıkayın ve hassas görev mendilleriyle dikkatlice silin. Kapakları ve bir çift asayı otomatik kaplayarak sterilize edin.
    2. Bir doku kültürü başlığında, 24 kuyulu bir doku kültürü plakasının her kuyusuna bir kapak parçası yerleştirmek için tokmaklar kullanın.
      NOT: Daha sonra, hücreli kapak, görüntüleme için doğrudan bir mikroskop slaydına monte edilecektir.
    3. Hücre süspansiyonunun 300 μL'lik kısmını (DMEM/FBS'deki hücreler), kuyu başına ~2,5 × 104 hücrelik bir tohumlama yoğunluğunda sterilize edilmiş kapakları içeren 24 kuyu plakasına dağıtın. %5 CO2 akışı ile 37 °C'de steril koşullarda kuluçkaya yaslanın.
  3. Hücrelerin açlığı
    1. Tohumlamadan yirmi dört saat sonra, DMEM /FBS'yi her kuyudan çıkarın. Hücre dışı besin maddelerinin alınmasına neden olmak için hücreleri 15-18 saat serum açlığı yapmak için her kuyuya hemen 300 μL önceden ısıtılan serumsuz DMEM ekleyin.
      NOT: 15-18 saat açlık süresi kritik bir parametredir.
  4. NHF-ATP ve HMWFD/LMWFD çözümlerinin hazırlanması
    1. Yüksek moleküler ağırlıklı (70 kDa) floresan TMR-dekstran (TMR-HMWFD, 1 mg/mL), makropinozomları görselleştirmek için bir izleyici veya 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde serumsuz DMEM'de NHF-ATP (10 μmol/L) tartmak için analitik bir terazi kullanın. Işıktan korunan tüpleri 15 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
    2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj. Berrak süpernatantı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne dikkatlice aktarın, çözünmeyen kristalleri çıkarmak için herhangi bir pelet veya döküntüğü bozulmadan bırakın.
    3. 2.4.1 adımındaki çözümleri her kuyudaki hücrelere ekleyin ve hücreleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: HMWFD ve NHF-ATP çözümleri hücrelerle birlikte inkübasyon için karıştırılacaksa, her iki çözeltiyi de son konsantrasyonların 2 katı kadar hazırlayın. Çözümler daha sonra 1:1 oranında karıştırılarak son doğru çalışma konsantrasyonlarına ulaşılacaktır. Reaktifler ışığa duyarlı olduğundan ışıktan kaçının.
  5. Hücrelerin tedavisi ve fiksasyon
    1. 24 kuyulu taze bir tabakta, beş kuyunun her birine 500 μL önceden ısıtilmiş PBS dağıtın.
    2. Hücre inkübasyonundan sonra, her kapak kapağının toparlamalarını dikkatlice alın. Her kapak kapağını 500 μL önceden ısıtılmış PBS'ye batırarak durulayın. PBS dolu beş kuyuyu kullanarak beş kez tekrarlayın.
      NOT: Kapaklardaki hücrelerin nazik bir şekilde yıkanması bu deneyin başarısı için kritik öneme sahiptir.
    3. Son PBS yıkama işleminden sonra, ekstra PBS'yi emmek için hassas bir görev mendiline kapak kapağına dokunun ve kapak sıvısını hemen 24 kuyulu bir plakaya önceden yüklenmiş% 3,7 formaldehit soğuğa (4 °C) aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika sabitlayın.
    4. Hücreler sabitlenirken, mikroskop ön temizliği % 70 etanol ile kayar. Kapakları kuyulardan çıkarın ve kapak her kapak için 4′, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) içeren 5 μL sulu montaj ortamını kullanarak slaytlara monte edin. Fazla PBS'i bir kağıt havlu veya hassas bir görev mendili ile hafifçe lekeleyin.
  6. Floresan mikroskopi ve görüntü alımı
    1. Yukarıdaki adımlardan iki ila 24 saat sonra, bir epifluoresans görüntüleme sistemi ve veri toplama yazılımı kullanarak hücrelerin görüntülerini yakalayın ve HMWFD ve / veya NHF-ATP'yi içselleştirdi.
      NOT: Bu alt bölümde, epifluoresans görüntüleme özelliği ve Nikon NIS Elements yazılımı ile donatılmış bir Nikon NiU mikroskobu kullanarak görüntü edinme adımları açıklanmaktadır. Bununla birlikte, diğer karşılaştırılabilir görüntüleme sistemleri ve alım yazılımları kullanılabilir. Üreticinin kullanım yönergelerini izleyin.
      1. Slaytı dürbün modunda dik bir epifluoresans mikroskobu sahnesine yerleştirin. Görüntüleme programına erişin.
      2. 10x hedefini seçin, odağı tanımlamak için sahneyi ayarlayın ve ilgi alanlarını tanımlamak için slaydı soldan sağa serpantin bir şekilde tarayın.
        NOT: İlgi alanlarının belirlenmesi hücre tipleri arasında değişecektir, bazı hücre hatları /kanser tipleri çeşitli ve farklı derecelerde TMR-HMWFD ve/veya NHF-ATP alımı sergiler.
      3. 40x hedefini seçin ve mikroskop üzerindeki düğmeyi kullanarak dürbün modundan görüntü yakalama moduna geçin.
      4. Görüntüleri görüntülemek ve daha sonra elde etmek için görüntüleme programındaki Canlı Kalite simgesine tıklayın.
      5. Ek Açıklamalar ve Ölçümler araç çubuğundaki OC Paneli'ni kullanarak, her filtre küpü veya floresan kanalı için pozlama parametrelerini tanımlayın.
        NOT: Sinyal yoğunlukları farklı olduğundan, her kanal için uygun pozlama süresini seçin. Örneğin, DAPI için 200 ms, HMWFD için 2 s ve NHF-ATP için 4 s pozlama süresi seçin. Pozlama süresi kanal başına belirlendikten sonra, farklı tedavi veya koşullara sahip tüm görüntüler için kanal başına bu ayarı kullanın.
      6. Pozlama ayarları her kanal için ayarlandıktan sonra, tanımlanan pozlama ayarlarına sahip 3 kanallı bir görüntü elde etmek için çok kanallı alma araç çubuğunu kullanın.
        NOT: Çok kanallı ND alma modu aracılığıyla görüntü alma, aynı görüş alanının her kanalı için otomatik görüntü yakalamayı sağlar. Deklanşör taret değişiklikleri arasında otomatik olarak kapatılsın.
      7. Alternatif olarak, filtre küpleri arasında geçiş yaparak, pozlama süresini ayarlayarak, her kanal için görüntü alımı arasında deklanşörü kapatarak/açarak ve tek tek kanallar için çekilen her görüntüyü üst üste koyarak çok kanallı görüntüleri manuel olarak elde edin.
        NOT: ND alma modu bu işlemi otomatikleştirir ve birleştirilmiş görüntüler sağlar.
      8. Görüntüyü .nd2 dosyası olarak kaydedin (Nikon Elements biçimi meta verileri kaydeder). Birleştirilmiş kanal görüntüsü ve tek tek kanal görüntüleri de dahil olmak üzere TIF dosyalarını kaydedin.
        NOT: TIF dosyaları yazılım uygulamalarının daha geniş bir seçim ile kullanılabilir.
      9. Kaydedilmiş bir .nd2 görüntü dosyasındaki NHF-ATP,TMR-HMWFD ve/veya TMR-LMWFD pozitif hücrelerin sayısını saymak için Çözümleme araç çubuğundaki Nesne Sayısı özelliğini kullanın.
      10. Verileri analiz programı aracılığıyla bir elektronik tabloya verin.
  7. Veri nicelemesi ve analizi
    1. Test edilen her durum için, görüntü niceleme için 50 ila 100 hücre. Veri analiz yazılımını (epifluoresans görüntüleme sistemine veya diğer yazılımlara dahil edilen yazılım) kullanarak, hücre başına ortalama floresan vesikül sayısını sayın ve hesaplayın.
    2. Nicel sonuçları analiz etmek için uygun istatistiksel yöntemleri kullanın.

3. Tümörlerde ATP içselleştirme, ex vivo (Şekil 3)

figure-protocol-9764
Şekil 3: ATP içselleştirmesini incelemek için in vivo prosedür. Kriyoseksiyon ve floresan mikroskopi kullanılarak tümör ksinograftlarında hücre dışı ATP'nin içselleştirilmesini görselleştirmek için protokolün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Hücre kültürlerinin implantasyona hazırlanması
    1. FBS ile desteklenmiş DMEM kullanarak 225 cm 2 şişede 37 °C'de kanser hücrelerini%80 izdihama, %10 (v/v) nihai konsantrasyona ve %1'de (v/v) penisilin/streptomisinin son konsantrasyonuna kadar büyütün.
    2. Hücreleri 10 mL PBS ile iki kez yıkayın. Önceden ısınma 0.25% trypsin / EDTA ila 37 °C. 8 mL tripsin/EDTA ekleyin ve 37 °C'de 2 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Hücreler şişenin altından ayırmaya başladıktan sonra, 8 mL DMEM / FBS eklemek için 10 mL steril serolojik pipet kullanın. Herhangi bir yapışan hücreyi yerinden çıkarmak için iki kez aspire edin. Kopuk hücreleri şişeden 50 mL konik bir tüpe aktarmak için pipeti kullanın.
    4. 10 mL pipet kullanarak 10 mL DMEM/FBS ekleyin ve kalan tüm yüzen hücreleri aynı 50 mL konik tüpte toplayın.
    5. Hücre süspansiyonu 600 × g, 4 °C'de 4 dakika santrifüj. Üstnatant çıkarın ve 1 mL buz gibi PBS hücreleri resuspend.
    6. Hemositometre kullanarak hücre yoğunluğunu sayın. Sayarken hücre süspansiyonu buzda tutun.
    7. Hücre süspansiyonu 600 × g, 4 °C'de 4 dakika santrifüj. Üstnatant çıkarın ve hücre yoğunluğu PBS başına 5 × 106 hücre olacak şekilde buz gibi PBS hücreleri askıya. Hücre süspansiyonu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  2. Ksinograft tümör gelişimi için kanser hücrelerinin deri altı enjeksiyonu
    1. Kanser hücresi enjeksiyonu için hassas bir kayma iğnesi (27 G iğne) ile lateks içermeyen bir şırınga (1 mL) kullanın.
    2. Hücre süspansiyonu (5 × 106 in 100 μL PBS) 1,5mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri şırındağa çekin.
    3. İmmün yetmezlikli (çıplak) bir farenin kanadında bir enjeksiyon bölgesi seçin ve cildi% 75 etanol kullanarak hafifçe temizleyin. Hassas bir görev silme ile fazla etanol silin.
    4. Deri altı enjeksiyonu için iğneyi cilde yaklaşık 10° açıyla tutun. İğne ucunu, eğim tarafını cildin hemen altına yerleştirin, böylece iğnenin sadece 1-2 mm'si cildin dışında görülebilir. Hücreleri şırınnadan yaklaşık 10 sn üzerinde yavaşça dağıtın.
    5. Tüm hacmi enjekte ettikten sonra, iğneyi 3-5 sn yerinde tutmaya devam edin, ardından iğneyi çekin ve enjekte edilen içeriğin sızmasını önlemek için enjeksiyon bölgesine 3-5 saniye daha yumuşak ama sıkı basınç uygulamak için bir parmak kullanın.
    6. Tümörler 200-500 mm3hacme ulaşana kadar vernier kaliperler kullanarak tümör büyümesini izleyin ve ölçün.
  3. Tümör sonrası rezeksiyon kullanılacak HMWFD ve NHF-ATP çözümlerinin hazırlanması
    1. Serumsuz DMEM'de (kültür ortamı) 300 μL 16 mg/mL HMWFD çözün, 37 °C'lik bir su banyosunda 30 dakika kuluçkaya yatırın ve yukarıda açıklandığı gibi 5 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüj. Çözeltiyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    2. 0,2 mM NHF-ATP çözümü hazırlamak için 160 μL serumsuz DMEM'e 40 μL NHF-ATP analog stoğu (1 mM) ekleyin.
  4. Deneysel kuyuların hazırlanması
    NOT: Bu deneysel tasarım, makropinozomların alımını gösteren HMWFD + NHF-ATP'nin hücre içi içselleştirilmesini test edecektir.
    1. Kuyuları aşağıdaki gibi hazırlayın: Kuyu #1, Kontrol: 200 μL serumsuz DMEM; Peki #2, Kontrol: 100 μL 16 mg/mL LMWFD + 100 μL serumsuz DMEM = 200 μL 8 mg/mL LMWFD; Peki #3, Kontrol: 100 μL 0.2 mM NHF-ATP + 100 μL serumsuz DMEM = 200 μL 0.1 mM NHF-ATP; Peki #4; Deneysel: 100 μL 16 mg/mL HMWFD + 100 μL 0.2m NHF-ATP = 200 μL 0.1 mM NHF-ATP ve 8 mg/mL HMWFD.
  5. Tümör dokularının hazırlanması
    1. Fareyi servikal çıkık veya IACUC onaylı protokole göre ötenazi.
    2. İzole tümörleri ~500-1.000 μm kalınlığında dilimlemek için 10 numara bir neşter kullanın.
    3. Tümör dilimlerini serumsuz DMEM'de 100 μM NHF-ATP ve/veya 8 mg/mL H/LMWFD ile mikrosantrifüj tüplerde %5 CO2 akışı ile 37 °C'de 40 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Kuluçkadan sonra tümör doku metabolizması ortamın renginin değişmesine neden olur.
    4. Dokuları önceden ısıtılmış 37 °C PBS'de durulayın (24 kuyulu bir plakada her durulama için 2 mL).
    5. Dokuyu önceden ısıtılmış taze PBS ile 24 kuyulu yeni bir tabağa aktarın, durulayın ve hafifçe sallayarak dört kez tekrarlayın.
  6. Kriyo gömme (donmuş doku bloklarının hazırlanması)
    1. Hasat edilecek her tümör için tanımlama etiketleri hazırlayın. 2 cm'lik bir laboratuvar bandı kesin ve ikiye katlayın, yapışkan yanlar uzunlamasına. Etiketi etiketlemek için bir işaret kalemi kullanın, örneğin fare/tümör kimlik numarasıyla.
    2. Paslanmaz çelik doku kalıplarını doğrudan kuru buzun üzerine yerleştirerek gömme kalıpları hazırlayın.
      NOT: Kuru buz donmaya, yanıklara ve boğulmaya neden olabilir. Kuru buz kullanırken yalıtımlı eldiven giyin. İyi havalandırılmış bir alanda kuru buz kullanın. Kuru buzları sıkıca kapatılmış bir kapta saklamayın. Bunun yerine, gazın kaçmasını sağlayan bir kapta (strafor soğutucu gibi) saklayın.
    3. Kalıp ürperirken, 10 mm'lik bir doku kültürü plakasına küçük bir doku dondurma ortamı havuzu yerleştirin. Hasat edilecek tümör dokusunu batırmak için hacmin yeterli olduğundan emin olun.
    4. Resected tümör dokusunu kepçe ve hemen doku su altında emin olmak için donma ortamına yerleştirin delikli bir kaşık kullanın. Delikli kaşığı kullanarak, dokuyu donma ortamında hafifçe yuvarlayın, ortamın tüm doku yüzeylerini yıkadıklarından emin olun.
    5. Dokuyu, donma ortamını içeren gömme kalıbına dikkatlice hareket ettirin. Donmak için ilgili etiket etiketini donma ortamına/kalıbına dikey olarak yerleştirin. Yazılı etiketin ortamın dışında görünür olduğundan emin olun.
    6. Donma tamamlandığında (donma ortamı opak-beyaza dönüşür), doku bloğunu kalıptan çıkarın, kuru buza yerleştirin ve her tümör için tekrarlayın. Doku bloklarını kriyoseksiyon işleminden önce birkaç ay boyunca -80 °C'de saklayın.
  7. Doku örneklerinin slaytlarının hazırlanması
    1. İçselleştirme pozitif hücreler bulma ve daha fazla temsili doku bölgesine sahip olma şansını en üst düzeye çıkarmak için, bir kriyostat kullanarak -18 ila -20 ° C'de seri kriyoeksiyonları toplayın.
      1. Önsezi kriyostat aletleri (bıçak, jilet, anti-roll plaka, doku aynası tutucu, boya fırçası) ve tümör doku bloklarını -18 ila -20 ° C'de bir kriyostat odasına yerleştirerek aşındırın. Bıçak tutucu açısını 5-10° olarak ayarlayın. Doku bloğunu gerektiği gibi bir jiletle dikkatlice kırpın ve doku dondurma ortamını "tutkal" olarak kullanarak ayna tutucuya monte edin.
      2. Mandreni, el krankının her dönüşüyle ayarlanan mesafeye (örneğin, 10 μm) yükselen mikrotom ünitesindeki dikey konuma kilitleyin. Anti-roll plakasını bıçağın yüksekliğinin hemen üzerinde dinecek şekilde konumlandırın. Mikrotom ilerlemeden önce doku kıvrılmasını önlemek için başparmağı doku bloğunun alt kenarı üzerinde dikkatlice kaydırın.
      3. Mikrotom ilerledikçe ve doku bölümü metal plakaya düştükçe, doku bölümünü yönlendirmek ve gerekirse dokuyu çıkarmak için bir boya fırçası kullanın.
      4. Mikroskop kaydırağı dokunmadan doku bölümünün üzerine getirin, böylece bölüm slayda çekilir.
        NOT: Kriyostat bıçakları (yüksek profilli, tek kullanımlık) son derece keskindir ve ciddi yaralanmalara neden olabilir. Bıçakları kullanırken ve kriyostat kullanırken dikkatli olun. Varsa bir bıçak koruyucu kullanın. Uygun eğitim gereklidir.
      5. Tümörü 10 μm kalınlığında bölümlere ayırın. Dilimlenmiş bölümleri hemen pozitif yüklü bir cam mikroskop kaydırağı üzerine aktarın.
        NOT: Seri bölümler için, önce pozitif yüklü sekiz slaytın her birinin sol üst köşesine 10 μm kalınlığında bir bölüm toplayın. Kriyostatı sonraki 100-200 μm doku boyunca ilerletin ve dokuyu atın. Tüm dilimlenmiş bölümleri hemen cam mikroskop slaytlarına aktarın.
      6. Ardından, sekiz slaytın her biri için önceden yerleştirilmiş doku bölümünün yanında 10 μm kalınlığında başka bir bölüm toplayın. Sekiz slaytın her biri her biri 100-200 μm aralıklı sekiz doku bölümü içerene kadar bu seri toplama işlemini tekrarlayın. Floresan korumak için doku bölümlerini karanlıkta tutun.
        NOT: Slaytlardaki doku bölümleri birkaç ay boyunca -80 °C'de bir slayt kutusunda saklanabilir.
  8. Doku slaytlarının sabitlenmesi
    1. KRİtİk ADIM: Doku bölümlerini -18 ila -20 °C'de %95 etanolde 5 dakikaya sabitle.
    2. Sabit bölümü oda sıcaklığı PBS ile 5 dakika yıkayın ve ardından dapi ile sulu bir montaj ortamının 10 μL'si kullanılarak sabit tümör bölümlerini cam bir kapak altlığa monte edin.
    3. Montajdan sonra 12 ila 24 saat, sabit tümör bölümlerini floresan mikroskopi ile inceleyin ve yukarıdaki kültürlü hücreler için açıklandığı gibi görüntüler elde edin.
  9. Floresan mikroskopi ve görüntü alımı
    1. Bölüm 2.6'da açıklandığı gibi ilgi çekici bölgeleri belirleyin ve görüntüler elde edin.
  10. Veri nicelemesi ve analizi
    1. Bölüm 2.7'de olduğu gibi hücreleri ölçün ve uygun istatistiksel analizleri uygulayın.

4. Tümörlerde ATP içselleştirme, in vivo

  1. Bölüm 3.1'de açıklandığı gibi hücre kültürlerini implantasyona hazırlayın.
  2. Ksinograft tümör gelişimi için kanser hücrelerinin deri altı enjeksiyonu
    1. Bölüm 3.2'de açıklandığı gibi ksinografted tümörler oluşturun.
  3. Ksinograft tümörlerine ATP ve/veya dektran enjeksiyonu
    1. DMEM'de NHF-ATP (100 μM) olsun veya olmamdan DMEM (araç) veya 8 mg/mL HMWFD veya LMWFD'nin tedavi çözümlerini yukarıda açıklandığı gibi hazırlayın.
    2. Bir tedavi çözeltisinin 50 μL'sini toplamak ve çözeltiyi doğrudan her ksinograft tümörüne enjekte etmek için 1 mL şırınna kullanın. Her tedavinin dört biyolojik tekrarı için prosedürü tekrarlayın.
  4. Doku hasadı ve kriyo gömme
    1. Hasat edilecek her tümör için tanımlama etiketleri hazırlayın. 2 cm'lik bir laboratuvar bandı kesin ve ikiye katlayın, yapışkan yanlar uzunlamasına. Etiketi etiketlemek için bir işaret kalemi kullanın, örneğin fare/tümör kimlik numarasıyla.
    2. Enjeksiyondan yaklaşık 5 dakika sonra, fareyi servikal çıkık veya IACUC onaylı protokole göre ötenazi.
    3. 10 numara neşter kullanarak, tümöre bitişik ve iğne enjeksiyonunun yönüne yaklaşık dik bir kesi yapın. Tümör dokusunu çevre dokudan resect etmek için tokmaklar ve cerrahi makas kullanın.
    4. Toplam tümör büyüklüğüne bağlı olarak tümörü iki ila dört 1 cm2 parçaya bölün.
    5. Bölüm 3.6'da yukarıda açıklandığı gibi gömme kalıplarını hazırlayın ve dokuyu gömün. İntratumoral dektran enjeksiyonundan kriyo gömmeye kadar hasat süresinin 7-8 dakikadan fazla olmadığından emin olun.
  5. Doku örneklerinin slaytlarının hazırlanması
    1. Bölüm 3.7'de açıklandığı gibi seri tümör bölümlerini toplayın.
  6. Doku slaytlarının sabitlenmesi
    1. Bölüm 3.8'de açıklandığı gibi dokuyu sabitle.
  7. Floresan mikroskopi ve görüntü alımı
    1. Bölüm 2.6'da açıklandığı gibi, ilgi çekici bölgeleri belirleyin ve görüntüler elde edin.
  8. Veri nicelemesi ve analizi
    1. Bölüm 2.7'de açıklandığı gibi hücreleri ölçün ve uygun istatistiksel analizleri uygulayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tüp bebek çalışması
NHF-ATP'nin hücre içi içselleştirilmesi, NHF-ATP'nin HMWFD veya LMWFD ile birlikte lokalizasyonu ile gösterilmiştir (Şekil 4). Bu prosedürün başarısı öncelikle uygun NHF-ATP ve dekstrans konsantrasyonlarının kullanılmasına ve uygun dekstrans tiplerinin (poli-lizin ve nötr) belirlenmesine dayanır. Örneğin, makropinositozu araştırmak için, HMWFD yalnızca makropinozomlar13 , 14 , 1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Sulandırılamaz ATP'nin hücresel içselleştirilmesinin mekansal, zamansal ve nicel analizi için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem, teknik talimat ve temsili veriler sağladığımız çeşitli tümörojenik modeller de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerde kullanım için yaygın olarak uygulanabilir. In vivo ATP içselleştirme çalışmaları sırasında yorumlanabilir veriler elde etmek için (protokolün bölüm 4), intratümoral dektran enjeksiyonundan kriyo gömmeye kadar geçen d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Kriyoteksiyon Ohio Üniversitesi Histopatoloji Çekirdeği'nde yerinde gerçekleştirildi. Bu çalışma kısmen C Nielsen'e başlangıç fonları (Ohio Üniversitesi Sanat ve Bilim Koleji) tarafından desteklendi; NIH, X Chen'e R15 CA242177-01 ve RSAC ödülü verir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
A549 cells, human lung epithelial, carcinomaNational Cancer Instituten/aLess expensive source
AcetoneFisher ScientificS25904
Aluminum foil, ReynoldsGrainger6CHG6
Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade ReagentThermoFisherP36930
ATP analogJena BiosciencesNK-101
Autoclave, sterilizerGrainger33ZZ40
Blades, cryostat, high profileC. L. Sturkey, Inc.DT554550
Calipers, vernierGrainger4KU77
Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-freeMillipore Sigma51651C-1000ML
Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotorEppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
Conical tube, 15 mLVWR21008-216
Conical tube, 50 mLVWR21008-242
Coverslips, glass, 12 mmCorning2975-245
Cryostat, Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
Delicate task wipe, Kim WipesKimberly-Clark34155
Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW)InvitrogenD1818MW = 70,000, Tetramethylrhodamine
Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW)InvitrogenD1819
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-freeFisher Scientific11885076
Dry iceLocal deliveryCustom order
Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition softwareNikonCustom order
EthanolFisher ScientificBP2818-4
Fetal bovine serum (FBS)ThermoFisher16000044
Forceps, Dumont #7, curvedFine Science Tools11274-20
Forceps, Dumont #5, straightFine Science Tools11254-20
Gloves (small, medium, large)MicroflexN191, N192, N193
Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice)Fisher Scientific19-046-563
HemocytometerDaiggerEF16034F EA
Incubator, cell cultureEppendorfGalaxy 170 S
Labelling tapeFisher Scientific159015R
Marking pen, Sharpie (ultra-fine)Staples642736
Mice, immunodeficient (Nu/J)Jackson Laboratory2019
Microcentrifuge, accuSpin Micro17Fisher Scientific13-100-675
Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL)AxygenMCT-150-C
Microscope slide boxFisher Scientific50-751-4983
Needle, 27 gaugeBecton-Dickinson752 0071
PaintbrushGrainger39AL12
Paper towelsStaples33550
ParaformaldehydeAcros Organics416785000
Penicillin/StreptomycinGibco15140122
Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm lengthRoboz Surgical Instrument Co.RS-6162
Phosphate buffered saline (PBS)Fisher ScientificBP3991
Pipet tips (10 μL)Fisher Scientific02-707-438
Pipet tips (200 μL)Fisher Scientific02-707-411
Pipet tips (1000 μL)Fisher Scientific02-707-403
Pipets, serological (10 mL)VWR89130-910
Pippetor, Gilson P2DaiggerEF9930A
Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL)DaiggerEF9931A
Platform shaker - orbital, benchtopCole-ParmerEW-51710-23
Positively-charged microscope slides, SuperfrostFisher Scientific12-550-15
Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc.Fisher Scientific22-079-707
Scissors, surgical - sharp, curvedFine Science Tools14005-12
Software for image analysis, Nikon ElementsNikonCustom order
Software for image analysis, ImageJ (FIJI)National Institutes of Healthn/aDownload online (free)
Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessoryLeica Biosystems14047740044
Staining tray, 245 mm BioAssay DishCorning431111
Syringe, 1 ccBecton-Dickinson309623
Tape, laboratory, 19 mm widthFisher Scientific15-901-5R
TimerFisher Scientific14-649-17
Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameterFisher Scientific08-757-100D
Tissue culture flask, 225 cm2ThermoFisher159933
Tissue culture plate, 24-wellBecton-Dickinson353226
Tissue embedding mold, stainless steelTissue Tek4161
Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT)Fisher Scientific4585
Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25%Gibco25200072
Water bath, Precision GP 2SThermoFisherTSGP2S

Referanslar

  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. 3, 25992008(2008).
  3. Falzoni, S., Donvito, G., Di Virgilio, F. Detecting adenosine triphosphate in the pericellular space. Interface Focus. 3 (3), 20120101(2013).
  4. Michaud, M., et al. Autophagy-dependent anticancer immune responses induced by chemotherapeutic agents in mice. Science. 334, 1573-1577 (2011).
  5. Wilhelm, K., et al. Graft-versus-host disease is enhanced by extracellular ATP activating P2X7R. Nature Medicine. 16, 1434-1438 (2010).
  6. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  7. Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. Regulation of cancer cell metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 85-95 (2011).
  8. Chen, X., Qian, Y., Wu, S. The Warburg effect: evolving interpretations of an established concept. Free Radical Biology & Medicine. 79, 253-263 (2015).
  9. Wang, X., et al. Extracellular ATP, as an energy and phosphorylating molecule, induces different types of drug resistances in cancer cells through ATP internalization and intracellular ATP level increase. Oncotarget. 8 (5), 87860-87877 (2017).
  10. Patel, A., et al. ATP as a biological hydrotrope. Science. 356, 753-756 (2017).
  11. Qian, Y., et al. Extracellular ATP is internalized by macropinocytosis and induces intracellular ATP increase and drug resistance in cancer cells. Cancer Letters. 351, 242-251 (2014).
  12. Qian, Y., Wang, X., Li, Y., Cao, Y., Chen, X. Extracellular ATP a new player in cancer metabolism: NSCLC cells internalize ATP in vitro and in vivo using multiple endocytic mechanisms. Molecular Cancer Research. 14, 1087-1096 (2016).
  13. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
  14. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
  15. Yanagawa, Y., Matsumoto, M., Togashi, H. Enhanced dendritic cell antigen uptake via alpha2 adrenoceptor-mediated PI3K activation following brief exposure to noradrenaline. Journal of Immunology. 185, 5762-5768 (2010).
  16. Hoppe, H. C., et al. Antimalarial quinolines and artemisinin inhibit endocytosis in Plasmodium falciparum. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 48, 2370-2378 (2004).
  17. Chaudry, I. H. Does ATP cross the cell plasma membrane. Yale Journal of Biology & Medicine. 55, 1-10 (1982).
  18. Pant, H. C., Terakawa, S., Yoshioka, T., Tasaki, I., Gainer, H. Evidence for the utilization of extracellular [gamma-32P]ATP for the phosphorylation of intracellular proteins in the squid giant axon. Biochimica et Biophysica Acta. 582, 107-114 (1979).
  19. Chaudry, I. H., Baue, A. E. Further evidence for ATP uptake by rat tissues. Biochimica et Biophysica Acta. 628, 336-342 (1980).
  20. Koppenol, W. H., Bounds, P. L., Dang, C. V. Otto Warburg's contributions to current concepts of cancer metabolism. Nature Reviews Cancer. 11, 325-337 (2011).
  21. Dang, C. V. Links between metabolism and cancer. Genes & Development. 26, 877-890 (2012).
  22. Israelsen, W. J., Vander Heiden, M. G. ATP consumption promotes cancer metabolism. Cell. 143, 669-671 (2010).
  23. Koster, J. C., Permutt, M. A., Nichols, C. G. Diabetes and insulin secretion: the ATP-sensitive K+ channel (K ATP) connection. Diabetes. 54, 3065-3072 (2005).
  24. Szendroedi, J., et al. Muscle mitochondrial ATP synthesis and glucose transport/phosphorylation in type 2 diabetes. PLoS Medicine. 4, 154(2007).
  25. Miyamoto, S., et al. Mass spectrometry imaging reveals elevated glomerular ATP/AMP in diabetes/obesity and identifies sphingomyelin as a possible mediator. EBioMedicine. 7, 121-134 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmasSay 172

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır