Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Özet

Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Hem genetik hem de genetik olmayan kalp hastalıkları kalpte ciddi yeniden şekillenme süreçlerine neden olabilir. Kollajen birikimi (fibrozis) ve hücresel yanlış hizalama gibi yapısal yeniden modelleme, elektriksel iletimi etkileyebilir, elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir ve sonunda aritmilere yol açabilir. Bu fonksiyonel değişikliklerin mevcut öngörücü modelleri, entegre olmayan ve düşük çözünürlüklü yapısal bilgilere dayanmaktadır. Bu çerçeveyi farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek, standart görüntüleme yöntemlerinin masif dokuda yüksek çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmedeki etkisizliği nedeniyle zordur. Bu çalışmada, tüm fare kalplerinin mikrometrik çözünürlükle görüntülenmesini sağlayan metodolojik bir çerçeve tanımladık. Bu hedefe ulaşmak, doku transformasyonu ve görüntüleme yöntemlerindeki gelişmelerin birleştirildiği teknolojik bir çaba gerektirmiştir. İlk olarak, sağlam bir kalbi yüksek şeffaflık ve derin lekelenmeye izin veren nanogözenekli, hidrojel hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürebilen optimize edilmiş bir CLARITY protokolünü açıklıyoruz. Daha sonra, mikron ölçeğinde çözünürlükte mezoskopik bir görüş alanının (mm ölçeğinde) görüntülerini hızlı bir şekilde elde edebilen bir floresan ışık tabakası mikroskobu açıklanmaktadır. MezoSPIM projesini takiben, tasarlanan mikroskop, tek bir tomografik taramada tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle yeniden yapılandırılmasına izin verir. Bu metodolojik çerçevenin, sitomimari kargaşanın elektriksel işlev bozukluklarına katılımının açıklığa kavuşturulmasına izin vereceğine ve hem işlevsel hem de yapısal verileri dikkate alan kapsamlı bir modelin önünü açacağına, böylece doku yeniden şekillenmesinden sonra elektriksel ve mekanik değişikliklere yol açan yapısal nedenlerin birleşik bir şekilde araştırılmasını sağlayacağına inanıyoruz.

Giriş

Kalp hastalıkları ile ilişkili yapısal yeniden yapılanma elektrik iletimini etkileyebilir ve organın elektromekanik işlev bozukluklarına neden olabilir ^1,2. Fonksiyonel değişiklikleri tahmin etmek için kullanılan güncel yaklaşımlar, fibroz birikiminin, vasküler ağacın ve kalbin lif dağılımının genel bir rekonstrüksiyonunu elde etmek için MRG ve DT-MRG'yi yaygın olarak kullanır ve organ boyunca tercihli eylem potansiyeli yayılım (APP) yollarını modellemek için kullanılır ^3,4. Bu stratejiler kalp organizasyonuna güzel bir genel bakış sağlayabilir. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlükleri, yapısal yeniden yapılanmanın hücresel düzeyde kardiyak fonksiyon üzerindeki etkisini araştırmak için yetersizdir.

Bu çerçeveyi, tek hücrelerin eylem potansiyeli yayılımı üzerinde bireysel roller oynayabileceği farklı bir büyüklük sırasına yerleştirmek zordur. Temel sınırlama, masif (santimetre boyutlu) dokularda yüksek çözünürlüklü görüntüleme (mikrometrik çözünürlük) gerçekleştirmek için standart görüntüleme yöntemlerinin verimsizliğidir. Aslında, biyolojik dokuları 3D olarak yüksek çözünürlükte görüntülemek, doku opaklığı nedeniyle çok karmaşıktır. Tüm organlarda 3D rekonstrüksiyonları gerçekleştirmek için en yaygın yaklaşım, ince kesitler hazırlamaktır. Bununla birlikte, hassas kesitleme, montaj ve görüntüleme önemli çaba ve zaman gerektirir. Numunenin kesilmesini gerektirmeyen alternatif bir yaklaşım, şeffaf bir doku oluşturmaktır. Son yıllarda, dokuları berraklaştırmak için çeşitli metodolojiler önerilmiştir ^5,6,7,8. Masif, şeffaf ve floresan olarak etiketlenmiş dokular üretme zorluğu, son zamanlarda gerçek doku dönüşüm yaklaşımları geliştirilerek elde edilmiştir (CLARITY⁹, SHIELD¹⁰). Özellikle, CLARITY yöntemi, bozulmamış bir dokunun, membran lipit çift katmanlarının seçici olarak çıkarılmasıyla yüksek şeffaflık kazandırmayı sağlayan nanogözenekli, hidrojel-hibridize, lipit içermeyen bir forma dönüştürülmesine dayanır. Özellikle, bu yöntem kardiyak preparatta da başarılı bulunmuştur^11,12,13,14. Bununla birlikte, kalp aktif bir temizlik için uygun olamayacak kadar kırılgan olduğundan, tam şeffaflık sağlamak için uzun zaman gerektiren pasif yaklaşım kullanılarak temizlenmelidir.

Işık tabakası mikroskobu gibi gelişmiş görüntüleme teknikleriyle birlikte, CLARITY 3D masif kalp dokularını mikrometrik çözünürlükte görüntüleme potansiyeline sahiptir. Işık tabakası mikroskobunda, numunenin aydınlatılması, algılama hedefinin odak düzleminde sınırlı ince bir ışık tabakası ile gerçekleştirilir. Floresan emisyonu, aydınlatma düzlemi^15'e dik bir eksen boyunca toplanır. Algılama mimarisi geniş alan mikroskobuna benzer ve bu da edinimi lazer tarama mikroskoplarından çok daha hızlı hale getirir. Numunenin ışık tabakası boyunca hareket ettirilmesi, santimetre büyüklüğündeki numunelere kadar büyük örneklerin tam bir tomografisinin elde edilmesini sağlar. Bununla birlikte, Gauss ışınının içsel özellikleri nedeniyle, yalnızca sınırlı bir uzamsal uzantı için çok ince (birkaç mikron mertebesinde) bir ışık tabakası elde etmek mümkündür, böylece görüş alanını (FoV) büyük ölçüde sınırlar. Son zamanlarda, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için yeni bir uyarma şeması tanıtıldı ve beyin görüntüleme için uygulandı ve izotropik çözünürlük¹⁶ ile 3d rekonstrüksiyonlara izin verdi.

Bu yazıda, CLARITY protokolünün ihtiyaç duyduğu takas zamanlamasının önemli ölçüde azaltılmasını sağlayan pasif bir takas yaklaşımı sunulmuştur. Burada açıklanan metodolojik çerçeve, tüm fare kalbinin mikrometrik çözünürlükle tek bir tomografik taramada dakika sırasına göre bir edinme süresiyle yeniden yapılandırılmasına izin verir.

Protokol

Tüm hayvan elleçleme ve prosedürleri, bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa Parlamentosu'nun 2010/63/EU sayılı Direktifindeki kılavuzlara uygun olarak ve İtalya Sağlık Bakanlığı'nın ilke ve yönetmeliklerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel protokol İtalya Sağlık Bakanlığı tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 647/2015-PR). Tüm hayvanlar ENVIGO, İtalya tarafından sağlandı. Bu deneyler için 6 aylık 5 erkek C57BL/6J fare kullanıldı.

1. Çözelti hazırlama

1. Kimyasal bir başlıkta Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS) (pH 7.6) içinde% 4 Paraformaldehit (PFA) hazırlayın. % 4 PFA alikotlarını birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.
2. Hidrojel çözeltisi hazırlayın:% 4 Akrilamid,% 0.05 Bis-akrilamid,% 0.25 Initiatior AV-044'ü kimyasal bir başlıkta 0.01 M PBS'de karıştırın. Tüm hazırlık boyunca reaktifleri ve çözeltiyi buz üzerinde tutun. Hidrojel alikotları birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklayın.
3. Temizleme çözeltisi hazırlayın: Deiyonize suda 200 mM Borik asit,% 4 Sodyum Dodesil-Sülfat (SDS) karıştırın; kimyasal bir başlıkta pH 8.6. SDS yağışını önlemek için çözeltiyi 21-37 °C arasında saklayın.
4. Deney gününde taze Tyrode çözeltisi hazırlayın: 10 mM Glikoz, 10 mM HEPES, 113 mM NaCl, 1.2 mM MgCl₂ ve 4.7 mM KCl ekleyin; 1 M NaOH kullanarak pH 7.4'e titre edin.

2. Kalp izolasyonu

1. Kalp izolasyon prosedüründen 30 dakika önce deri altından 0.1 mL 500 I.U. Heparin enjekte edin.
2. 30 mL'lik bir şırınga ve üç adet 6 cm'lik Petri kabını taze Tyrode çözeltisi ile doldurun. Petri çanaklarından birinin sınırında küçük bir yarık (3-4 mm derinlikte) yapın ve stereoskopik bir mikroskop altına yerleştirin.
3. Şırıngaya 1 mm çapında bir kanül sabitleyin ve Petri kabının yarığına yerleştirin. Şırıngada hava kabarcığı olmadığından emin olun.
4. 20 mL'lik bir şırıngayı% 4 PFA ile doldurun ve kimyasal davlumbazda tutun. Kaputun altına boş bir Petri kabı hazırlayın.
5. Fareyi %3 İzofluran / oksijen ile 1.0 L / dak akış hızında uyuşturun ve yürürlükteki hayvan refahı kurallarına göre servikal çıkık ile feda edin.
6. Kurbandan sonra, kürkü göğsün üzerinden çıkarın ve kalbe tam erişime sahip olmak için göğsü açın.
7. Kalbi izole edin, daha önce 50 mL Tirode Çözeltisi ile doldurulmuş Petri kabına batırın. Kalbin açığa çıkması için aort kemerinin hemen yakınında aortu kesmek için cerrahi makas kullanın.
8. Kalbi stereoskopik bir mikroskop altında aktarın ve kanülasyonu dikkatlice gerçekleştirin. Doku hasarını önlemek için kanülü aortun çok derinlerine (en fazla 2 mm) sokmayın.
9. Kalbi kanüle sabitlemek için küçük bir kelepçe ve bir dikiş (boyut 5/0) kullanın.
10. Damarlardan kanı çıkarmak için kalbi 30 mL Tirode çözeltisi ile 10 mL / dak sabit bir basınçla perfüze edin.
11. Kanülü şırıngadan ayırın ve kalbi Tyrode çözeltisi ile doldurulmuş Petri kabına yerleştirin. Kanülde hava kabarcıkları olmamasına dikkat edin; aksi takdirde, hava kabarcıklarını düzgün bir şekilde çıkarın.
12. Soğuk %4 PFA ile doldurulmuş 20 mL şırıngayı kanüle takın ve kalbi aynı sabit basınçta perfüze edin.
13. Kalbi gece boyunca 4 °C'de (O / N) 10 mL% 4 PFA'da inkübe edin. Doku bozulmasını önlemek için, 2.6-2.13 adımlarını mümkün olan en kısa sürede uygulayın.

3. Kalp temizleme

1. Ertesi gün, kalbi 15 dakika boyunca 4 ° C'de 3 kez 0.01 M PBS'de yıkayın.
   NOT: Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca 4 ° C'de PBS +% 0.01 sodyum azid (NaN3) içinde saklanabilir.
2. Kalbi 3 gün boyunca 4 ° C'de sallamada (15 rpm) 30 mL Hidrojel çözeltisinde inkübe edin.
3. Bir kurutucu, bir vakum pompası ve kurutucuyu hem pompaya hem de azot boru hattına bağlayan bir tüp sistemi kullanarak numuneyi oda sıcaklığında gazdan arındırın.
   1. Numuneyi kurutucuya yerleştirin ve kapağı üzerinde tutarak şişeyi açın.
   2. Kurutucuyu kapatın ve azot boru hattını açarak oksijeni tüpten çıkarın.
   3. Oksijeni kurutucudan 10 dakika boyunca çıkarmak için vakum pompasını açın.
   4. Pompayı kapatın ve azot boru hattını açmak için kurutucunun düğmesini kullanın. Basınç atmosferik basınca eşit olduğunda, kurutucuyu dikkatlice açın ve şişeyi hızla kapatın.
4. Kalbi gazdan arındırılmış Hidrojel çözeltisinde 37 °C'de 3 saat dinlendirin.
5. Hidrojel düzgün bir şekilde polimerize edildiğinde ve tamamen jelatinimsi göründüğünde, kalbi dikkatlice çıkarın ve numune tutucuya yerleştirin.
6. Numune tutucuyu kalple birlikte temizleme odalarından birine yerleştirin ve temizleme çözeltisinin sızmasını önlemek için düzgün bir şekilde kapatın.
7. Temizleme çözeltisinin devridaimini başlatmak için temizleme çözeltisi kabının yerleştirildiği su banyosunu ve peristaltik pompayı açın.
8. Arıtma prosedürünü hızlandırmak için kaptaki temizleme solüsyonunu haftada bir kez değiştirin.

4. Hücresel membran boyama

1. Kalp tamamen berraklaştıktan sonra, numune tutucudan çıkarın ve 24 saat boyunca 50 mL ısıtılmış PBS'de yıkayın. 24 saat boyunca 50 mL PBS + Triton-X'in% 1'inde (PBS-T 1x) tekrar yıkayın.
2. Numuneyi 0.01 mg / mL Buğday Gergini Agglutinin (WGA) - Alexa Fluor 633'ü 3 mL PBS-T 1x'te 7 gün boyunca oda sıcaklığında sallayarak (50 rpm) inkübe edin.
3. 7 günlük inkübasyondan sonra, numuneyi oda sıcaklığında 50 mL PBS-T 1x'te 24 saat çalkalayarak yıkayın.
4. Numuneyi 15 dakika boyunca% 4 PFA'da inkübe edin ve ardından PBS'de her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
   NOT: Bu adımdan sonra, kalp birkaç ay boyunca 4 ° C'de PBS +% 0.01 NaN3'te saklanabilir.
5. Kalbi, her biri 8 saat boyunca 0.01 M PBS'de (% 20 ve% 47 TDE / PBS) artan konsantrasyonlarda 2,2′-Tiyodiethanol (TDE), gerekli kırılma indisini sağlamak için 0.01 M PBS'de% 68 TDE'nin son konsantrasyonuna kadar inkübe edin (RI = 1.46). Bu, görüntüleri elde etmek için kullanılan RI eşleştirme ortamıdır (RI-medium^{) 16}.

5. Kalbe montaj ve satın alma

NOT: Optik sistemin tüm bileşenleri Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak listelenmiştir.

1. Dış küvetin yaklaşık% 80'ini (kuvars, 45 mm × 45 mm × 42,5 mm) RI-medium ile yavaşça doldurun.
   NOT: Burada, 1,46 RI'yı garanti eden farklı uçucu olmayan çözümler kullanmak mümkündür.
2. İç küveti (kuvars, 45 mm × 12,5 mm × 12,5 mm) aynı RI-medium ile yavaşça doldurun.
3. Numuneyi iç küvetin içine batırın. Yukarıda açıklanan numune inkübasyonları, numunenin tutulmadan RI-ortamı içinde sabit kalmasını sağlar.
4. İnce cımbız kullanarak numuneyi yavaşça küvetin dibine doğru hareket ettirin ve tarama sırasında doku boyunca uyarma ışığı yolunu en aza indirmek için kalbi uzunlamasına ekseni küvetin ana eksenine paralel olarak düzenleyin.
5. Özel fişi iç küvetin üzerine iki vidayla yavaşça sabitleyin.
6. Mıknatısları kullanarak numuneyi mikroskop aşamasına monte edin.
7. İç küvetin dış küvete batırılması için dikey numune aşamasını manuel olarak çevirin.
8. Uyarma ışık kaynağını (638 nm dalga boyu) açın ve düşük bir güç (3 mW sırasına göre) ayarlayın.
9. Dokunun iç düzlemini aydınlatmak için motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi hareket ettirin.
10. Görüntüleme yazılımını (HCImageLive) açın ve tüm kurulumu kontrol eden özel yazılım tarafından kameranın alma tetikleyicisini çalıştırmak için fotoğraf makinesinin Harici (ışık tabakası) modunda Tetikleyicisini ayarlayın.
11. Tarama Ayarları panelinde Otomatik Kaydet'i etkinleştirin ve görüntülerin kaydedilmesi gereken çıktı klasörünü ayarlayın.
12. Numuneyi kamera sensörünün FoV'sinin merkezine taşımak için doğrusal çevirmenlerle XY düzlemindeki numune konumunu manuel olarak ayarlayın.
13. Tomografik rekonstrüksiyon için kalp sınırlarını tanımlamak üzere doğrusal motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca hareket ettirin.
14. Lazer gücünü, görüntüleme oturumu için hazır olacak şekilde ~20 mW'a yükseltin.
15. Tomografik alımı başlatın, görüntüleme yazılımının Sıra Panelindeki Başlat düğmesine tıklayın ve aynı zamanda motorlu çeviriciyi kullanarak numuneyi Z ekseni boyunca 6 μm/s sabit hızda hareket ettirin.

Sonuçlar

Geliştirilen pasif temizleme kurulumu, yaklaşık 3 ay içinde temizlenmiş bir yetişkin fare kalbi (10 mm x 6 mm x 6 mm mertebesinde bir boyutta) elde etmeyi sağlar. Kurulumun tüm bileşenleri Şekil 1'de gösterildiği gibi monte edilmiştir. Her bir temizleme odası arasındaki ihmal edilebilir sıcaklık gradyanı (3 ° C mertebesinde), sıcaklığın tüm odalarda uygun bir aralıkta tutulmasını sağlar.

Tartışmalar

Bu çalışmada, bütün bir fare kalbini yüksek çözünürlükte temizlemek, lekelemek ve görüntülemek için başarılı bir yaklaşım tanıtıldı. İlk olarak, bir doku dönüşüm protokolü (CLARITY) optimize edildi ve uygulandı, kalp dokusuna uygulanması için biraz modifiye edildi. Gerçekten de, bütün bir kalbin 3B'sinde etkili bir rekonstrüksiyon elde etmek için, ışık saçılması fenomenini önlemek esastır. CLARITY metodolojisi, oldukça şeffaf ve sağlam bir kalp elde etmemizi sağlar, ancak ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-2’ Thiodiethanol	Sigma-Aldrich	166782
Acrylamide	Bio-Rad	61-0140
AV-044 Initiator	Wako Chemicals	AVP5874
Bis-Acrylamide	Bio-Rad	161-042
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B7901
Camera	Hamamatsu	Orca flash 4.0 v3
Camera software	Hamamatsu	HC Image
Collimating lens	Thorlabs	AC254-050-A-ML
Detection arm	Integrated optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Excitation lens	Nikon	91863
Exteraìnal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-753
Fold mirrors	Thorlabs	BBE1-E02
Galvanometric mirror	Thorlabs	GVS211/M
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
HCImage Live	Hamamatsu	4.6.1.19
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Internal quartz cuvette	Portmann Instruments	UQ-204
KCl	Sigma-Aldrich	P4504
Laser source	Integrated Optics	0638L-15A-NI-PT-NF
Long-pass filter	Thorlabs	FELH0650
Magnetic base	Thorlabs	KB25/M
MgCl2	Chem-Lab	CI-1316-0250
Motorized traslator	Physisk Instrument	M-122.2DD
NaCl	Sigma-Aldrich	59888
Objective	Thorlabs	TL2X-SAP
Paraformaldehyde	Agar Scientific	R1018
Phosphate Buffer Solution	Sigma-Aldrich	P4417
Polycap AS	Whatman	2606T
Relay lens	Qioptiq	G063200000
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Tube lens	Thorlabs	ACT508-200-A-ML
Tunable lens	Optotune	EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C
Vacuum pump	KNF Neuberger Inc	N86KT.18
Water bath	Memmert	WTB