JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim yürütmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını açıklamaktadır. MMC, mikroorganizmaları otomatik ve sürekli olarak yetiştirebilir ve alt yetiştirebilir ve nispeten yüksek verim ve iyi paralelleştirme ile büyümelerini çevrimiçi olarak izleyebilir, işçiliği ve reaktif tüketimini azaltabilir.

Özet

Geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleri genellikle hantal operasyonlara, düşük verime, düşük verimliliğe ve büyük miktarda işgücü ve reaktif tüketimine sahiptir. Ayrıca, son yıllarda geliştirilen mikroplaka bazlı yüksek verimli yetiştirme yöntemleri, düşük çözünmüş oksijen, zayıf karışım ve şiddetli buharlaşma ve termal etkileri nedeniyle zayıf mikrobiyal büyüme durumuna ve deney paralelliğine sahiptir. Mikro damlacıkların küçük hacim, yüksek verim ve güçlü kontrol edilebilirlik gibi birçok avantajı nedeniyle, damlacık bazlı mikroakışkan teknolojisi, yüksek verimli mikrobiyal ekim, tarama ve evrim araştırmalarında kullanılan bu sorunların üstesinden gelebilir. Bununla birlikte, önceki çalışmaların çoğu laboratuvar yapımı ve uygulaması aşamasında kalmaktadır. Yüksek operasyonel gereksinimler, yüksek inşaat zorluğu ve otomatik entegrasyon teknolojisinin eksikliği gibi bazı önemli konular, mikrobiyal araştırmalarda damlacık mikroakışkan teknolojisinin geniş çapta uygulanmasını kısıtlamaktadır. Burada, damlacık mikroakışkan teknolojisine dayanan otomatik bir Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür sistemi (MMC) başarıyla geliştirildi ve mikrobiyal damlacık yetiştiriciliği sürecinin gerektirdiği aşılama, ekim, çevrimiçi izleme, alt ekim, sıralama ve örnekleme gibi fonksiyonların entegrasyonu sağlandı. Bu protokolde, vahşi tip Escherichia coli (E. coli) MG1655 ve metanol esansiyel bir E. coli suşu (MeSV2.2), MMC'nin otomatik ve nispeten yüksek verimli mikrobiyal ekim ve uyarlanabilir evrimi ayrıntılı olarak yürütmek için nasıl kullanılacağını tanıtmak için örnek olarak alınmıştır. Bu yöntemin kullanımı kolaydır, daha az emek ve reaktif tüketir ve geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla büyük avantajlara sahip olan yüksek deneysel verime ve iyi veri paralelliğine sahiptir. Bilimsel araştırmacıların ilgili mikrobiyal araştırmaları yürütmeleri için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sonuç açısından güvenilir bir deneysel platform sağlar.

Giriş

Mikrobiyal tarım, mikroorganizmaların izolasyonu, tanımlanması, yeniden yapılandırılması, taranması ve evriminde yaygın olarak kullanılan mikrobiyolojik bilimsel araştırmalar ve endüstriyel uygulamalar için önemli bir temeldir 1,2,3. Geleneksel mikrobiyal yetiştirme yöntemleri esas olarak test tüplerini, sallama şişelerini ve katı plakaları yetiştirme kapları olarak kullanır, ayrıca sallama inkübatörleri, spektrofotometreler, mikro plaka okuyucuları ve mikrobiyal yetiştirme, tespit ve tarama için diğer ekipmanlarla birleştirilir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin hantal işlemler, düşük verim, düşük verimlilik ve büyük işgücü ve reaktif tüketimi gibi birçok sorunu vardır. Son yıllarda geliştirilen yüksek verimli yetiştirme yöntemleri esas olarak mikroplakaya dayanmaktadır. Ancak mikroplaka düşük çözünmüş oksijen seviyesine, zayıf karıştırma özelliğine ve şiddetli buharlaşma ve termal etkiye sahiptir, bu da genellikle zayıf büyüme durumuna ve mikroorganizmaların deney paralelliğine yol açar 4,5,6,7; Öte yandan, otomatik yetiştirme ve proses tespiti elde etmek için sıvı taşıma iş istasyonları ve mikro plaka okuyucular gibi pahalı ekipmanlarla donatılması gerekir 8,9.

Mikroakışkan teknolojisinin önemli bir dalı olan damlacık mikroakışkanları, son yıllarda geleneksel sürekli akışlı mikroakışkan sistemlere dayanarak geliştirilmiştir. Dağınık mikro damlacıklar üretmek ve bunlar üzerinde çalışmak için iki karışmaz sıvı fazı (genellikle yağ-su) kullanan ayrık akışlı bir mikroakışkan teknolojisidir10. Mikro damlacıklar küçük hacimli, geniş spesifik yüzey alanı, yüksek iç kütle transfer hızı özelliklerine sahip olduğundan ve bölümlere ayırmanın neden olduğu çapraz kontaminasyon olmadığından ve damlacıkların güçlü kontrol edilebilirliği ve yüksek veriminin avantajlarına sahip olduğundan, yüksek verimli ekim, eleme ve mikroorganizmaların evriminde damlacık mikroakışkan teknolojisini uygulayan birçok araştırma türü olmuştur11 . Bununla birlikte, damlacık mikroakışkan teknolojisinin popülerleşmesini ve yaygın olarak uygulanmasını sağlamak için hala bir dizi önemli konu vardır. İlk olarak, damlacık mikroakışkanlarının çalışması hantal ve karmaşıktır, bu da operatörler için yüksek teknik gereksinimlere neden olur. İkincisi, damlacık mikroakışkan teknolojisi optik, mekanik ve elektrikli bileşenleri birleştirir ve biyoteknoloji uygulama senaryolarıyla ilişkilendirilmesi gerekir. Çok disiplinli bir işbirliği yoksa, tek bir laboratuvar veya ekibin verimli damlacık mikroakışkan kontrol sistemleri kurması zordur. Üçüncüsü, küçük hacimli mikro damlacık nedeniyle (pikoliter (pL) mikrolitreye (μL)), alt ekim, sıralama ve örnekleme gibi bazı temel mikrobiyal işlemler için damlacıkların hassas otomatik kontrolünü ve gerçek zamanlı çevrimiçi tespitini gerçekleştirmek çok zordur ve entegre bir ekipman sistemi oluşturmak da zordur12.

Yukarıdaki sorunları çözmek için, damlacık mikroakışkan teknolojisine dayanan otomatik bir Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür sistemi (MMC) başarıyla geliştirilmiştir13. MMC dört işlevsel modülden oluşur: damlacık tanıma modülü, damlacık spektrumu algılama modülü, mikroakışkan çip modülü ve örnekleme modülü. Tüm modüllerin sistem entegrasyonu ve kontrolü sayesinde, damlacıkların üretimi, yetiştirilmesi, ölçülmesi (optik yoğunluk (OD) ve floresan), bölünmesi, füzyonu, ayrıştırılması dahil olmak üzere otomatik işletim sistemi doğru bir şekilde kurulmakta, mikrobiyal damlacık yetiştiriciliği işleminin gerektirdiği aşılama, ekim, izleme, alt ekim, ayıklama ve numune alma gibi fonksiyonların entegrasyonu sağlanmaktadır. MMC, 200 sallama şişesi yetiştirme ünitesine eşdeğer olan 2-3 μL hacimli 200 kopya damlacık yetiştirme ünitesini tutabilir. Mikro-damlacık yetiştirme sistemi, mikroorganizmaların büyümesi sırasında kontaminasyonsuz, çözünmüş oksijen, karıştırma ve kütle-enerji değişimi gereksinimlerini karşılayabilir ve örneğin büyüme eğrisi ölçümü, uyarlanabilir evrim, tek faktörlü çok seviyeli analiz ve metabolit araştırması ve analizi (floresan tespitine dayalı) gibi çoklu entegre fonksiyonlar aracılığıyla mikrobiyal araştırmanın çeşitli ihtiyaçlarını karşılayabilir13,14.

Burada protokol, MMC'nin otomatik ve mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrimi ayrıntılı olarak yürütmek için nasıl kullanılacağını tanıtmaktadır (Şekil 1). Büyüme eğrisi ölçümünü göstermek için vahşi tip Escherichia coli (E. coli) MG1655'i ve MMC'deki adaptif evrimi göstermek için metanol esansiyel E. coli suşu MeSV2.215'i örnek olarak aldık. MMC için bir operasyon yazılımı geliştirildi, bu da işlemi çok basit ve net hale getiriyor. Tüm süreçte, kullanıcının ilk bakteri çözeltisini hazırlaması, MMC'nin koşullarını ayarlaması ve ardından bakteri çözeltisini ve ilgili reaktifleri MMC'ye enjekte etmesi gerekir. Daha sonra, MMC damlacık oluşturma, tanıma ve numaralandırma, yetiştirme ve uyarlanabilir evrim gibi işlemleri otomatik olarak gerçekleştirecektir. Ayrıca, damlacıkların yüksek zaman çözünürlüğüne sahip çevrimiçi tespitini (OD ve floresan) gerçekleştirecek ve ilgili verileri (dışa aktarılabilen) yazılımda görüntüleyecektir. Operatör, sonuçlara göre yetiştirme işlemini istediği zaman durdurabilir ve sonraki deneyler için hedef damlacıkları çıkarabilir. MMC'nin kullanımı kolaydır, daha az emek ve reaktif tüketir ve nispeten yüksek deneysel verime ve geleneksel yetiştirme yöntemlerine kıyasla önemli avantajlara sahip olan iyi veri paralelliğine sahiptir. Araştırmacıların ilgili mikrobiyal araştırmaları yürütmeleri için düşük maliyetli, operasyon dostu ve sağlam bir deneysel platform sağlar.

Protokol

1. Cihaz ve yazılım kurulumu

  1. MMC için ayrılmış kalıcı alan olarak temiz ve steril bir ortam (temiz bir tezgah gibi) seçin. MMC'yi alana sabit bir şekilde yükleyin.
    NOT: MMC'yi güçlü elektrik alanlarının, manyetik alanların ve güçlü ısı radyasyon kaynaklarının parazitinden uzak tutun. Optik algılama bileşenlerini etkilemekten kaynaklanan şiddetli titreşimlerden kaçının. MMC'ye AC220 V, 50 HZ güç kaynağı sağlayın. MMC hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na ve MMC16 web sitesine bakın.
  2. MMC.zip dosyasından işlem yazılımını yükleyin
    Not: MMC.zip dosyası için yazarlara başvurun.
    1. Özel bir klasör oluşturun ve zip dosyasını içine kaydedin.
    2. "Kurulum Dizini" olarak başka bir özel klasör oluşturun. MMC.zip sıkıştırmasını açın ve dosyaları yeni klasöre kaydedin.
      NOT: Bilgisayar yapılandırması karşılamak için en iyisidir: (1) Windows 7 64 bit işletim sistemi veya üstü; (2) CPU: i5 veya üstü; (3) bellek: 4 GB veya üstü; (4) sabit disk: 300 GB veya üstü (7200 rpm'den veya katı hal diskinden daha büyük dönme hızı).

2. Hazırlıklar

  1. Şırınga iğnesini (iç çap 0,41 mm ve dış çap 0,71 mm), hızlı konektör A'yı ve reaktif şişesini (Şekil 2C) bağlayın ve 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav yapın.
    NOT: Sterilizasyon sırasında reaktif şişesinin kapağını hafifçe sökün. Kullanım için her seferinde birkaç reaktif şişesi daha hazırlanabilir.
  2. MMC yağını filtrelemek için 0,22 μm poliviniliden florür (PVDF) filtresi kullanın. Mikroakışkan çipi (Şekil 2B) ve MMC yağını önceden temiz tezgaha koyun ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca ultraviyole ışınlama ile sterilize edin.
    NOT: Hızlı konektör A, reaktif şişesi, MMC yağı ve mikroakışkan çipin ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın.
  3. Mikroakışkan çipi takın
    1. Operasyon odasının kapısını açın (Şekil 2A) ve optik fiber probu kaldırın.
    2. Elektrik alan deliklerini elektrik alan iğneleriyle hizalayın ve çipi yavaşça talaş kaidesine yerleştirin. Ardından iki konumlandırma sütununu konumlandırma deliklerine yerleştirin ve optik fiber probu yerleştirin (Şekil 2D).
    3. Çip üzerindeki hızlı konektör A'yı, konum numarasına göre MMC'nin ilgili bağlantı noktasına bağlayın (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.
  4. MMC yağını (yaklaşık 80 mL'ye kadar) yağ şişesinde doldurun ve kullanmadan önce atık sıvıyı atık şişesinde boşaltın.
    NOT: Atık sıvı genellikle organik atıktır. Lütfen deneysel düzeneğe bağlı olarak değişikliğe tabi olan bertaraf üzerine bölgesel yasa ve yönetmeliklere bakın.

3. MMC'de büyüme eğrisi ölçümü

  1. İlk bakteriyel çözelti için hazırlık
    1. Luria-Bertani (LB) ortamını ve otoklavı 121°C'de 15 dakika boyunca hazırlamak için ilgili standart yönetmeliklere uyun.
      NOT: LB ortamının bileşenleri: NaCl (10 g / L), maya ekstraktı (5 g / L) ve tripton (10 g / L).
    2. E. coli MG1655 suşunu gliserol stoğundan çıkarın ve 5-8 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL LB ortamı ile 50 mL'lik bir sallama şişesinde yetiştirin.
      NOT: Yetiştirme süresi belirli suşlara bağlıdır. Suşu logaritmik döneme/faza yetiştirmek en uygunudur.
    3. İlk bakteri çözeltisini elde etmek için kültürlenmiş E. coli MG1655 çözeltisini taze ortamla0.05-0.1'lik bir OD 600'e seyreltin (yaklaşık 10 mL hazırlayın).
  2. MMC'yi başlatmak için Başlatma'ya tıklayın. Başlatma arayüzü göründükten sonra, yetiştirme sıcaklığını 37 °C ve fotoelektrik sinyal değerini 0,6 olarak ayarlayın (Şekil 3A). Başlatma yaklaşık 20 dakika sürecektir.
  3. Başlatma sırasında UV lambasını (dalga boyu 254 nm) açın.
  4. İlk bakteri çözeltisini ve MMC yağını reaktif şişesine enjekte edin.
    1. Temiz tezgahta sterilize edilmiş bir reaktif şişesi çıkarın ve kapağı sıkın.
    2. Yan tüpün şırınga iğnesinden 3-5 mL MMC yağı enjekte etmek için 10 mL steril bir şırınga kullanın. Yağın iç duvara tamamen sızmasını sağlamak için reaktif şişesini yavaşça eğin ve döndürün.
    3. Yaklaşık 5 mL başlangıç bakteri çözeltisi enjekte edin ve daha sonra 5-7 mL yağı tekrar enjekte ederek reaktif şişesini doldurun.
    4. Numune enjeksiyon işlemini tamamlamak için bağımsız hızlı konektör A'yı dışarı çekin ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü hızlı B konektörüne takın (Şekil 4A).
  5. Başlatmanın bitmesini bekleyin ve ardından UV lambasını kapatın (dalga boyu 254 nm).
  6. Operasyon odasının kapısını açın ve reaktif şişesini metal banyoya koyun.
  7. Çipin C2 konektörünü ve reaktif şişesinin hızlı A konektörünü dışarı çekin. Reaktif şişesinin yan boru konektörünü C2 konektörüne ve üst boru konektörünü O2 konektörüne bağlayın. Ardından operasyon odasının kapısını kapatın.
  8. Büyüme eğrisi ölçümünün işlevini seçmek için Büyüme Eğrisi'ne tıklayın (Şekil 3A). Parametre ayarı arayüzünde, Sayıyı 15 olarak girin, OD algılama anahtarını açın ve Dalga Boyunu 600 nm olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 10 dakika sürecek.
    NOT: Burada, Sayı , oluşturulacak damlacıkların sayısını ifade eder. Dalga boyu , tespit edilecek OD'nin dalga boyunu ifade eder. Deney gereksinimlerine göre Sayı (maksimum 200) ve Dalga Boyu'nu (350-800 nm) ayarlayın.
  9. Ana arayüzde "C2 ve O2 arasındaki reaktif şişesini çıkarın, ardından lütfen tamamlandıktan sonra Tamam düğmesine tıklayın" diyen bir açılır pencere göründüğünde, reaktif şişesini çıkarmak ve C2 ve O2 konektörlerini bağlamak için işlem odasının kapısını açın.
  10. Kapıyı kapatın ve damlacıkları otomatik olarak yetiştirmek ve OD değerlerini algılamak için açılır penceredeki Tamam düğmesine tıklayın.
    NOT: MMC, damlacık optik fiber probu geçtiğinde OD değerini algılar. Bu nedenle, algılama süresi üretilen damlacıkların sayısına bağlıdır.
  11. Büyüme eğrisi durağan aşamaya ulaştığında, OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesini tıklatın. Veri kaydetme yolunu seçin ve yetiştirme döneminde kaydedilen OD değerini, uygun yazılım (örneğin, Microsoft Excel) tarafından açılabilen .csv biçiminde dışa aktarın. Ardından, büyüme eğrisini çizmek için bir haritalama yazılımı (örneğin, EXCEL ve Origin 9.0) kullanın.
    NOT: Yetiştirme işlemi sırasında, mevcut tüm damlacıkların OD verilerini dışa aktarmak için herhangi bir zamanda Veri Dışa Aktarma'ya tıklamak mümkündür.

4. MMC'de uyarlanabilir evrim

  1. İlk bakteriyel çözelti için hazırlık
    1. MeSV2.2 için özel sıvı ortam ve katı plakaları ve 121 °C'de otoklav için 15 dakika boyunca hazırlamak üzere ilgili standart yönetmeliklere uyun.
      NOT: Özel ortamın bileşenleri için Tablo 1 ve Malzeme Tablosuna bakınız.
    2. MeSV2.2'yi katı plakayı (çap = 90 mm) kullanarak 37 °C sabit sıcaklık inkübatöründe 72 saat boyunca yetiştirin. Daha sonra bağımsız bir koloni seçin ve 72 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL özel sıvı ortam ile 50 mL'lik bir sallama şişesinde yetiştirin.
    3. Kültürlenmiş MeSV2.2 çözeltisini ortamla0.1-0.2'lik bir OD 600'e kadar seyreltin (toplam hacmin 10 mL'den az olmadığından emin olun) ve ilk bakteri çözeltisini elde etmek için sallama şişesinde 5 saat boyunca yetiştirmeye devam edin.
      NOT: MeSV2.2, metanol esansiyel bir E. coli suşudur. Özel sıvı ortam, MeSV2.2 için güçlü bir stres olan ve çok yavaş büyümeye neden olan 500 mmol / L metanol içerir. İlk bakteri çözeltisinin burada elde edilmesinin, adım 3.1'de açıklanandan farklı olduğunu unutmayın.
  2. MMC'yi adım 3.2, 3.3 ve 3.5'te açıklandığı gibi başlatın.
  3. Biri ilk bakteri çözeltisi ve diğeri taze ortam için olmak üzere iki sterilize reaktif şişesi çıkarın. İlk bakteri çözeltisini (5 mL), taze ortamı (12-15 mL) ve MMC yağını adım 3.4'te açıklandığı gibi reaktif şişelerine enjekte edin.
    NOT: Uyarlanabilir evrim, birden fazla alt yetiştirmeyi içeren uzun vadeli bir süreç olduğundan, MMC'de mümkün olduğunca fazla taze ortam depolayın. Ortam, deneme çalışırken yenilenemez.
  4. İki reaktif şişesini adım 3.6'da açıklandığı gibi MMC'ye takın. Birini C2 ve O2 konektörü arasındaki ilk bakteri çözeltisi için, diğerini ise C4 ve O4 konektörü arasındaki taze ortam için takın.
  5. Uyarlanabilir evrimin işlevini seçmek için ALES'e tıklayın (Şekil 3B). Parametre ayarı arabiriminde, OD Algılama anahtarını açın.
  6. Sayıyı 50, Dalga Boyunu 600 nm, Konsantrasyonu %0, Zaman Türü, Parametreyi 30 saat ve Tekrarları 99 olarak ayarlayın. Damlacık oluşturmaya başlamak için Başlat'a tıklayın. Yaklaşık 25 dakika sürecektir.
    NOT: Burada "Konsantrasyon", adaptif evrim için kimyasal faktörlerin maksimum konsantrasyonunu ifade eder. Farklı damlacıklar için, MMC'de farklı büyüme koşulları sağlamak için farklı konsantrasyonlarda kimyasal faktörler tanıtmak mümkündür. Aşağıdaki denklemi kullanarak tanıtılan konsantrasyonları hesaplayın:
    figure-protocol-9883
    Burada "C", damlacıklara sokulan kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "a", C4 ve O4 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; "b", C6 ve O6 konektörü arasındaki reaktif şişelerindeki kimyasal faktörlerin konsantrasyonunu ifade eder; ve "i" mevcut konsantrasyonu ifade eder. MMC'de sekiz konsantrasyon vardır. Buradaki kimyasal faktör tek bir konsantrasyona (500 mmol / L metanol) sahip olduğundan ve ortamın bileşenlerinden biri olduğundan, kimyasal faktörü içeren sadece bir reaktif şişesi buraya monte edilir ve Konsantrasyon % 0 olarak ayarlanır. Tip , üç türe ayrılan alt yetiştirme modunu ifade eder: zaman modu, OD değer modu ve floresan modu. Birincisi, damlacıkları sabit bir süre boyunca yetiştirmek ve daha sonra alt yetiştirmek anlamına gelirken, son ikisi damlacıkları önceden tanımlanmış OD değerine / floresan yoğunluğuna yetiştirmek ve daha sonra alt yetiştirmek anlamına gelir. Parametre , bir alt yetiştirme modu seçerken gerekli olan ilgili parametreyi ifade eder. Tekrarlar , alt -uygulamaların sayısını ifade eder.
  7. C2 ve O2 konektörü arasına yerleştirilen reaktif şişesini adım 3.8'de açıklandığı gibi çıkarın.
  8. Her bir alt yetiştirme döneminde damlacıkların maksimum OD değerlerinin önemli ölçüde artıp artmadığını gözlemleyin. Artış gerçekleşirse ve deneme gereksinimlerini karşılıyorsa, adım 3.9'da açıklandığı gibi OD verilerini dışa aktarmak için Veri Dışa Aktarma düğmesine tıklayın.
    NOT: Burada, alt yetiştirme süresi Parametreye bağlıdır. Örneğin, Zaman ve Parametre olarak Tür 30 saat olarak ayarlanırken, alt yetiştirme süresi 30 saattir. Her alt yetiştirme döneminde, damlacıkların maksimum OD değerleri vardır. Maksimum OD değerlerinin artmasıyla uyarlanabilir evrimin deney gereksinimlerini karşılayıp karşılamadığını tahmin edin (Artış, suşun gerçek yetiştirme sürecine bağlıdır, örneğin,% 20'den fazla artmıştır).
    DİKKAT: Depolanan taze ortamın tükenmiş olup olmadığına dikkat edin. Ortam tükendikten sonra bile önemli bir artış meydana gelmediyse, daha iyi büyüyen damlacıkları çıkarın ve yeni bir adaptif evrim turu gerçekleştirin.
  9. Hedef damlacıkları MMC'den ayıklayın.
    1. Damlacık ekstraksiyonunun işlevini seçmek için Tarama düğmesine tıklayın (Şekil 3C). Topla seçeneğini seçin, hedef damlacıkların sayısına tıklayın ve ardından Tamam'a tıklayın.
      NOT: Damlacık taraması "Topla", "At" ve "Ekstrakt tohum çözeltisi" ni içerir. "Tohum çözeltisini ekstrakte et", alt yetiştirme işleminden sonra kalan damlacıkları13 toplamak anlamına gelir.
    2. Açılır pencerenin "Lütfen CF hızlı konektörünü çıkarın ve EP tüpüne yerleştirin" uyarısını yapmasını bekleyin. CF hızlı konektörünü, yazılım istemine göre toplanmak üzere mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve ardından Tamam'a tıklayın (Şekil 4D).
    3. 1-2 dakika sonra, yazılım arayüzü "Lütfen konektörü geri takın ve bittiyse Tamam'ı tıklayın" diyen yeni bir pencere açılacaktır. Ardından, CF hızlı bağlayıcısını geri takın ve MMC'nin çalışmaya devam etmesini sağlamak için Tamam'a tıklayın (Şekil 4D). Bir sonraki hedef damlacık damlacık tanıma sitesine ulaştığında, toplamak için 4.9.2-4.9.3'ü tekrarlayın.
      NOT: Tüm hedef damlacıklar toplandıktan sonra, MMC kalan damlacıkları yetiştirmeye devam edecektir. Yetiştirme gerekli değilse, işlemi doğrudan sonlandırmak için Durdur'a tıklayın.
    4. Damlacığı 2,5 μL'lik bir pipet kullanarak çıkarın, 90 mm agaroz plakasına bırakın ve yan uzunluğu 3 cm olan üçgen bir cam serpme çubuğu ile eşit şekilde yayın. Daha sonra 72 saat boyunca 37 ° C sabit sıcaklık inkübatöründe yetiştirin.
    5. 3-5 bağımsız koloni seçin ve bunları 48-72 saat boyunca 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde (200 rpm) 10 mL taze ortam ile 50 mL sallama şişelerinde ayrı ayrı yetiştirin. Sonraki deneyler için kültürlenmiş bakteri çözeltisini gliserol tüpünde depolamak için ilgili standart düzenlemeleri izleyin.

5. MMC'nin temizlenmesi

  1. Denemeyi tamamladıktan sonra, tüm işlemleri durdurmak için Durdur'a tıklayın. Ardından çipi ve tüpleri temizlemek için Temizle'ye tıklayın. Yaklaşık 15 dakika sürecek.

Sonuçlar

Bu protokol, MMC'de otomatik ve nispeten yüksek verim stratejisi ile mikrobiyal ekimi ve metanol esansiyel adaptif evrimi göstermek için örnek olarak E. coli MG1655 ve bir MeSV2.2 suşu kullanır. Büyüme eğrisi ölçümü esas olarak mikrobiyal ekimi karakterize etmek için kullanılmıştır. Adaptif evrim, otomatik sürekli alt ekimle gerçekleştirildi ve her bir alt yetiştirme sırasında seçici basınç olarak yüksek konsantrasyonda metanol eklendi. Uyarlanabilir evrimin gerçekleşip gerçekleşm...

Tartışmalar

Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uzun vadeli adaptif evrim gerçekleştirmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını sunar. MMC minyatürleştirilmiş, otomatik ve yüksek verimli bir mikrobiyal yetiştirme sistemidir. Geleneksel mikrobiyal yüksek verimli yetiştirme yöntemleri ve cihazlarıyla karşılaştırıldığında, MMC düşük işçilik ve reaktif tüketimi, basit kullanım, çevrimiçi algılama (OD ve floresan), yüksek zaman çözünürlüklü v...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2018YFA0901500), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Ulusal Anahtar Bilimsel Enstrüman ve Ekipman Projesi (21627812) ve Tsinghua Üniversitesi Girişimi Bilimsel Araştırma Programı (20161080108) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Prof. Julia A. Vorholt'a (Mikrobiyoloji Enstitüsü, Biyoloji Bölümü, ETH Zürih, Zürih 8093, İsviçre) metanol esansiyel E. coli suşu versiyon 2.2'nin (MeSV2.2) sağlanması için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PVDF filter membraneMerck Millipore Ltd.SLGPR33RBSterilize the MMC oil
4 °C refrigeratorHaierBCD-289BSWFor reagent storage
AgarBecton, Dickinson and Company214010For solid plate preparation
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20011160Component of the special medium for MeSV2.2.
Clean benchBeijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd.DL-CJ-INDIIFor aseptic operation and UV sterilization
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10007216Component of the special medium for MeSV2.2.
ComputerLenovoE450Software installation and MMC control
Constant temperature incubatorShanghai qixin scientific instrument co., LTDLRH 250For the microbial cultivation using solid medium
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10008218Component of the special medium for MeSV2.2.
Electronic balanceOHAUSAR 3130For reagent weighing
EP tubeThermo Fisher1.5 mLFor droplet collection
FeCl3·6H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10011928Component of the special medium for MeSV2.2.
Freezing TubeThermo Fisher2.0 mLFor strain preservation
GluconateSigma-AldrichS2054Component of the special medium for MeSV2.2.
GlycerolGENERAL-REAGENTG66258AFor strain preservation
High-Pressure Steam Sterilization PotSANYO ElectricMLS3020For autoclaved sterilization
isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG)Biotopped420322Component of the special medium for MeSV2.2.
Kanamycin sulfateSolarbioK8020Component of the special medium for MeSV2.2.
KH2PO4MACKLINP815661Component of the special medium for MeSV2.2.
MethanolMACKLINM813895Component of the special medium for MeSV2.2.
MgSO4·7H2OBIOBYING1305715Component of the special medium for MeSV2.2.
Microbial Microdroplet Culture System (MMC)Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. MMC-IPerforming growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
Microfluidic chipLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-ALE-ODFor various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MMC oilLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-M/S-ODThe oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
MnCl2Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.20026118Component of the special medium for MeSV2.2.
NaClGENERAL-REAGENTG81793JComponent of the LB medium
Na2HPO4·12H2OGENERAL-REAGENTG10267BComponent of the special medium for MeSV2.2.
NH4ClSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10001518Component of the special medium for MeSV2.2.
Petri dishCorning Incorporated90 mmFor the preparation of solid medium
Pipetteeppendorf2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μLFor liquid handling
Quick connector ALuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.—For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Reagent bottleLuoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MMC-PCBSampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/
Shake flaskUnion-Biotech50 mLFor microbial cultivation
Shaking incubatorShanghai Sukun Industrial Co., Ltd.SKY-210 2BFor the microbial cultivation in shake flask
Streptomycin sulfateSolarbioS8290Component of the special medium for MeSV2.2.
SyringeJIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD10 mLDraw liquid and inject it into the reagent bottle
Syringe needleOUBEL Hardware Store22GInner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm.
TryptoneOxoid Ltd.LP0042Component of the LB medium
Ultra low temperature refrigeratorSANYO Ultra-lowMDF-U4086SFor strain preservation (-80 °C)
UV–Vis spectrophotometerGeneral Electric CompanyUltrospec 3100 proFor the measurement of OD values
Vitamin B1SolarbioSV8080Component of the special medium for MeSV2.2.
Yeast extractOxoid Ltd.LP0021Component of the LB medium
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd.10024018Component of the special medium for MeSV2.2.

Referanslar

  1. Lewis, W. H., et al. Innovations to culturing the uncultured microbial majority. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).
  2. Feist, A. M., Herrgard, M. J., Thiele, I., Reed, J. L., Palsson, B. O. Reconstruction of biochemical networks in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 7 (2), 129-143 (2009).
  3. Zeng, W. Z., Guo, L. K., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. W. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  4. Kim, J., Shin, H., et al. Microbiota analysis for the optimization of Campylobacter isolation from chicken carcasses using selective media. Frontiers in Microbiology. 10, 1381 (2019).
  5. Doig, S. D., Pickering, S. C. R., Lye, G. J., Woodley, J. M. The use of microscale processing technologies for quantification of biocatalytic Baeyer-Villiger oxidation kinetics. Biotechnology and Bioengineering. 80 (1), 42-49 (2002).
  6. Harms, P., et al. Design and performance of a 24-station high throughput microbioreactor. Biotechnology and Bioengineering. 93 (1), 6-13 (2006).
  7. Chen, A., Chitta, R., Chang, D., Anianullah, A. Twenty-four well plate miniature bioreactor system as a scale-down model for cell culture process development. Biotechnology and Bioengineering. 102 (1), 148-160 (2009).
  8. Huber, R., et al. Robo-Lector - a novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microbial Cell Factories. 8, 788-791 (2009).
  9. Hasegawa, T., et al. High-throughput method for a kinetics analysis of the high-pressure inactivation of microorganisms using microplates. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (6), 788-791 (2012).
  10. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab on a Chip. 8 (2), 198-220 (2008).
  11. Kaminski, T. S., Scheler, O., Garstecki, P. Droplet microfluidics for microbiology: techniques, applications and challenges. Lab on a Chip. 16 (12), 2168-2187 (2016).
  12. Liao, P. Y., Huang, Y. Y. Divide and conquer: analytical chemistry of nucleic acids in droplets. Scientia Sinica Chimica. 50 (10), 1439-1448 (2020).
  13. Jian, X. J., et al. Microbial microdroplet culture system (MMC): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnology and Bioengineering. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  14. Wang, J., Jian, X. J., Xing, X. H., Zhang, C., Fei, Q. Empowering a methanol-dependent Escherichia coli via adaptive evolution using a high-throughput microbial microdroplet culture system. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 570 (2020).
  15. Meyer, F., et al. Methanol-essential growth of Escherichia coli. Nature Communications. 9, 1508 (2018).
  16. Grünberger, A., et al. Beyond growth rate 0.6: Corynebacterium glutamicum cultivated in highly diluted environments. Biotechnology and Bioengineering. 110 (1), 220-228 (2013).
  17. Kaganovitch, E., et al. Microbial single-cell analysis in picoliter-sized batch cultivation chambers. New Biotechnology. 47, 50-59 (2018).
  18. Baraban, L., et al. Millifluidic droplet analyser for microbiology. Lab on a Chip. 11 (23), 4057-4062 (2011).
  19. Jakiela, S., Kaminski, T. S., Cybulski, O., Weibel, D. B., Garstecki, P. Bacterial growth and adaptation in microdroplet chemostats. Angewandte Chemie International Edition. 52 (34), 8908-8911 (2013).
  20. Cedillo-Alcantar, D. F., Han, Y. D., Choi, J., Garcia-Cordero, J. L., Revzin, A. Automated droplet-based microfluidic platform for multiplexed analysis of biochemical markers in small volumes. Analytical Chemistry. 91 (8), 5133-5141 (2019).
  21. Watterson, W. J., et al. Droplet-based high-throughput cultivation for accurate screening of antibiotic resistant gut microbes. eLife. 9, 56998 (2020).
  22. Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  23. Nitschke, M., Pastore, G. M. Production and properties of a surfactant obtained from Bacillus subtilis grown on cassava wastewater. Bioresource Technology. 97 (2), 336-341 (2006).
  24. Jiang, Y. J., et al. Recent advances of biofuels and biochemicals production from sustainable resources using co-cultivation systems. Biotechnology for Biofuels. 12, 155 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 180mikrobiyal mikrodamlac k k lt r sistemiotomatik operasyonlary ksek verimlimikrobiyal ekimuyarlanabilir laboratuvar evrimievrimi i alg lama

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır