JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Optogenetik, geniş kapsamlı uygulamalara sahip güçlü bir araçtır. Bu protokol, mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemini kullanarak zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyonuna nasıl ulaşılacağını göstermektedir.

Özet

İndüklenebilir gen ekspresyon sistemleri biyolojik süreçleri incelemek için paha biçilmez bir araçtır. Optogenetik ekspresyon sistemleri, indükleyici madde olarak ışığı kullanarak gen ekspresyon zamanlaması, konumu ve genliği üzerinde hassas kontrol sağlayabilir. Bu protokolde zebra balığı embriyolarında ışık indüklenmez gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik bir ifade sistemi kullanılmaktadır. Bu sistem, E. litoralisbakterisinden doğal olarak meydana gelen ışıkla aktive edilmiş transkripsiyon faktörüne dayanan TAEL adı verilen tasarlanmış bir transkripsiyon faktörüne dayanır. Mavi ışıkla aydınlatıldığında TAEL küçültür, C120 adı verilen konyak düzenleyici elemanına bağlanır ve transkripsiyonu etkinleştirir. Bu protokol, her yerde bulunan ubb promotörünün kontrolü altında TAEL transkripsiyon faktörünü ifade eden transgenik zebra balığı embriyolarını kullanır. Aynı zamanda, C120 düzenleyici elemanı floresan bir muhabir geninin (GFP) ekspresyonunu yönlendirir. Mavi ışığı etkinleştirmek için basit bir LED panel kullanarak, GFP ekspresyonunun indüksiyonu ilk olarak 30 dakikalık aydınlatmadan sonra tespit edilebilir ve 3 saatlik ışık işleminden sonra 130 kat indüksiyondan daha yüksek bir tepeye ulaşır. Ekspresyon indüksiyonu nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve floresan mikroskopi ile değerlendirilebilir. Bu yöntem optogenetik gen ekspresyasyonu için çok yönlü ve kullanımı kolay bir yaklaşımdır.

Giriş

İndükleyici gen ekspresyon sistemleri gen ekspresyonunun miktarını, zamanlamasını ve yerini kontrol etmeye yardımcıdır. Bununla birlikte, çok hücreli organizmalarda tam olarak mekansal ve zamansal kontrole ulaşmak zor olmuştur. Zamansal kontrol en yaygın olarak küçük moleküllü bileşikler1 veya ısı şoku organizatörlerinin aktivasyonu ile elde edilir2. Yine de, her iki yaklaşım da zamanlama, indüksiyon gücü ve hedef dışı stres yanıtları sorunlarına karşı savunmasızdır. Mekansal kontrol esas olarak dokuya özgü promotörlerin kullanılmasıyla elde edilir3, ancak bu yaklaşım her zaman mevcut olmayan uygun bir promotör veya düzenleyici eleman gerektirir ve alt doku seviyesi indüksiyonu için elverişli değildir.

Bu tür geleneksel yaklaşımların aksine, ışıkla aktive edilmiş optogenetik transkripsiyonel aktivatörler gen ekspresyonunun daha ince uzamsal ve zamansal kontrolü potansiyeline sahiptir4. Mavi ışığa duyarlı TAEL/C120 sistemi zebra balığı embriyolarında kullanılmak üzere geliştirilmiş ve optimize edilmiştir5,6. Bu sistem, E. litoralis7,8bakterisinden endojen ışıkla aktive edilmiş bir transkripsiyon faktörüne dayanmaktadır. TAEL/C120 sistemi, Kal-TA4 transaktivasyon etki alanı, mavi ışığa duyarlı LOV (ışık-oksijen-voltaj algılama) etki alanı ve sarmal dönüş sarmal (HTH) DNA bağlayıcı etki alanı5içeren TAEL adlı transkripsiyonel bir aktivatörden oluşur. Aydınlatıldığında, LOV etki alanları, iki TAEL molekülünün küçültmesine, TAEL duyarlı bir C120 promotörüne bağlanmasına ve ilgi çekici bir aşağı akış geninin transkripsiyonunu başlatmasına izin veren konformasyonel bir değişikliğe uğrar5,8. TAEL/C120 sistemi minimum toksisite ile hızlı ve sağlam indüksiyon sergiler ve birkaç farklı ışık dağıtım yöntemi ile etkinleştirilebilir. Son zamanlarda, TAEL/C120 sisteminde iyileştirmeler, TAEL'e (TAEL-N) nükleer bir yerelleştirme sinyali eklenerek ve C120 düzenleyici elemanı bir cFos bazal promotörüne (C120F) kaptırarak yapılmıştır (Şekil 1A). Bu değişiklikler indüksiyon seviyelerini 15 kattan fazla artırdı6.

Bu protokolde, TAEL/C120 sistemini etkinleştirmek ve bir muhabir geni olan GFP'nin her yerde ifadesini teşvik etmek için basit bir LED panel kullanılır. Ekspresyon indüksiyonu, floresan yoğunluğu gözlemlenerek veya nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanılarak transkript seviyeleri ölçülerek nitel olarak izlenebilir. Bu protokol, TAEL/C120 sistemini, genekspresyonunun in vivo olarak sağlam bir şekilde düzenlenmesini sağlayan çok yönlü, kullanımı kolay bir araç olarak gösterecektir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışma Kaliforniya Merced Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçek gerçekleştirildi.

1. Zebra balığı geçişi ve embriyo toplama

  1. Sahte aktivasyonu en aza indirmek için TAEL transkripsiyonel aktivatör veya C120 kontrollü muhabir geni içeren ayrı transgenik zebra balığı hatlarını koruyun.
  2. Hem TAEL hem de C120 bileşenlerini içeren çift transgenik embriyo üretmek için standart yöntemler9 kullanarak her hattan 6-8 yetişkin zebra balığını çaprazlama (Şekil 1B).
    NOT: Alternatif olarak, her iki bileşen de standart yöntemler kullanılarak mRNA veya plazmid DNA'nın mikroenjeksiyon yoluyla geçici olarak ifade edilebilir10.
  3. Yumurta suyu (damıtılmış suda çözünmüş 60 μg/mL Instant Ocean deniz tuzu) içeren Petri kaplarında, test edilecek durum başına yaklaşık 30 embriyo ile embriyoları toplayın.
  4. Ortam ışığının istenmeyen aktivasyonunu en aza indirmek için bulaşıkları ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin veya alüminyum folyo ile örtün (bkz. Tablo 1).

2. Küresel ışık indüksiyonu

  1. Aynı anda birkaç embriyoya aktif mavi ışık vermek için mavi ışık (465 nm) LED panel kullanın.
  2. LED paneli embriyo içeren Petri kaplarına göre konumlandırın, böylece embriyolar tarafından alınan ışığın gerçek gücü, bir ışık gücü ve enerji ölçer ile ölçülen yaklaşık1,5 mW / cm 2 olacaktır (Şekil 2A).
  3. TAEL transkripsiyonel aktivatör5,8'e fotodamage riskini azaltmak için 3 saatten fazla aydınlatıyorsa, ışığı bir zamanlayıcı rölesi kullanarak 1 saataçık/1saat kapalı aralıklarla darbeler.
    NOT: Aydınlatma süresinin belirli uygulamalar için optimize edilmesi gerekebilir. Bu protokolde 30 dk, 1 saat, 3 saat ve 6 saat aydınlatma süresi örnekleri verilmiştir.
  4. Yoğuşmadaki hafif saçılmaları en aza indirmek için Petri kabı kapaklarını çıkarın.
  5. Kontrol embriyoları içeren Petri kaplarını ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin veya koyu kontroller için alüminyum folyo ile örtün.

3. qRT-PCR ile indüksiyonun nicel değerlendirmesi

  1. İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın.
  2. Kitin talimatlarını takip eden bir RNA izolasyon kiti kullanarak 30-50 ışıkla aktive edilmiş ve 30-50 koyu embriyodan toplam RNA çıkarın.
    1. Embriyoları 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve fazla yumurta suyunu çıkarın. Lizis tamponu ekleyin ve embriyoları plastik bir pestle homojenize edin.
    2. Lisat'ı kit tarafından sağlanan bir sütuna aktarın ve kitin talimatlarına devam edin. Hemen 3.3 adımına geçin veya saflaştırılmış RNA'yı -20 °C ila -80 °C'de saklayın.
  3. Kitin talimatlarını takip eden bir cDNA sentez kiti kullanarak cDNA sentezi için 1 μg toplam RNA kullanın.
    1. İnce duvarlı 0,2 mL PCR tüpü alın, 4 μL 5x cDNA reaksiyon ana karışımına (optimize edilmiş tampon, oligo-dT ve rastgele astarlar ve dNTP'ler içeren), 1 μL 20x ters transkriptaz çözeltisi ve toplam 20 μL hacme çekirdeksiz su ekleyin.
    2. Tüpü aşağıdaki gibi programlanmış bir termosiklete yerleştirin: 10 dakika için 22 °C, 30 dakika için 42 °C, 5 dakika için 85 °C ve ardından 4 °C'de tutun. Hemen 3.4 adımına geçin veya cDNA'yı -20 °C'de saklayın.
  4. SYBR yeşil enzim ana karışımı, 5 kat seyreltilmiş cDNA (adım 3.3) ve GFP için her astarın 325 nM'si içeren qPCR reaksiyonları hazırlayın.
    NOT: Bu protokolde kullanılan primerler aşağıdaki gibi. GFP ileri: 5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3'; GFP ters: 5'-GTCCTCCTTGAAGTCGATGC-3'; ef1a ileri 5'-CACGGTGACAACATGCTGGAG-3'; ef1a ters: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3').
  5. QPCR reaksiyonlarını gerçek zamanlı bir PCR makinesinde gerçekleştirin.
    NOT: PCR programı: 10 dakika boyunca 95 °C'de ilk aktivasyon, ardından 95 °C'de 30 sn 40 döngü, 60 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 1 dk.
  6. Reaksiyon özgüllüğünü belirlemek için PCR tamamlandığında bir eriyik eğrisi analizi gerçekleştirin. Her örnek için üç teknik çoğaltma gerçekleştirin.
  7. Işıkla aktive indüksiyonu, 2-ΔΔCt yöntemi11kullanılarak karanlıkta tutulan embriyolara göre kat değişimi olarak hesaplayın. İstatistiksel önemi bir istatistik yazılım paketi ile belirlenebilir.

4. Floresan mikroskopi ile indüksiyonun nitel değerlendirilmesi

  1. İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın.
  2. Cam çökelti slaytlarında %0.01 trikain içeren %3 metilselülozda görüntüleme için embriyoları hareketsiz hale verin.
  3. Standart GFP filtre ayarlarını kullanarak dijital kameraya bağlı floresan stereomikroskopta floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin. Tüm örnekler için aynı görüntü alma ayarlarını kullanın.
  4. Satın alma işleminden sonra brightfield ve floresan görüntüleri görüntü işleme yazılımıyla birleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu gösteri için, her iki elementi de içeren çift transgenik embriyo üretmek için her yerde bulunan b (ubb) promotöründen (Tg(ubb:TAEL-N) ucm113 )) TAEL-N'yi her yerde ifade eden transgenik bir çizgi ile C120 duyarlı bir GFP muhabir hattı (Tg (C120F:GFP)ucm107) geçildi. Döllenme sonrası 24 saat, embriyolar mavi ışığı aktive etmeye maruz kaldı, 1 saat açık/1 saat kapalı bir frekansta nabız attı. GFP ekspresyonunun indüksiyonu qRT-PCR ile 3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, mavi ışık indüklüze gen ekspresyasyonu elde etmek için optogenetik TAEL/C120 sisteminin kullanımını açıklar. Bu sistem, mavi ışıkla aydınlatıldıktan sonra küçülen ve bir C120 düzenleyici elemanının aşağı akışa giren bir ilgi geninin transkripsiyonunu etkinleştiren transkripsiyonel bir aktivatör olan TAEL'den oluşur. Bir GFP muhabirinin indüklenmiş ifadesi, 30 dakika kadar kısa bir ışık maruziyeti sonrasında tespit edilebilir, bu da bu yaklaşımın nispeten hızlı ve du...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan edildi.

Teşekkürler

Stefan Materna'ya ve Woo ve Materna laboratuvarlarının üyelerine bu protokolle ilgili yararlı öneriler ve yorumlar için teşekkür ederiz. Anna Reade, Kevin Gardner ve Laura Motta-Mena'ya bu protokolü geliştirirken değerli tartışmalar ve içgörüler için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin (NIH; R03 DK106358) ve Kaliforniya Üniversitesi Kanser Araştırma Koordinasyon Komitesi (CRN-20-636896) 'a S.W.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender web-based science illustration toolBioRenderhttps://biorender.com/
Color CCD digital cameraLumenara755-107
Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCDThorlabsPM100D
Excitation filter, 545 nmOlympusET545/25x
illustra RNAspin Mini kitGE Healthcare95017-491
Instant Ocean Sea SaltInstant OceanSS15-10
MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white)AmazonB017GWDF7E
MethylcelluloseSigma-AldrichM7140
NEARPOW Programmable digital timer switchAmazonB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR green fast mixQuantabio101414-286
Photoshop image procesing softwareAdobe
Prism graphing and statistics softwareGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 Real-Time PCR SystemApplied BiosystemsA28137
StereomicroscopeOlympusSZX16
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 Fluorescence LED light sourceExcelitas010-00326RDiscontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+

Referanslar

  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 174

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır