JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolde AAV2 vektörü, süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-yeşil floresan protein (GFP) veya terapötik gen ve BV-AAV2-rep-cap enfekte Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) böcek hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla üretilmektedir. AAV parçacıkları deterjan kullanılarak hücrelerden salınır, netleştirilir, benzeşim kolonu kromatografisi ile saflaştırılır ve teğetsel akış filtrasyonu ile konsantre edilir.

Özet

Adeno ilişkili virüsler (AAV) gen tedavisi uygulamaları için umut verici vektörlerdir. Burada, AAV2 vektörü, serumsuz süspansiyon kültüründe baculovirüs (BV)-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve BV-AAV2-rep-cap ile enfekte olmuş Sf9 hücreleri ile Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ortak kültürü tarafından üretilir. Hücreler bir yörünge çalkalayıcı veya Dalga biyoreaktöründe bir şişede kültürlenir. AAV parçacıklarını serbest bırakmak için, üretici hücreler deterjan içeren tamponda lislenir ve daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları, AAV parçacıklarını bağlayan AVB Sepharose sütun kromatografisi kullanılarak hücre lisattan arındırılır. Bağlı parçacıklar, kirleticileri gidermek için PBS ile yıkanır ve pH 3.0'da sodyum sitrat tamponu kullanılarak reçineden elde edilir. Asidik elüat alkali Tris-HCl tamponu (pH 8.0) ile nötralize edilir, fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltilir ve teğetsel akış filtrasyonu (TFF) ile daha da yoğunlaşır. Protokol, insan gen terapisi uygulamaları için büyük ölçekli klinik sınıf AAV üretimine kadar ölçekleme ile uyumlu küçük ölçekli klinik öncesi vektör üretimini tanımlamaktadır.

Giriş

Adeno ilişkili virüsler (AAV), 4,6 kb'lık tek iplikli DNA içeren zarfsız insan parvovirüsleridir. AAV vektörleri gen tedavisi uygulamaları için diğer viral vektörlere göre çeşitli avantajlara sahiptir1,2,3,4. AAV'ler doğal olarak çoğaltma yetersizdir, böylece çoğaltma için yardımcı bir virüs ve ana bilgisayar makineleri gerektirir. AAV'ler herhangi bir hastalığa neden olmaz ve enfekte konakta düşük immünojenikliğe sahiptir3,5. AAV hem sessiz hem de aktif olarak bölünen hücreleri enfekte edebilir ve konak hücrelerin genomuna entegre olmadan epizom olarak devam edebilir (AAV nadiren konak genomuna entegre olur)1,3. Bu özellikler AAV'ı gen tedavisi uygulamaları için arzu edilen bir araç haline getirmiştir.

Bir AAV gen transfer vektörü oluşturmak için, terapötik gen de dahil olmak üzere transgene kaseti, tipik olarak AAV serotip 2'den türetilen iki iç terminal tekrarı (ITR) arasında klonlanır. Transgene dizisi de dahil olmak üzere 5' ITR'den 3' ITR'ye kadar olan maksimum boyut 4,6 kb6 'dır. Farklı kapsidler farklı bir hücre veya doku tromizmine sahip olabilir. Bu nedenle, AAV vektörü ile hedef alınması amaçlanan doku veya hücre tipine göre kapsidler seçilmelidir7.

Rekombinant AAV vektörleri genellikle insan embriyonik böbrek hücreleri, HEK293 gibi memeli hücre hatlarında AAV gen transfer vektörü, AAV rep-cap ve yardımcı virüs plazmidleri2,3transeksiyon ile üretilir. Bununla birlikte, yapışan HEK293 hücrelerinin geçici transfeksiyon yoluyla büyük ölçekli AAV üretimi için çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, çok sayıda hücre yığınına veya makaralı şişeye ihtiyaç vardır. İkinci olarak, yüksek kaliteli plazmid DNA ve transfeksiyon reaktiflerine ihtiyaç vardır ve bu da üretim maliyetini arttırır. Son olarak, yapışık HEK293 hücreleri kullanılırken, serum sıklıkla en uygun üretim için gereklidir, aşağı akışişlemeyizorlaştırır 1,2,3. AAV üretiminin alternatif bir yöntemi, böcek hücre hattının, Spodoptera frugiperda (Sf9) hücrelerinin ve rekombinant Autographa californica multicapsid nükleer polihedroz virüsü (AcMNPV veya baculovirus) 8,9,10adı verilen bir böcek virüsünün kullanılmasını içerir. Sf9 hücreleri, ölçeğini büyütmesi kolay ve plazmid veya transfeksiyon reaktifleri gerektirmeyen büyük ölçekte mevcut iyi üretim uygulaması (cGMP) üretimiyle uyumlu serumsuz süspansiyon kültüründe yetiştirilir. Ayrıca, Sf9-baculovirüs sistemini kullanan AAV üretiminin maliyeti, plazmidlerin HEK293 hücrelerine geçici transfeksiyonunun kullanılması maliyetinden daha düşüktür11.

Baculovirus-Sf9 hücrelerinin kullanıldığı orijinal rAAV üretim sistemi üç baculovirüs kullandı: gen transfer kaseti içeren bir baculovirüs, rep geni içeren ikinci baculovirüs ve serotipe özgü kapsid geni içeren üçüncü baculovirüs12,13. Bununla birlikte, rep yapısı içeren baculovirüs, büyük ölçekli AAV üretimi için baculovirüsun amplifikasyonuna engel olan birden fazla geçiş turunda genetik olarak kararsızdı. Bu sorunu çözmek için, iki baculovirüs (TwoBac) içeren yeni bir rAAV vektör sistemi geliştirildi: AAV gen transfer kasetini içeren bir baculovirüs ve AAV rep-cap genlerini içeren başka bir baculovirüs, genetik olarak orijinal sistemden daha kararlı ve üç14yerine TwoBac kullandığı için rAAV üretmek için daha uygunolan , 15. OneBac sistemi, TwoBac veya ThreeBac 2,16,17kullanmak yerine bir baculovirüs kullanmak nedeniyle rAAV'ı üretmekiçin daha uygun olan tek bir baculovirüste AAV gen transfer kasetini ve rep-cap genlerini kullanır. Çalışmamızda, TwoBac sistemi optimizasyon için kullanılmıştır.

AAV üretimi için baculovirüs sisteminin de sınırlamaları vardır: baculovirüs parçacıkları serumsuz orta11'deuzun süreli depolama için kararsızdır ve baculovirüs titresi düşükse, AAV üretimi sırasında Sf9 hücrelerinin büyümesi için toksik hale gelebilecek büyük miktarda baculovirüs supernatant'a ihtiyaç vardır (kişisel gözlem). Titersiz enfekte hücre koruma ve ölçek büyütme (TIPS) hücrelerinin veya baculovirüs bulaşmış böcek hücrelerinin (BIIC) kullanılması, baculovirüs bulaşmış Sf9 hücrelerinin hazırlandığı, kriyoprezervasyona edildiği ve daha sonra taze Sf9 hücrelerinin enfeksiyonu için kullanıldığı AAV üretimi için iyi bir seçenek sağlar. Bir diğer avantaj, kriyoprezervasyon10 , 11'densonra Sf9 hücrelerinde baculovirüs (BV)stabilitesininartmasıdır.

AAV üretimini sağlamak için iki tip TIPS hücresi üretilir: birincisi Sf9 hücrelerinin BV-AAV2-GFP veya terapötik gen ile enfeksiyonu ve ikincisi BV-AAV2-rep-cap ile Sf9 hücresinin enfeksiyonu ile. TIPS hücreleri küçük ve kullanıma hazır aliquotlarda kriyoprezot olarak saklanır. AAV vektörleri, baculovirüsler ve taze Sf9 hücreleri üreten TIPS hücrelerinin birlikte kült haline sokulmasıyla yörüngesel çalkalayıcıya veya Dalga biyoreaktörüne yerleştirilen bir şişede serumsuz süspansiyon kültüründe üretilir. Sf9 hücreleri, AAV2-GFP vektörünü taşıyan baculovirüsler ve AAV oluşturmak için rep-cap dizileri ile enfekte olur. Dört ila beş gün sonra, AAV verimi en yüksek olduğunda, üretici hücreler AAV parçacıklarını serbest bırakmak için deterjanla yutlanır. Hücre lysate daha sonra düşük hızlı santrifüjleme ve filtrasyon ile netleştirilir. AAV parçacıkları AVB Sepharose kolon kromatografisi ile lysattan arındırılır. Son olarak, AAV vektörleri TFF kullanılarak yoğunlaşmıştır. Protokol, AAV'nin araştırma ve klinik öncesi çalışmalar için yararlı olan küçük ölçekte üretimini tanımlamaktadır. Bununla birlikte, yöntemler ölçeklenebilir ve gen tedavisi uygulamaları için klinik sınıf AAV vektörleri üretimi ile uyumludur.

Protokol

Protokolü özetleyen bir çizim için Şekil 1'e bakın.

1. Baculovirüs ile enfekte TIPS hücrelerinin üretimi

  1. Bir şişe Sf9 hücresini çözün ve hemen 50 mL böcek hücre kültürü ortamında tohumlayın. Sf9 hücrelerini 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörde ve 28 °C'de, hava değişimi için gevşek bir şekilde tutturulmuş bir kapakla yuvarlak alt şişelerde büyütün8,9. TIPS hücrelerinin üretimi için yeterli hücre elde etmek için hücreleri 200 mL orta içeren 1 L şişeye yayın.
  2. İki şişeye 2 x 106 hücre/mL'de 50 mL Sf9 hücresi ekleyin: bir şişe Sf9 hücresini 0,5 mL baculovirüs (BV)-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve diğer hücre şişesini 0,5 mL BV-AAV2-rep-cap ile enfekte edin.
    NOT: AAV vektör plazmidleri Dr. Robert M. Kotin (NIH) tarafından cömertçe sağlanmıştır. Bacmid DNA'sından (Bac-to-Bac Sistemi) baculovirüs üretimi daha öncetanımlanmıştır 8,9. Geçiş sırasındaki baculovirüs stabilitesi, rAAV'ın ölçek büyütme üretimi için kritik bir sorundur. Daha düşük bir baculovirüs sayısı kullanmak daha iyidir (geçiş numarası 4'e kadar). TIPS hücre üretimi sırasında akış sitometrisi (Şekil 2) kullanarak baculovirüs enfeksiyon verimliliğini kontrol larak baculovirüs süpernatantının en uygun hacmini ampirik olarak belirleyin.
  3. Enfekte Sf9 hücrelerinde baculovirüs gp64'i aşağıdaki gibi lekelenerek baculovirüs enfeksiyonunu enfeksiyondan 3-4 gün sonra izleyin.
    1. Leke 2 x 105 Sf9 hücreleri (hem enfekte olmayan hem de baculovirüs bulaşmış hücreler) 0,5 μg fare anti-baculovirüs gp64 antikoru (1:200) ile ortam sıcaklığında 30 dakika boyunca 100 μL bloke tamponunda floresan boya içerir.
    2. Antikoru çıkarmak için hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve lekeli hücreleri% 0,5 sığır serum albümini içeren 300 μL PBS'de yeniden biriktirin.
    3. Akış sitometrisi kullanarak hücrelerde baculovirus gp64 ekspresyonını analiz edin (Şekil 2).
      NOT: Akış sitometrisi alımı ve analizi için gating stratejisini ampirik olarak belirleyin. Toplam 10.000 tek canlı hücre elde edilir. Sf9 hücre yüzeylerindeki Baculovirus gp64 ekspresyonu baculovirüs enfeksiyonuna işaret eder. 3-4 gün sonra, Sf9 hücrelerinin çoğu baculovirüs gp64 ekspresyonu ile kanıtlandıkça baculovirüs ile enfekte olur (Şekil 2).
  4. Hücreler çapı artarak% 80-% 90 yaşayabilir olduğunda (Şekil 3), hücreleri hasat edin ve -80 ° C'de yavaş donan bir kapta% 10 fetal sığır serumu ve% 10 dimetil süloksit ile desteklenmiş 1 mL böcek kültürü ortamında 1 x 107 hücreyi hasat edin. Ertesi gün, TIPS hücrelerini içeren tüpü uzun süreli depolama için sıvı bir azot dondurucuya aktarın.
    NOT: Biyogüvenlik Seviye 2'de (BSL-2) standart aseptik laboratuvar tekniğini izleyerek hücre kültürünü biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

2. AAV vektör üretimi

  1. 1. Gün: Baculovirüs bulaşmış TIPS hücreleri ile ortak kültür Sf9 hücreleri
    1. AAV üretimi için gerekli olan bir çalkalayıcı inkübatörde 400 mL böcek hücresi kültürü ortamı içeren birkaç 2 L şişede 28 °C'de 1 x 106 hücre/mL'de saf Sf9 hücrelerini kültüre edin ve büyütün. 3-4 gün sonra hücre yoğunluğu 5 x 106 -6x 106 hücre/mL'ye kadar artar.
      NOT: CO2 ve nem Sf9 hücrelerinin büyümesi için önemli faktörler değildir.
    2. Sf9 hücrelerini sallama şişelerinde veya bir biyoreaktörde aşağıdaki gibi tohumlayın.
      1. Yörüngesel çalkalayıcı inkübatördeki şişelerde AAV üretimi: 2 x 106 hücre/mL'de 400 mL Sf9 kültürünü aseptik olarak 2 L şişeye tohumlamak için bir pipet veya peristaltik pompa kullanın. Yörünge çalkalayıcıyı 125 rpm ve 28 °C'de kurun.
        NOT AAV üretiminin ölçeğine bağlı olarak peristaltik bir pompa veya standart pipet kullanın.
      2. Bir biyoreaktörde AAV üretimi: 2 x 106 hücre/mL'de 1 L Sf9 kültürünü aseptik olarak 10 L biyoreaktör torbasına tohumlamak için peristaltik bir pompa kullanın. Çantayı 28 °C'de kültleme için Biyoreaktör ünitesine yükleyin. Biyoreaktör torbasına 0.1 psi'de % 40 oksijen ekleyin. Biyoreaktör ünitesini 20° açıyla kurun ve torbayı 25 rpm'de sallayın.
    3. Her BV-AAV2-GFP (veya terapötik gen) ve BV-AAV2-rep-cap TIPS hücrelerinden bir şişe çözün. Hücreleri 20 mL böcek kültürü ortamı ile seyreltin ve trippan mavisi kullanarak hücrelerin canlılık sayısını gerçekleştirin. Her iki TIPS hücresini de bir çalkalayıcı şişede veya biyoreaktörde kültürlenmiş naif Sf9 hücrelerine göre 1:10.000 oranında aşılayın.
      NOT: TIPS hücrelerinin hayatta kalması kriyoprezervasyon nedeniyle azalır ve trippan mavisi boyama ile hücre canlılığı belirlendiğinde iyileşme oranı yaklaşık% 50'dir. Büyük ölçekli rAAV üretiminden önce TIPS hücrelerinin ve naif Sf9 hücrelerinin oranını ampirik olarak belirlemek için bir pilot deney gerçekleştirin.
  2. 2. Gün: Kültür izleme
    1. 1 mL Sf9 kültürünü aseptik olarak hasat edin. Hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz etmek için Trypan mavi boyası ile leke.
  3. 3. Gün: Kültür izleme ve besleme
    1. 1 mL Sf9 kültürünü hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz edin. Adım 1.3'te belirtildiği gibi Sf9 hücrelerini lekeledikten sonra baculovirüs enfeksiyonunun durumunu kontrol edin.
      NOT: Hücre çapında artış ve sitopatik etki baculovirüs enfeksiyonunun endikasyonlarıdır. Çap artışı hücre canlılığındaki azalmadan önce gelir ve bu parametreler AAV üretimi sırasında hücre hasat süresini belirlemek için kullanılır. Ampirik olarak en uygun zaman noktasını belirleyin.
    2. Sf9 kültürünü 1:5 aseptik bir oranda taze böcek kültürü ortamı ile besleyin.
  4. 4. Gün: Kültür izleme
    1. 1 mL Sf9 kültürünü hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz edin. Oksijen kaynağını biyoreaktör torbasından çıkarın.
  5. 5. Gün: Kültür izleme ve hasat
    1. 1 mL Sf9 kültürünü hasat edin ve hücre sayısını, canlılığı ve morfolojiyi analiz edin. Sf9 hücre canlılığı yaklaşık% 50'ye düştüğünde kültür ortamını ve hücrelerini hasat etmek (Şekil 4).
    2. Hücre süspansiyonu 2100 x g'da 4 °C'de 15 dakika döndürün. Süpernatant ve hücre peletini toplayın ve -80 ° C'de saklayın.

3. Hücrelerin lizisi ve AAV'nin serbest bırakılması

  1. AAV üreticisi hücre peletini çözün. Hücre peletine 100 mL hücre lizis tamponu (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM sodyum klorür, % 0.5 Triton-X-100) ekleyin, kuvvetlice karıştırın ve AAV parçacıklarını serbest bırakmak için ortam sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatın.
  2. 2100 × g'da 4 °C'de 30 dakika santrifüjleyin ve hücre lisatını yeni bir kaba aktarın. Çözdükten sonra hücre lisatını ve hücre kültürü üstnatantını karıştırın.
  3. DNA ve RNA'yı sindirmek için hücre lisatine20 U/mL nükleaz ve 10 mM MgCl 2 ekleyin. 37 °C'de 2-4 saat kuluçkaya yaslanın.
  4. Bir pompa kullanarak 0,8 μm ve 0,2 μmpolyethersulfone çift filtrasyon sistemi aracılığıyla lisatı filtreleyin.
  5. Netleştirilmiş hücre lisatını bir gecede 4 °C'de saklayın veya AAV'ı hemen arındırın.

4. Benzeşim sütunu kromatografi sistemi kullanılarak AAV vektörün saflaştırılması

  1. Numune ve tampon hatlarını steril su, 1 N sodyum hidroksit, su ve fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ile 50 mL/dk akış hızında sırayla yıkayarak kromatografi aletini hazırlayın.
  2. AVB Sepharose sütununu (10,0 mL) kromatografi sistemine monte edin ve 5 mL/dk akış hızında 100 mL PBS çalıştırın.
    NOT: AAV üretiminin ölçeğine bağlı olarak daha düşük veya daha yüksek hacimli bir AVB Sepharose sütunu kullanın ve sütun veya reçine üreticisi tarafından önerildikçe akış hızını ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
  3. Sütun geçiş çözeltisi, yıkama tamponu ve AAV parçacıklarını içeren elütion tamponunun fraksiyonlarını toplamak için, tüpleri kromatografi aletinin fraksiyon toplayıcı yuvalarına yerleştirin.
  4. Sütunu PBS ile 5,0 mL/dk akış hızında dengele.
  5. AAV partikülleri içeren filtrelenmiş hücre lisasını, numune pompası ile donatılmış kromatografi makinesini kullanarak sütuna yükleyin. Numuneyi dakikada 3,0 mL akış hızında çalıştırın.
  6. PBS'yi AVB Sepharose sütununda 3,0 mL/dk akış hızında çalıştırın, ta ki ultraviyole (UV) emiciliği eğrisi (280 nm) taban çizgisine dönene ve kararlı hale gelene kadar.
  7. AAV parçacıklarını sütundan 3,0 mL/dk akış hızında 50 mM sodyum sitrat (pH 3,0) tampon ile elute edin (Şekil 5).
    NOT: AAV parçacıkları reçineden ayrışırken ve UV dedektöründen geçerken, kromatogramda proteinin bir elüasyon zirvesi görülebilir.
  8. AAV'nin asidik elüsyon tamponu ile pH aracılı bozulmasını önlemek için, süpernatant içeren AAV'nin pH'ını yaklaşık pH 5,5'e çıkarmak için AAV süpernatantı 500 mM Tris-HCl (pH 8.0) beşte bir hacimle hemen seyreltin. Ayrıca, pH'ı tamamen nötralize etmek için AAV süpernatantını PBS ile 10 kat seyreltin.
    NOT: rAAV çözeltisini nötralize ettikten sonra pH değeri yaklaşık 5,5'tir. AAV'yi nötralize ettikten sonra, rAAV çözeltisini PBS (pH 7.4) ile 10 kat seyreltin, böylece AAV fizyolojik bir tampondadır.
  9. Hedef hücrelerin enfeksiyonu ile AAV varlığını değerlendirmek için her sütundan 1 mL'lik numuneleri, yıkama tamponunu ve 100 μL'lik eluted AAV süpernatantını saklayın.
  10. AVB Sepharose sütununu 100 mL 100 mM sitrik asit (pH 2.1) ve 100 mL PBS (pH7.4) ile 5.0 mL/ dk akış hızında temizleyin. Sütunu % 20 etanol ile 5,0 mL / dk akış hızında durulayın ve 4 ° C'de saklayın.
  11. Kromatografi aletinin işlem hatlarını bölüm 4.1'de açıklandığı gibi sütun çevrimdışı konumuyla temizleyin. Son olarak, kromatografi sistemini 50,0 mL/ dk akış hızında% 20 Etanol 200 mL ile durulayın ve% 20 etanol depolayın.

5. Teğetsel akış filtrasyonu kullanılarak AAV vektörün konsantrasyonu ve diafiltasyonu (TFF)

  1. AAV'yi konsantre etmek için polisülfone membran kartuşu (100 kDa Moleküler Ağırlık Kesme) ile donatılmış TFF sistemini kurun.
  2. 10 dakika boyunca 200 mL PBS ile TFF modüllerini dengele.
  3. 2-3 psi'de trans-membran basıncını korurken numune istenen hacme düşürülene kadar pompanın akışını kontrol ederek AAV örneğini yükleyin.
  4. Bu çalışmada kullanıldığı gibi, retentate'i 100 mL PBS ile diafiltrate edin veya AAV'nin uzun vadeli stabilitesini destekleyen alternatif tamponu ampirik olarak tanımlayın.
  5. AAV örneğini istenen hacme konsantre ettikten sonra, AAV örneğini toplayın, 0,2 μm poliethersülfonefiltre, aliquot ile filtreleyin ve sonra -80 ° C'de saklayın.

6. Arınma adımlarında AAV varlığını değerlendirmek için AAV örneklerinin hedef hücrelere bulaşması

  1. Enfeksiyondan bir gün önce % 1 L-glutamin, % 1 sodyum piruvat ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 500 μL Dulbecco Modifiye Kartal Ortası (DMEM) içinde 24 kuyulu bir plakada 7 x 104 HT1080 hücre / kuyu aşıla. Hücreleri 37 °C ve% 5 CO2'debir inkübatörde kültüre edin.
  2. Enfeksiyondan önce hücreleri sayın. Sütun çalışmadan önce seyreltilmiş unpurified AAV toplu örneğini, sütun çalıştırma örneklerini, yıkama tamponunu ve eluted saflaştırılmış AAV örneğini ekleyin.
    NOT: Trypan mavi lekeli hücreleri hemositometre ile sayın. AAV numunelerinin seyreltme faktörünü ve hacmini (μL) ampirik olarak belirleyin. AAV titreleri ne kadar yüksek olursa, o kadar fazla seyreltme gerekir. Sütun çalışmadan önce amaçlanmamış dökme numunenin baculovirüs parçacıklarının, sütundan geçen numunelerin, yıkama tamponunun AAV'nin enfeksiyöz titrelerini belirlemek için hedef hücreleri enfekte etmeden önce 50 ° C'de 50 ° C'de ısı inaktive edildiğinden emin olun.
  3. Enfeksiyondan iki gün sonra, bir akış sitometresi kullanarak hücrelerdeki protein ekspresyonunu (örneğin, GFP veya terapötik gen) analiz edin.
  4. Enfeksiyon anında hücre sayısını, seyreltme faktörünü ve GFP+ hücrelerinin yüzdesini şu formülle AAV'nin enfeksiyöz titrelerini hesaplayın: (Toplam hücre sayısı x Yüzdeler GFP+ hücreleri x Seyreltme Faktörü) / Mililitre cinsinden AAV hacmi.
    NOT: Örneğin, hücre sayısı 1 x 105, GFP+ hücrelerinin yüzdesi% 3.4, seyreltme faktörü 100 ve eklenen AAV hacmi 2 μL'dir. AAV'nin titer'i 1.7 x 108 enfeksiyöz birimdir (IU)/mL. Eluted fraksiyonun 25 mL'sinde saflaştırılmış AAV parçacıklarının toplam miktarı 4,3 x 109 enfeksiyöz birimdir (IU)/mL (Şekil 6). İlk teşvik edilmemiş AAV parçacıklarının toplam sayısı 1,09 x 1010 IU/mL'dir ve saflaştırılmış AAV parçacıkları 4,3 x 109 IU/mL'dir. Bu nedenle, iyileşme yüzdesi% 39.4'tür. GFP+ hücrelerinin yüzdesi% 1-30 arasında olmalıdır, bu da AAV'nin enfeksiyöz titerini hesaplamak için kullanıldığında doğrusal bir aralığa karşılık gelir. Hedef hücrelere daha konsantre AAV vektör parçacıkları bulaşırsa; AAV parçacıklarının birden fazla kopyasının vektörün tek bir kopyası olarak gösterilecek tek bir hücreye bulaşma olasılığı vardır. Bu nedenle, hedef hücrelerde%1-%30 vektör enfeksiyonu elde etmek için AAV vektör süpernatantını seyreltin. AAV vektörüne muhabir geni yoksa, transgene veya AAV vektörü tarafından ifade edilen terapötik geni, akış sitometresi kullanılarak tespit edilebilen ve miktarlandırılabilen floresan boya içeren bir antikorla lekeleyin. Tüm AAV serotipleri HT1080 hücrelerini verimli bir şekilde enfekte edebilir. Bu nedenle, diğer AAV serotipleri için enfeksiyozluk testini gerçekleştirmek için farklı hücre çizgileri kullanın. HT1080 hücrelerinde saflaştırmadan önce ve saflaştırmadan sonra AAV2-GFP parçacıklarını titretin ve GFP ekspresyonını akış sitometrisi ile ölçün. Saflaştırmadan önce saflaştırılmış AAV partiküllerinin sayısı ve AAV parçacıklarının sayısı 100 ile çarpılarak geri kazanımı (%) hesaplayın.

Sonuçlar

Burada, Sf9 böcek hücre sistemi kullanılarak AAV vektörlerinin üretimi ve saflaştırılması için proses gelişiminin temsili sonuçları gösterilmiştir. Yöntem, Sf9 hücrelerinin baculovirüs ile enfekte TIPS hücreleri ile birlikte kültürlenmesini, hücrelerin büyüme ortamı ile beslenmesini, AAV parçacıklarını serbest bırakmak için üretici hücrelerin toplanmasını ve lizizlenmesini, hücre lizatının nükleaz tedavisi ile netleştirilmesini, santrifüjlenme ve filtrasyonunu, AVB Sepharose benze...

Tartışmalar

AAV vektörlerinin üretim, saflaştırma ve konsantrasyonunun proses geliştirilmesi için bu protokolde kullanılan parametreler, gen tedavisi uygulamaları için AAV vektörlerinin hem küçük hem de büyük ölçekli üretimine uygulanabilir. Tüm yukarı ve aşağı akış işlemi, mevcut İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) ile uyumlu kapalı bir sistemde gerçekleştirilebilir. Sf9-baculovirüs sisteminin en büyük avantajları, uygun maliyetle büyük ölçekli GMP sınıfı AAV üretimi için ölçeklenebilirlikt...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Dr. Robert M. Kotin'e (Ulusal Kalp, Kan ve Akciğer Enstitüsü, NIH) bize cömertçe AAV plazmidlerini ve Danielle Steele ve Rebecca Ernst'e (Cincinnati Çocuk Hastanesi) teknik yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Cincinnati Çocuk Araştırma Vakfı'ndan M.N.'ye start-up fonu tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 N Sodium HydroxideSigma-Aldrich1.09137For Akta Avant cleaning
2 L flasksThermoFisher Scientific431281Flask for suspension culture
50 ml Conical tubeThermoFisher Scientific14-959-49AFor collection of supernatants
24-well plateThermoFisher Scientific07-200-80Adherent cell culture plate
250 mL flasksThermoFisher Scientific238071Flask for suspension culture
Akta Avant 150 with Unicorn SoftwareCytiva28976337Chromatography system
AVB Sepharose High PerformanceCytiva28411210Chromatography medium
Baculovirus-AAV-2 GFPIn-housenon-catalogAAV transfer vector
Baculovirus-AAV-2 rep-capIn-housenon-catalogAAV packaging vector
NucleaseSigma-AldrichE1014Enzyme to degrade DNA and RNA
Blocking bufferSanta Cruz Biotechnologies516214Blocking to prevent non-specific antibody binding to cells
Cell lysis bufferIn-houseNon-catalog item20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0.5 % Titron X-100
Cellbag, 2 L and 10 LCytiva28937662Bioreactor bag
Cleaning bufferIn-houseNon-catalog item100 mM citric acid (pH 2.1) 
CryovialThomas Scientific1222C24For cryopreservation
DMEMSigma-AldrichD6429Growth media for cell lines
Elution bufferIn-houseNon-catalog item50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0)
EthanolSigma-AldrichE7073For disinfection and storage of the chromatography
Filtration unit Pall Corporation12941Membrane filter
HT1080 cell lineATCCCCL-121Fibroblast cell line
HyClone™ SFX-Insect culture mediaCytivaSH30278.02Serum-free insect cell growth medium
Peristaltic PumpPall CorporationNon-catalog itemTFF pump
MaxQ 8000 orbital shaker incubator ThermoFisher ScientificNon-catalog itemShaker for suspension culture
MicroscopeNikonNon-catalog itemCell monitoring and counting 
Mouse anti-baculovirus gp64 PE antibodySanta Cruz Biotechnologies65498 PEMonitoring baculovirus infection in Sf9 cells
Oxygen tankPraxairNon-catalog item40 % Oxygen supply is needed for Sf9 cell growth
PBSThermoFisher Scientific20012027Wash buffer
Silver Staining kitThermoFisher ScientificLC6100Staining AAV capsid proteins
Sf9 cellsThermoFisher Scientific11496-015Insect cells
Steile waterIn-houseNon-catalog itemFor Akta Avant cleaning
Table top centrifugeThermoFisher Scientific75253839/433607For clarification of Baculovirus supernatant
Tangential Flow Filtration (TFF) cartridgePall CorporationOA100C12TFF cartridge to concentrate the AAV
Tris-HCl, pH 8.0ThermoFisher15568025Alkaline buffer to neutralize the eluted AAV
WAVE Bioreactor System 20/50Cytiva28-9378-00Bioreactor

Referanslar

  1. Hildinger, M., Auricchio, A. Advances in AAV-mediated gene transfer for the treatment of inherited disorders. European Journal of Human Genetics. 12 (4), 263-271 (2004).
  2. Wu, Z., Asokan, A., Samulski, R. J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Molecular Therapy. 14 (3), 316-327 (2006).
  3. Nathwani, A. C., et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England Journal of Medicine. 365 (25), 2357-2365 (2011).
  4. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  5. Mingozzi, F., High, K. A. Immune responses to AAV vectors: overcoming barriers to successful gene therapy. Blood. 122 (1), 23-36 (2013).
  6. Grieger, J. C., Samulski, R. J. Packaging capacity of adeno-associated virus serotypes: impact of larger genomes on infectivity and postentry steps. Journal of Virology. 79 (15), 9933-9944 (2005).
  7. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-dressing the virion: the transcapsidation of adeno-associated virus serotypes functionally defines subgroups. Journal of Virology. 78 (9), 4421-4432 (2004).
  8. Nasimuzzaman, M., Lynn, D., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 16071 (2016).
  9. Nasimuzzaman, M., vander Loo, J. C. M., Malik, P. Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57019 (2018).
  10. Sandro, Q., Relizani, K., Benchaouir, R. AAV Production Using Baculovirus Expression Vector System. Methods in Molecular Biology. 1937, 91-99 (2019).
  11. Cecchini, S., Virag, T., Kotin, R. M. Reproducible high yields of recombinant adeno-associated virus produced using invertebrate cells in 0.02- to 200-liter cultures. Human Gene Therapy. 22 (8), 1021-1030 (2011).
  12. Urabe, M., Ding, C., Kotin, R. M. Insect cells as a factory to produce adeno-associated virus type 2 vectors. Human Gene Therapy. 13 (16), 1935-1943 (2002).
  13. Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. Journal of Virology. 80 (4), 1874-1885 (2006).
  14. Chen, H. Intron splicing-mediated expression of AAV Rep and Cap genes and production of AAV vectors in insect cells. Molecular Therapy. 16 (5), 924-930 (2008).
  15. Smith, R. H., Yang, L., Kotin, R. M. Chromatography-based purification of adeno-associated virus. Methods in Molecular Biology. 434, 37-54 (2008).
  16. Aslanidi, G., Lamb, K., Zolotukhin, S. An inducible system for highly efficient production of recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors in insect Sf9 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5059-5064 (2009).
  17. Wu, Y., et al. Popularizing recombinant baculovirus-derived OneBac system for laboratory production of all recombinant adeno-associated virus vector serotypes. Current Gene Therapy. 21 (2), 167-176 (2021).
  18. Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3199-3211 (2020).
  19. Joshi, P. R. H., et al. Development of a scalable and robust AEX method for enriched rAAV preparations in genome-containing VCs of serotypes 5, 6, 8, and 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 341-356 (2021).
  20. Dickerson, R., Argento, C., Pieracci, J., Bakhshayeshi, M. Separating empty and full recombinant adeno-associated virus particles using isocratic anion exchange chromatography. Biotechnology Journal. 16 (1), 2000015 (2021).
  21. Wright, J. F. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Therapy. 15 (11), 840-848 (2008).
  22. Tomono, T., et al. highly efficient ultracentrifugation-free chromatographic purification of recombinant AAV serotype 9. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 180-190 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 179AAVbaculovir sSf9 h creleribiyoreakt rkromatografisafla t rmate etsel ak filtrasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır