Tek parçacıklı Cryo-elektron Mikroskopisi için Kullanıcı Dostu, Yüksek Verimli ve Tam Otomatik Veri Toplama Yazılımı

Özet

Tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi ve kullanıcı dostu bir işlem hattı gerektirir. Burada, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküllerin veri toplanması için tam otomatik görüntü alma yazılım paketi, Latitude-S ve pratik bir boru hattı uygulamasını sunuyoruz.

Özet

Son birkaç yılda, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopislerindeki (kriyo-EM) teknolojik ve metodolojik gelişmeler, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için yeni bir yol açmıştır. Cryo-EM'deki dikkat çekici gelişmelere rağmen, tek parçacık analizi iş akışının çeşitli yönlerinde iyileştirme için hala bir kapsam vardır. Tek parçacıklı analiz, yüksek verimli otomatik veri toplama için uygun bir yazılım paketi gerektirir. Son sekiz yılda tek parçacıklı kriyo-EM için otomatik görüntüleme için çeşitli otomatik veri toplama yazılım paketleri geliştirilmiştir. Bu makale, düşük doz koşullarında vitrifiye biyomoleküller için tam otomatik bir görüntü alma boru hattının bir uygulamasını sunun.

Cryo-EM verilerini tam, otomatik ve tam olarak toplayabilen bir yazılım paketi gösterir. Ek olarak, çeşitli mikroskobik parametreler bu yazılım paketi tarafından kolayca kontrol edilir. Bu protokol, bu yazılım paketinin doğrudan elektron dedektörü (DED) ile donatılmış 200 keV kriyo-elektron mikroskobu ile şiddetli akut solunum sendromu-koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) spike proteininin otomatik görüntülenmeslerindeki potansiyelini göstermektedir. Sars-CoV-2'nin spike proteininin atomik çözünürlüklü bir yapısını sağlayan tek bir oturumda (48 saat) yaklaşık 3.000 kriyo-EM film görüntüsü elde edildi. Ayrıca, bu yapısal çalışma, spike proteininin iki ana uygunluk benimsediğini göstermektedir, 1-RBD (reseptör bağlayıcı alan adı) açık ve tüm RBD kapalı konformasyonları.

Giriş

Tek parçacıklı kriyo-EM, biyolojik makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tespiti için ana akım bir yapısal biyoloji tekniği haline ^gelmiştir1. Tek parçacıklı rekonstrüksiyon, daha sonra biyolojik bir makromolekülün üç boyutlu (3D) yapısını yeniden oluşturmak için kullanılan iki boyutlu (2B) parçacık görüntülerini çıkarmak için çok sayıda vitrifiye örnek mikrobu elde edilmesine ^{bağlıdır2,3}. DED'lerin geliştirilmesinden önce, tek parçacıklı rekonstrüksiyondan elde edilen çözünürlük 4 ila 30 ^Å4,5 arasında değişmektedir. Son za....

Protokol

NOT: Kriyo-EM veri toplama için üç önemli adım gereklidir: 1. kriyo-EM ızgara hazırlama, 2. mikroskobun kalibrasyonu ve hizalanması, 3. otomatik veri toplama (Şekil 1). Ayrıca, otomatik veri toplama a. uygun alan seçimi, b. Latitude-S optimizasyonu, c. otomatik delik seçimine başla ve d. otomatik veri toplamayı başlat (Şekil 1) olarak ikiye ayrılır.

1. Otomatik veri toplama için Cryo-EM ızgara hazırlama ve örnek yükleme

1. Izgara deşarjı kullanarak ızgaraları temizleyin ve deneysel gereksinimlere göre kızdırma deşarj parametrelerini değiştirin (burada, 20 mA'da 60 s).
....

Sonuçlar

Mevcut pandemi durumunda, cryo-EM, sars-CoV-226,27,28,29'dan çeşitli proteinlerin yapılarının karakterizesinde önemli bir rol oynar ve bu da virüse karşı aşı ve ilaç geliştirilmesine yardımcı olabilir. 2019'un koronavirüs hastalığıyla mücadele için sınırlı insan kaynağına sahip hızlı araştırma çalışmalarına acil ihtiyaç var. Tek parçacıklı kriyo-EM'de veri .......

Tartışmalar

Latitude-S, iki gün içinde binlerce yüksek çözünürlüklü mikrografiyi veya film dosyasını otomatik olarak kurmak ve toplamak için bir ortam sağlayan sezgisel bir kullanıcı arayüzüdür. Izgaralarda kolay gezinme sağlar ve düşük büyütmeden yüksek büyütmeye geçerken mikroskop aşamasının konumunu korur. Latitude-S ile veri toplamanın her adımı, basit bir kullanıcı arayüzü, 4,5 GB/s hıza kadar hızlı veri akışı ve edinme sırasında verilerin aynı anda görüntülenmesi gibi özellikl.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blotting paper	Ted Pella, INC.	47000-100	EM specimen preparation item
Capsule	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97591	EM specimen preparation unit
Cassette	Thermo Fisher Scientific	1020863	EM specimen preparation unit
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	EM specimen preparation item
C-Clip Insertion Tool	Thermo Fisher Scientific	9432 909 97571	EM specimen preparation tool
C-Clip Ring	Thermo Fisher Scientific	1036173	EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil)	Electron Microscopy Sciences	Q3100AR1.3	R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge Machine	Quorum	N/A	Quorum GlowQube glow discharge machine
K2 DED	Gatan Inc.	N/A	Cryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S Software	Gatan Inc.		Imaging software
Loading station	Thermo Fisher Scientific	1130698	EM specimen preparation unit
Talos 200 kV Arctica	Thermo Scientific™	N/A	Cryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IV	Thermo Fisher Scientific	N/A	EM specimen preparation unit