İskemik Kalpte Gen Tedavisinin Etkinliğini Değerlendirmek İçin Büyük Hayvan Modeli

Özet

İskemik kalp hastalığı için miyokard gen tedavisi, gelecekteki terapötikler için büyük umut vaat etmektedir. Burada, iskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için büyük bir hayvan modeli sunuyoruz.

Özet

Koroner arter hastalığı tüm dünyada mortalite ve morbiditenin önemli nedenlerinden biridir. Mevcut tedavilerin ilerlemesine rağmen, koroner arter hastalığı hastalarının önemli bir kısmı semptomatik kalmaktadır. Gen terapisi aracılı terapötik anjiyogenez, miyokard perfüzyonunu iyileştirmek ve semptomları hafifletmek için yeni bir terapötik yöntem sunmaktadır. Farklı anjiyojenik faktörlerle gen tedavisi az sayıda klinik çalışmada incelenmiştir. Yöntemin yeniliği nedeniyle, miyokard gen tedavisinin ilerlemesi tezgahtan başucuna kadar sürekli bir yoldur. Bu nedenle, güvenlik ve etkinliği değerlendirmek için büyük hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Büyük hayvan modeli orijinal hastalığı ve kliniklerde kullanılan son noktaları ne kadar çok tanımlarsa, klinik çalışmalardan elde edilen sonuçlar o kadar öngörülebilir olur. Burada, iskemik domuz kalbindeki gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için büyük bir hayvan modeli sunuyoruz. Ultrason görüntüleme ve ¹⁵_H2O-PET gibi klinik olarak ilgili görüntüleme yöntemlerini kullanıyoruz. İstenilen bölgeye gen transferlerini hedeflemek için elektroanatomik haritalama kullanılır. Bu yöntemin amacı: (1) kronik koroner arter hastalığını taklit etmek, (2) kalbin hipoksik bölgelerinde terapötik anjiyogenezi indüklemek ve (3) ilgili sonlanım noktalarını kullanarak gen tedavisinin güvenliğini ve etkinliğini değerlendirmektir.

Giriş

Koroner arter hastalığı, dünya çapında mortalite ve hastalık yükünün büyük bir kısmından sorumludur¹. Güncel tedavi stratejileri perkütan girişimler, farmakolojik tedavi ve bypass cerrahisidir². Bununla birlikte, bu mevcut terapötiklerin ilerlemesine rağmen, birçok hasta refrakter anjinadan muzdariptir ve bu da yeni tedavi yaklaşımlarına olan karşılanmamış ihtiyacın altını çizmektedir³. Gen tedavisi aracılı terapötik anjiyogenez bu hasta grubunu hedefleyebilir.

Miyokard gen tedavisi çoğunlukla farklı viral vektörler, en yaygın olarak replikasyon eksikliği olan adenovirüs⁴ kullanılarak verilir. Terapötik genler olarak, çeşitli anjiyojenik büyüme faktörleri kullanılır. En çok çalışılan anjiyojenik büyüme faktörleri, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörleri (VEGFR'ler) ve bunların ko-reseptörleri 5 yoluyla anjiyojenik sinyalleşmelerine aracılık eden vasküler endotelyal büyüme faktörleridir⁽VEGF'ler). Birkaç klinik çalışma, kardiyak gen tedavisinin yararını ve güvenliğini kanıtlamış ve bu yeni tedavi yöntemini iskemik kalp hastalıklarının tedavisinde gerçekçi bir seçenek haline getirmiştir ^6,7. Bununla birlikte, bu kavramın kliniklere girmeden önce büyük hayvan modellerinde test edilen terapötik genlerin ve viral vektörlerin geliştirilmesine hala ihtiyacı vardır. Domuz, kalbi insan kalbine çok benzediği için sıklıkla laboratuvar hayvanı olarak kullanılmıştır. Bir domuzun kardiyovasküler sisteminin büyüklüğü, insanlarda kullanılana benzer kateter icatlarının kullanılmasına izin verir. İnsanlar için mevcut tüm görüntüleme yöntemleri domuzlarda kullanılabilir⁸.

Kronik iskemi için birkaç büyük hayvan modeli vardır. En sık kullanılanı ameroid konstriktör modeli ^9,10,11'dir. Bu yöntemin dezavantajı, koroner vaskülatüre erişmek için torakotomi gerektiğinden invazivliktir. Daha önce grubumuzda kronik miyokard iskemisi için mini invaziv darboğaz stent modeli geliştirilmiştir¹². Bu yöntem bu makalede miyokard iskemisini indüklemek için de kullanılmıştır.

Ultrasonografinin kullanılabilirliği, görüntüleme yönteminin yaşına rağmen önemli ölçüde gelişmiştir. Örneğin, miyokard suşu hala yeniliği nedeniyle araştırma kullanımındadır. Miyokard suşu, kalbin kasılma fonksiyonundaki değişiklikleri geleneksel M-modu ejeksiyon fraksiyonu ölçümünden daha iyi yansıtır¹³. Böylece, burada büyük hayvan modelinde, miyokard suşu ölçümü kullanılır. Kalbin fonksiyonunu değerlendirmek için, anjiyografi sırasında sol ventrikülün sineksi görüntülemesi ile kalp debisi de ölçülür. Kardiyak debi, stres altında miyokard fonksiyonunu değerlendirmek için hem istirahatte hem de dobutamin kaynaklı stres altında ölçülür.

Kalp fonksiyonunun ölçümlerine ek olarak, miyokard perfüzyonu hakkında bilgi, terapötik anjiyogenezi amaçlayan gen terapisi çalışmalarında esastır. Bu hayvan modelinde, miyokard perfüzyonunu ölçmek için altın standart olduğu için hayvanlar 15 O etiketli radyosu pozitron emisyon tomografisi (¹⁵H₂O-PET) ile görüntülenmektedir. ¹⁵_H2O-PET daha önce iskemik domuz kalbi^14'ün perfüzyonunu ölçmek için doğrulanmıştır.

Bu nedenle, yukarıda belirtilen yöntem ve modaliteler, iskemik kalpte gen tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için mükemmel bir bakış açısı oluşturmaktadır.

Protokol

Burada sunulan deneyler yaklaşık 10 haftalık dişi evcil domuzlar kullanılarak gerçekleştirilmekte ve Finlandiya'daki Hayvan Deneyi Kurulu tarafından onaylanmaktadır. Protokolün başında 30-40 kg ağırlığındaki hayvanlar, insanlar için mümkün olduğunca aynı prosedürel ekipman ve görüntüleme yöntemlerine izin verir. Kronik iskemi, gen transferinden 14 gün önce indüklenir ve gen transferinden sonraki takip süresi, kullanılan viral vektöre bağlıdır. Çalışma protokolü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, adenoviral veya AAV aracılı gen terapisi enjeksiyonlarını gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örnek toplama zamanı, kullanılan viral vektöre bağlı olarak transgen ekspresyon zirvesine ayarlanmalıdır. Örneğin, adenoviral gen transferleri yapılırken, örnek toplama zamanı gen transferinden 6 gün sonrasına ayarlanır.

1. İlaç tedavisi

1. Ölümcül ventriküler aritmileri önlemek için günlük 200 mg amiodaron ve 2.5 mg bisoprolol dozu uygulayın. İlaç iskemi operasyonundan 1 hafta önce başlar ve takibe kadar günlük olarak devam edilir.
2. Ek olarak, stent yerleştirildikten sonra akut stent içi trombozu önlemek için iskemi operasyonundan 1 gün önce hayvanlara peroral dozlarda klopidogrel (300 mg) ve asetilsalisilik asit (300 mg) uygulayın.
3. Ventriküler aritmileri önlemek için iskemi operasyonunun başlangıcında hayvanlara intravenöz olarak 100 mg lidokain ve 2.5 mL (246 mg / mL) MgSO₄ uygulayın.
4. Enfeksiyon profilaksisi için her ameliyatın başında kas içi sefuroksim enjeksiyonu (500 mg) uygulayın.
5. 30 mg enoksaparin, iskemi operasyonlarının başlangıcında intravenöz olarak ve trombozun önlenmesi için operasyon prosedüründen sonra deri altından uygulanır.
6. Anestezi ve analjezi için, 15 mg / kg / s oranında 1.5 mL atropin, 6 mL azaperon (40 mg / mL), propofol 20 mg / mL ve 10 μg / kg / s oranında fentanil 50 μg / mL uygulayın. İlaç dozajları her domuz için aynıydı. Doz uygulaması için yerel hayvan kullanım kılavuzlarına bakın.
7. Tüm operasyonlar sırasında hayvanları uyuşturun. Tüm operasyonlar steril bir teknik kullanılarak steril bir ortamda yapılmalıdır.

2. Transtorasik ekokardiyografi

1. Saptanabilir herhangi bir perikardiyal sıvıyı değerlendirmek ve miyokard suşunu belirlemek için iskemi operasyonu, gen transferi ve ötenaziden önce transtorasik ekokardiyografi yapın.
2. Mitral kapak seviyesinde, papiller kas ve apikal seviyelerde parasternal kısa eksenli görünümlere erişmek için dönüştürücüyü domuzun koltuk altındaki üçüncü veya dördüncü interkostal boşluğa yerleştirin (Video 1). Dönüştürücünün işaretleyicisi, domuzun sternumuna işaret etmelidir. Bir klibi kaydetmek için, Al tuşuna basın.

3. Floroskopik kılavuzluk altında endovasküler operasyonlar

1. İskemi operasyonu, gen transferi ve doku toplama işlemlerinden önce koroner anjiyografi sonrası sol ventrikül sinüs görüntülemesi yapılır.
2. Operasyonun hazırlanması
   1. Domuzları 1.5 mL atropin ve 6 mL azaperon intramüsküler enjeksiyonu ile sakinleştirerek operasyonlara hazırlanın.
   2. Sedasyondan sonra, sırasıyla 15 mg / kg / s ve 10 μg / kg / s dozlarında domuzlara anjiyografik prosedürler için genel propofol ve fentanil anestezisi indükleyin.
      NOT: Domuzlar tüm prosedür boyunca uyuşturulur.
   3. Entübasyon ve ventilatör ile ventilasyonu destekleyin ve EKG ve solunum parametreleri gibi hayati fizyolojik parametreleri izleyin.
3. Tanıtıcı kılıf yerleşimi
   1. Kardiyolojide standart uygulama olarak tüm ameliyatlar için sağ femoral artere tanıtıcı kılıf yerleştirin. Femoral arteri izlemek için ultrason kullanın ve bir giriş iğnesi (18 G) ile delin.
      NOT: İntramyokardiyal gen transferleri için 8F tanıtıcı kılıf ve diğer tüm işlemler için 6F kılıf kullanın. Arteri iplik haline getirmek için kılıfın kılavuz telini iğneden geçirin ve iğneyi çıkarırken kılavuz teli sabit tutun.
   2. Giriş kılıfını kılavuz tel boyunca yerleştirin ve yerleştirildiğinde, kılavuz teli çıkarın ve koroner vazodilatasyonu indüklemek için domuza 1.25 mg dil altı dinitrat uygulayın.
4. Koroner anjiyografi
   1. İskemi operasyonu, gen transferi ve doku toplanmasından hemen önce koroner anjiyografi yapın. Anjiyogramlar için gerekli makineler Şekil 2'de gösterilmiştir.
   2. Sağ koroner arteri ve sol yükselen koroner arteri görüntülemek için iyot kontrast madde ile floroskopik kılavuzluk altında 6F kateter kullanın (Video 2).
5. İstirahat ve dobutamin stres altında sol ventrikül sinüs görüntüleme
   1. Bir oto-enjektör kullanarak 5F pigtail kateteri aracılığıyla sol ventriküle 21 mL'lik bir iyot kontrast madde bolusu uygulayın. İlk olarak, bolus süresini 3 s ve toplam hacmi 21 mL olarak ayarlayın. Ardından, Tek ve Evet tuşlarına basın.
   2. Anjiyografik iş istasyonunun ölçüm yazılımı ile ejeksiyon fraksiyonunu hesaplayın. Hesaplamayı gerçekleştirmek için, söz konusu görüntünün Ventriküler Analizi'ni seçin. Biri diyastol, diğeri sistol olmak üzere bir zaman dilimi seçmek için görüntüyü kaydırın. Her zaman diliminin ventriküler ana hatlarını çizmek için bir araç seçin.
      NOT: Yazılım şimdi Simpson'ın yöntemiyle ejeksiyon fraksiyonunu ve strok hacmini hesaplamaktadır. Ejeksiyon fraksiyonu ölçümü dinlenme sırasında ve dobutamin kaynaklı stres altında gerçekleştirilir.
6. Stres görüntüleme
   1. Dobutamin kaynaklı stres görüntüleme için 10 μg / kg / dak'dan 20 μg / kg / dak'ya yükselen dozlarda, 160 bpm hedef kalp atış hızına ulaşılana kadar intravenöz olarak doz dobutamin. Ardından, sinema görüntülemeyi gerçekleştirin.
7. İskemi operasyonu
   1. Kronik miyokard iskemisini indüklemek için gen transferinden 14 gün önce sol koroner artere (LAD) bir darboğaz stenti yerleştirin. Darboğaz stenti yerleştirildikten sonra, darboğaz stentinin doğru yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol ederek koroner kan akışını kısıtlayın.
      NOT: Darboğaz stent, bir dilatasyon kateteri üzerine yerleştirilir ve koroner kan akışını azaltmak için darboğaz şeklinde oluşturulmuş bir politetrafloroetilen tüp ile kaplanmış çıplak metal bir stentten oluşur⁹.
8. Stent boyutunun tanımlanması
   1. Anjiyografik iş istasyonundaki otomatik ölçüm yazılımını kullanarak anjiyogramdaki sol çıkan koroner arterin boyutuna göre stent boyutunu 3.0/3.5/4.0 x 8 mm olarak seçin (Video 3)¹².
9. Stent yerleştirme
   1. Sol koroner artere bir bobin yerleştirin ve darboğaz stentini LAD'ye kaydırın ve distal olarak ilk diyagonale yerleştirin.
   2. Stent-lümen oranı 1.3 olan bir in-deflatör kullanarak stentin arterdeki nominal basınca şişirin ve darboğazı yerine sabitleyin. Ek 15 saniye sonra, stenti söndürün ve ekipmanı arterden geri çekin.
      NOT: Darboğaz stentinin anjiyogram ile doğru yerleştirildiğini onaylayın.

4. PET görüntüleme

NOT: Gen transferinden bir gün önce, dinlenme ve stres ¹⁵O etiketli radyosu PET / BT taramaları yapın (hastane ortamı ve radyolojik teknisyenler gerektirir).

1. Referans görüntüleme
   1. Dinlenme ve stres görüntülemeden önce bilgisayarlı tomografi (BT) taramaları yapın. Zayıflama düzeltmesi için BT bilgilerini kullanın.
2. ¹⁵O-etiketli radyosu görüntüleme
   1. 800 MBq ¹⁵H₂O bolus kullanarak dinlenme ve stres görüntülemesi gerçekleştirin.
3. Stres görüntüleme
   1. 12 dakikalık uygun bir radyoaktif bozunmadan sonra 800 MBq ¹⁵O-su bolusu ile stres görüntülemesi yapın.
      NOT: Hiperemi, daha önce tarif edildiği gibi adenozin (200 μg / kg / dak intravenöz) ile indüklenir¹².

5. Gen transferi

1. Elektroanatomik haritalama
   1. Koroner anjiyografi ve fonksiyonel ölçümlerden (ekokardiyografi, LV sinesi görüntüleme) sonra elektroanatomik haritalamaya geçilir.
   2. Floroskopik kılavuzlukta femoral kılıf yoluyla sol ventriküle bir haritalama kateteri verin.
      NOT: Elektroanatomik haritayı oluşturmak için haritalama kateteri ile sol ventrikülün etrafında yaklaşık 100-150 nokta kaydedin.
2. Elektroanatomik haritanın bitirilmesi
   1. Sol ventrikülün daha güvenilir bir elektroanatomik haritasını sağlamak için aykırı değerleri silin.
   2. Bunu, haritanın Klip Düzlemleri'ni seçerek yapın ve ventrikül şeklini oluşturan noktalardan farklı noktaları silin. Ardından, harita görünümü için Yörüngeler'i seçin ve nokta kaydı sırasında yatay olarak hareket eden noktaları silin.
      NOT: Kalan noktaların sol ventrikülü kapladığından emin olun ve gerekirse daha fazla nokta kaydedin.
3. Gen transferi enjeksiyonları
   1. Floroskopik kılavuzluk altında femoral kılıf yoluyla sol ventriküle intramiyokardiyal enjeksiyon kateteri sokulmalıdır. Enjeksiyon iğnesi uzunluğunu 3 mm'ye ayarlayın.
4. İntramiyokardiyal enjeksiyonlar için kriterler
   1. Elektroanatomik haritalama sistemi ile gen transferlerini yönlendirin ve enjeksiyonları sol ventrikülün canlı fakat hipokinetik bölgelerine hedefleyin.
      NOT: Uygulanabilirlik için, kriter olarak 5 mV'un üzerinde tek kutuplu bir voltaj kullanın. Hipokinezi için, mümkün olduğunca düşük, en az% 12'nin altında ancak tercihen% 6'nın ^altında13 yerel doğrusal kısaltma (LLS) seçin.
5. İntramyokard enjeksiyonları
   1. 30 s boyunca, vektör materyalini seçim noktasına enjekte edin (adım 5.4) ve sol ventriküle geri akışı önlemek için geri çekilmeden önce enjeksiyon iğnesini miyokardın içinde 5 saniye daha tutun.

6. Ötenazi ve örnek toplama

NOT: Sırasıyla 3.4.1 ve 3.5.2 adımlarında açıklanan koroner anjiyografi ve ejeksiyon fraksiyonu ölçümlerinden sonra, anestezi uygulanan domuza intravenöz olarak 50 mL doymuş potasyum klorür uygulayın.

1. Kalbin perfüzyon fiksasyonu
   1. Kalbi göğüs boşluğundan toplayın. Su ile durulayın. Aort kapağının üzerine 18 G'lik bir iğne yerleştirin ve iğneyi bir perfüzyon pompasına takın. Kalbi 750 mL% 1 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin.
2. Örnek toplama
   1. Keskin bir mutfak bıçağı kullanarak kalbi 1 cm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin. Gen transfer alanından alınan örnekleri %4 PFA ve sıvı azot halinde toplayın.
      NOT: Negatif kontrolleri toplamak için, sol ventrikülün arka duvarından bir kontrol örneği toplayın.
3. Güvenli doku toplama
   1. Akciğer, karaciğer, böbrek, dalak ve yumurtalıklar gibi uzak dokulardan örnekler toplayın. Numuneleri %4 PFA ve sıvı azot içine alın.

7. Örnek depolama

1. Numuneleri boyamak üzere 4 °C'de 48 saat boyunca %4 PFA'da saklayın.
   NOT: PFA'yı günlük olarak taze bir sıvı ile değiştirin.
   1. 48 saat sonra, PFA'yı deiyonize suda% 15 sakkaroz ile değiştirin. Numuneleri parafin bloklara gömmeden önce en az 24 saat saklayın. Çıtçıtlı dondurulmuş numuneler -70 °C'de saklanır.

Sonuçlar

İskemi operasyonunun başarısı bu protokol ile koroner anjiyogram ile ve gen doğumuna geçmeden önce transtorasik ultrason ile hipokinetik alanın belirlenmesi ile doğrulanabilir (Şekil 1). Koroner oklüzyonun durumu koroner anjiyogram ile değerlendirilebilir ve elektroanatomik haritalama iskemik ve kış uykusuna yatan alanları sağlar.

Gen tedavisinin etkinliği, çevresel suş, ejeksiyon fraksiyonu ve miyokard perfüzyonu ¹⁵_H2O-PE...

Tartışmalar

Bu protokolün zaman noktaları, kullanılan viral vektöre göre değiştirilebilir. Ayrıca immünohistolojik analizler terapötik gene göre seçilebilir. Gerekirse protokole daha fazla zaman noktası ve uç nokta eklemek de mümkündür.

Bu protokol, başarılı olmak için gerekli olan ve daha sonra düzeltilmesi imkansız olan aşamalardan oluşur. İlk olarak, eğer uygun iskemi indüklenemezse, hayvan diğer prosedürlerden ve analizlerden dışlanmalıdır. Yöntemlerin ve görüntül...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
15 % sucrose	VWR	VWRC27480.294	Prepared from solid sucrose
4% PFA	VWR	VWRC28794.295	Prepared from paraformaldehyde powder
5 F pigtail catheter	Cordis	534-550S
6 F catheter AR2	Cordis	670-112-00
6 F introducer sheath	Cordis	504-606X
8 F introducer sheath	Cordis	504-608X
Acetylsalicylic acid			Varying producer
Amiodarone			Varying producer
Angiographic station	GE Healthcare
Angiolaboratory set	Mölnlycke		designed for the needs of our angiolaboratory, contains sterile drapes, cups and swabs
Bisoprolol			Varying producer
Cefuroxime			Varying producer
Clopidogrel			Varying producer
Coroflex Blue stent	B.Braun Medical	5029012	Catalog number depends on stent size
Crile forceps
Cyclotron	GE Healthcare
Dobutamine			Varying producer
Electroanatomical mapping system	Biologics Delivery Systems, Johnson & Johnson company
Enoxaparin			Varying producer
Fentanyl			Varying producer
Intramyocardial injection catheter	Johnson & Johnson
Iodine contrast agent	Iomeron
Kitchen knife			Varying producer
Lidocaine			Varying producer
Liquid nitrogen			Varying producer
MgSO4			Varying producer
Needle 18 G	Cordis	12-004943
Perfusion pump
PET-CT scanner	Siemens Healthcare
Polytetrafluoroethylene tube
Propofol			Varying producer
Scalpel no 11	VWR	SWAN0503
Sublingual dinitrate	Takeda
Ultrasound machine	Philips