Fare Beyinlerinin Serbest Yüzen İmmünasyon

Özet

Bu protokol, perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere fare beyni histolojik çalışmaları için verimli ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı açıklar.

Özet

Fare beyinlerinin immünohistokimyasal lekelenimi, enerji metabolizmasının ve diğer nörobiyolojik süreçlerin düzenlenmesinin altında kalan merkezi mekanizmaları araştırmak için sinirbilimde yaygın olarak kullanılan rutin bir tekniktir. Bununla birlikte, beyin histolojisi sonuçlarının kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği laboratuvarlar arasında değişebilir. Her boyama deneyi için, türler, dokular, hedeflenen proteinler ve reaktiflerin çalışma koşullarındaki farklılıklara göre temel prosedürleri optimize etmek gerekir. Bu makale, bu alandaki araştırmacılar tarafından kolayca takip edilebilen aort içi perfüzyon, beyin kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere güvenilir bir iş akışını ayrıntılı olarak göstermektedir.

Ayrıca, araştırmacıların bireysel ihtiyaçlarını karşılamak için bu prosedürlerin nasıl değiştirilacağı tartışılmaktadır. Bu protokolün güvenilirliğini ve verimliliğini göstermek için perineuronal ağlar, fare beyninde bir anti-AVP antikoru ile biyotin etiketli Wisteria florbunda agglutinin (WFA) ve arginin vazopressin (AVP) ile boyandı. Son olarak, tüm prosedür için kritik ayrıntılar ve bu protokolün diğer protokollere kıyasla avantajları ele alınmıştır. Birlikte ele alındığında, bu makale fare beyin dokusunun serbest yüzen immünostaining için optimize edilmiş bir protokol sunar. Bu protokolün ardından, hem genç hem de üst düzey bilim adamlarının immünostaining çalışmalarının kalitesini, güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini artırmaları için bu süreci kolaylaştırır.

Giriş

Obezite ve buna bağlı komorbiditelerin yaygınlığı salgın boyutlara ulaşmış ve muazzam bir sosyoekonomik yüke neden ^olmuştur1,2. Obeziteden sorumlu biyolojik süreçleri daha iyi anlamak için çeşitli fare modelleri ^{geliştirilmiştir3,4}. Bu hayvan modellerinde enerji homeostazının düzenlenmesi için merkezi mekanizmalar önemli olduğundan, fare beyinlerinin nöroanatomik çalışmaları bu alanda gerekli bir teknik haline gelmiştir. Bununla birlikte, beyin histolojisi tekniklerinin kalitesi, güvenilirliği ve tekrarlanabilirliği, çeşitli nedenlerle (örneğin antikor....

Protokol

Bu çalışmada her iki cinsiyette (8-16 haftalık) C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Tüm hayvanların bakımı ve tüm prosedürler Baylor College of Medicine'ın Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylandı.

1. Perfüzyon

NOT: Adım 1.1 - 1.6 duman kaputunda gerçekleştirilir.

1. Anestezi
   1. Bir kurutucunun altına yerleştirilmiş bir kağıt havluya 5 mL izofluran ( Bkz. Malzeme Masası) dökün. Fareyi kurutucunun içindeki delikli bariyere sokun ve solunum belirtileri kaybolana kadar bekleyin.
      NOT: Solunum olmadan, fare hala kısa bir süre için kalp atışına sahi....

Sonuçlar

Bu iletişim kuralının akış şeması Şekil 1'de kısaca gösterilmiştir. Bu laboratuvarın kriyoseksiyon prosedürü, 5 beyin örneğinin aynı anda bölümlerek alındığı Şekil 2A'da gösterilmiştir. Beyin bölümlerinin montajı Şekil 2B'de gösterilmiştir ve beyin bölümleri ile tamamen monte edilmiş bir slayt Şekil 2C'de gösterilmiştir. Şekil 3'te Bre.......

Tartışmalar

Bu protokol, fare beyninin perfüzyon, doku kesiti, serbest yüzen immünostaining, doku montajı ve görüntüleme dahil olmak üzere nöroanatomik çalışmaları için yerleşik bir yöntem sağlar. Ancak, tutarlı ve güvenilir sonuçlar için gerekli olan birkaç temel ayrıntı optimize edilmelidir.

Perfüzyon kalitesi başarılı boyama için kritik öneme sahiptir. Kan hücrelerinin (örneğin, kırmızı kan hücreleri) yapay bir 'pozitif' boyama üretebileceği göz önüne alındı?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21207
30% Sucrose	VWR	470302	30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS
Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128	10%, 25 °C, pH 6.8-7.2
1 mL Sub-Q Syringe	BD	309597
48 Well Cell Culture Plate	Corning	3548
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Antifading mounting media with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Autoclavable plastic desiccator	Thermo Scientific Nalgene	5315-0150
AVP antibody	Phoenix Pharmaceuticals	H-065-07
Cell Strainer	Corning	431752
Cryoprotectant buffer	User preference	Not applicable	20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS
Isoflurane	Covetrus	11695-6777-2
Leica DFC310FX microscope	Leica	Not applicable
Microscope Slide Boxes (50-place)	VWR	Not applicable
PBT	User preference	Not applicable	2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS
Perfusion two automated Perfusion System	Leica	39471005
Phosphate-buffered saline (PBS) 20x	VWR	VWRVE703-1L	25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer
Slideing Microtome Microm HM450	ThermoFisher	Microm HM450
Sodium Chloride	RICCA Chemical	7220-32	0.9%, 25 °C, pH 7.4
Streptavidin Protein, DyLight 488	ThermoFisher	#21832
Triton X-100	Sigma-Aldrich	089k01921
WFA antibody	Sigma-Aldrich	L1516
Zeiss Axio Z1 Scanner	Zeiss	Not applicable
Zen 3.1 software			scanner software