Kronik Hastalığı Olan Büyük Memeli Kardiyak Modellerinin Kontrastlı Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntülemesinde Doku Hazırlama Teknikleri

Özet

Burada, kollajen seçici kontrast artırımı ile sağlıklı ve patolojik büyük memeli tüm kalplerinin yüksek çözünürlüklü mikro bilgisayarlı tomografi görüntülerini elde etmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Yapısal yeniden yapılanma, kalbe uygulanan kronik patolojik streslerin ortak bir sonucudur. Hastalıklı dokunun mimari ve kompozisyonel özelliklerini anlamak, aritmik davranışla etkileşimlerini belirlemek için kritik öneme sahiptir. Klinik reversiyonun altında mikro ölçekli doku yeniden şekillenmesi, genç erişkinlerde yüksek prevalansı olan önemli bir ölümcül aritmi kaynağı olarak ortaya çıkmaktadır. Büyük memeli tüm kalpleri gibi klinik öncesi modeller için yeterli mikro ölçekli çözünürlükte yüksek görüntüleme kontrastı elde etmede zorluklar devam etmektedir. Ayrıca, üç boyutlu yüksek çözünürlüklü görüntüleme için doku bileşimi seçici kontrast iyileştirme hala eksiktir. Mikrobilgisayarlı tomografi ile tahribatsız görüntüleme, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için umut vaat etmektedir. Amaç, büyük biyolojik örneklerde zayıflama nedeniyle X-ışınından kaynaklanan acıyı hafifletmekti. Kalpler, sağlıklı domuzlardan (N = 2) ve koyunlardan (N = 2) ya kronik miyokard enfarktüsü ve fibrotik skar oluşumu ya da indüklenmiş kronik atriyal fibrilasyon ile ekstrakte edildi. Eksize edilmiş kalpler şunlarla perfüze edildi: bir kalsiyum iyonu söndürme ajanı ve bir vazodilatör ile desteklenmiş bir tuzlu su çözeltisi, seri dehidrasyonda etanol ve vakum altında hekzametildisilizan. İkincisi, 1 hafta boyunca hava ile kurutma sırasında kalp yapısını güçlendirdi. Kollajen dominant doku, X-ışını kontrastını arttırıcı bir ajan olan fosfomolibdik asit tarafından seçici olarak bağlandı. Doku konformasyonu havada stabildi ve uzun süreli mikrobilgisayarlı tomografi alımlarının yüksek çözünürlüklü (izotropik 20.7 μm) görüntüler elde etmesine izin verdi. Difüzyon yoluyla optimal kontrast madde yüklemesi, sağlıklı domuz ventriküllerinde epitel tabakasının ve subendokardiyal Purkinje liflerinin seçici kontrast artışı gösterdi. Atriyal fibrilasyon (AF) kalpleri, daha büyük kollajen içeriğine atfedilen atriyumun arka duvarlarında ve uzantılarında artmış kontrast birikimi gösterdi. Miyokard enfarktüsü kalpleri, kardiyak fibroz bölgelerinde seçici olarak artmış kontrast gösterdi ve bu da hayatta kalan miyokard kas liflerinin iç içe geçmesini sağladı. Kontrastlı hava ile kurutulmuş doku preparatları, bozulmamış büyük memeli kalbinin mikro ölçekte görüntülenmesini ve altta yatan hastalık bileşenlerinin seçici kontrast arttırılmasını sağlamıştır.

Giriş

Yapısal kalp hastalığı tüm dünyada kardiyak ilişkili mortalitenin çoğunluğunu oluşturmaktadır¹. Kardiyak yapının yeniden şekillendirilmesi miyokard ortamını ve interstisyel boşluğu etkiler. Hem kardiyak elektriksel hem de mekanik fonksiyon miyosit organizasyonuna bağlı olduğundan, bozulma dayanılmaz kardiyak aritmi, bozulmuş kan pompalama eylemleri ve kalp yetmezliği 2,3,4,5,6,7,8,9'a yol açabilir. Yapısal kalp hastalıklarına yönelik küratif tedavilerdeki gelişmeler, hastalık prevalansı ^2,5 ile çok daha ağır basmaktadır. Bu nedenle, kardiyak aritmilerin anatomo-morfolojik profillerini ve bunun sonucunda ortaya çıkan patogenezi daha iyi anlamak için yapısal kalp hastalıklarının klinik öncesi modellerinin sayısı giderek artmaktadır 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20^{, 21,22,23}. Yapısal hastalık spektrumunda gözlenen, interstisyel fibrozisin upregülasyonudur ve daha yaygın olarak iskemi ile ilişkili vakalarda, fibroz ve yağ dokusu ile miyokard replasmanıdır¹⁸. Patolojik hücre dışı bileşenlerin morfolojik olarak anlaşılması, aritminin potansiyel substratlarının tanımlanmasını sağlayabilir. Hastalığın dağılımı ve derecesi, aritmojenik riskin güçlü göstergelerini sağlar. Yine de, sağlam kalpteki makro ve mikro ölçekleri entegre ederek hastalık profillerini kapsamlı bir şekilde görüntülemek için zorluklar devam etmektedir.

X-ışınlarına dayanan mikro-bilgisayarlı tomografi (mikroBT), kontrast maddeler kullanarak yumuşak biyolojik doku mikroyapısını sorgulamak için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Küçük kemirgenlerden kalpler için son derece ayrıntılı anatomik haritalar 24,25,26 ve büyük memeli kalplerinden^27,28 küçük disseke örnekler elde edilmiştir. Bununla birlikte, büyük memeli kalplerinin tüm organ seviyesindeki görüntüleme, geleneksel doku hazırlama teknikleri kullanılarak X-ışını fotonlarının zayıflatıldığı aşırı yol uzunlukları gösterir. Bu, dokunun kontrast yüklenmesini ve elde etme sırasında numunenin bir kontrast madde çözücüsüne daldırılmasını içerir. Örneklem büyüklüğünün ve çözünürlüğünün arttırılması, toplam edinme süresinin uzamasını zorunlu kılar. Bu nedenle, doku stabilitesi kullanılabilir görüntü rekonstrüksiyonu için çok önemli hale gelir, bu da kurumadan kaynaklanan doku deformasyonunun önlenmesi gerektiği anlamına gelir. Bununla birlikte, bir daldırma sıvısının kullanımının dezavantajları vardır: (i) genel arka plan sinyal yoğunluğu ihmal edilemez hale gelir ve (ii) dokuya bağlı kontrast moleküllerinin seyreltilmesini teşvik eder. Bu faktörlerin her ikisi de görüntü kontrastının düşürülmesine katkıda bulunur.

Bu çalışma, arka plan foton zayıflamasını hafifletmek ve kontrast arttırıcı ajanların sağladığı dinamik aralığı optimize etmek için yeni bir doku işleme boru hattını detaylandırmaktadır. Doku deformasyonunu sınırlamak için kimyasal doku takviyesi ile doku hava kurutma yaklaşımının kullanılması önerilmektedir²⁹. Bu nedenle, doku örnekleri uzun kazanımlar için havada sabit kalabilir ve daldırma sıvılarının arka plan katkılarını atlayabilir. Bu metodoloji boru hattı şunları sağlar: (i) tüm domuz kalpleri kullanılarak optimize edilmiş kapsamlı bir doku işleme ve görüntüleme protokolü; (ii) kontrast konsantrasyonu ve yükleme tekniklerinin değerlendirilmesi ve (iii) bu boru hattının koyun kalplerinde atriyal fibrilasyon ve miyokard enfarktüsünün iki ayrı kronik hastalık modelinde uygulanması. Kronik hastalık modellerinin gelişimi, her kronik kalp hastalığı modeli, perkütan koroner arter embolizasyonunun neden olduğu miyokard enfarktüsü¹³ ve kendi kendine yeten atriyal fibrilasyon³⁰ için başka yerlerde tanımlanmıştır.

Protokol

Tüm deneyler, Avrupa Parlamentosu'nun bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Direktifi'ndeki yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Hayvan protokolleri, Bordeaux Üniversitesi'ndeki yerel etik komite (CEEA50) tarafından onaylandı. Kalpler, (i) Sağlıklı Büyük beyaz domuzlar (N = 2, 2 aylık); (ii) İndüklenmiş miyokard enfarktüsü¹³ olan koyun (N = 1, 2 yaş) ve (iii) İndüklenmiş atriyal fibrilasyonu olan Koyun (N = 1, 7 yaş)³⁰.

1. Çözelti hazırlama:

1. Kardiyoplejik çözelti: 3 L damıtılmış su hazırlayın ve sodyum klorür (110 mM), potasyum klorür (16 mM), Sodyum bikarbonat (10 mM), D-(+)-Glikoz (9 mM), kalsiyum klorür çözeltisi (1.2 mM) ve magnezyum klorür çözeltisi (16 mM) ekleyin. Sonunda, 500 μL / L heparin sodyum ekleyin. Bu çözeltiyi 4 °C'de koruyun.
2. Fosfat tamponlu salin - EDTA çözeltisi (PBS-EDTA).
   1. İlk olarak, 10 mM'lik son konsantrasyon için 1 L damıtılmış suya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin. EDTA'yı çözmek için sodyum hidroksit çözeltisi (1 M) kullanarak 12'lik bir çözelti pH'ını artırın ve koruyun.
   2. EDTA tamamen çözündükten sonra, hidroklorik asit kullanarak pH'ı 7.4'e düşürün. 0.01 M'de (sodyum klorür, 0.138 M; potasyum klorür, 0.0027 M) ve pH 7.4'te bir çözelti elde etmek için bir folyo torba fosfat tamponlu salin ekleyin. Bu çözeltiyi oda sıcaklığında (RT) koruyun.
3. Etanol - fosfomolibdik asit (PMA) kontrast madde çözeltisi: 1 L mutlak etanol hazırlayın ve konsantrasyonun% 1'inde bir çözelti elde etmek için PMA'yı ekleyin. RT'de bu çözümü koruyun.

2. Doku kaynağı

1. Hayvanı ötenazi yapın ve kalbi yerel etik kurallara göre çıkarın. Kalbi hızlı bir şekilde soğuk kardiyoplejik çözeltiye daldırın ve ilk durulama için ventriküllere hafifçe masaj yapın.
2. Aortun aort kemerinin altında kesildiğinden emin olun ve iğne tutucuları kullanarak arteriyel duvarın iki tarafını kelepçeleyin.
3. Kalbi iğne tutucularla askıya almak, aort köküne bir aort kanülü yerleştirin, aort kapakçıklarıyla temas etmemeye veya aort kapaklarından çıkıntı yapmamaya dikkat edin. Aort kemerinin etrafına kanül seviyesinde 0 gauge bir dikiş sarın ve kanülü sıkıca yerine bağlayın.
4. 50 mL şırıngalar kullanarak, 200 mL soğuk (4 ° C) kardiyoplejik çözelti enjekte edin. Pulmoner damarlardan boşalmak için kalbi arka tarafına devrederek boşluklardaki aşırı kan birikmesini giderin.
5. Durulanmış kalbi daldırın ve diseksiyona hazır olana kadar buz üzerinde saklanan soğuk kardiyoplejik çözeltide saklayın.

3. Doku hazırlığı:

1. Bir diseksiyon kabının 80 cm yukarısında desteklenen 1 L'lik bir rezervuar hazırlayın. 80 cm uzunluğunda ve 3,2 mm iç çapı ve 4,8 mm dış çapı termoplastik bir tüpü rezervuarın bir drenaj portuna bağlayın.
2. Drenaj borusuna üç yönlü bir musluğu sabitleyin ve üç yönlü musluktaki her serbest bağlantı noktasına birkaç termoplastik boru (20 cm, 1,6 mm iç çap ve 3,2 mm dış çap) ekleyin. İki yönlü muslukları borunun ücret uçlarına sabitleyin.
3. Rezervuarı heparin (2500 ünite) ile desteklenmiş kardiyoplejik çözelti ile doldurun. Kardiyoplejik çözeltinin tüm hava kabarcıklarını boşaltmasına ve çıkarmasına izin vermek için muslukları açın, ardından iki yönlü muslukları kapatın.
4. Politetrafloroetilen (PTFE) boru (1 mm iç çap ve 2 mm dış çap) kullanarak sol ve sağ koroner ostia için kanüller hazırlayın.
   1. 5 cm'lik boruyu kesin ve ucu çıplak bir alevin yanına yerleştirerek bir ucunu ısıtın. Ucun 1 mm'si erimeye başladığında ve yarı saydam hale geldiğinde, kanüllerin damarlardan kaymasını önlemek için kanül ucunda bir sırt şekillendirmek için ucu sert ısıya dayanıklı bir yüzeye bastırın.
   2. Her kanülün ısıtılmamış ucunun 1 cm'sini drenaj rezervuarı drenaj borusunun iki ucuna yerleştirin.
5. Aort kanülünü çıkarın. Soğuk kardiyoplejik çözelti altında, koroner arterlerin sol ve sağ ostiasını lokalize edin.
6. Sivri makas kullanarak, koroner damarın altında 0 G'lık bir ipek sütürün ipliklenmesini sağlamak için aort kökünü koroner ostia'nın üstündeki ve altındaki çevreleyen dokudan dikkatlice ayırın.
7. İki yönlü muslukları açın ve kanül uçlarını koroner ostia'ya yerleştirin. Kanül uçları ostia'ya 1-2 cm uzanarak ve dikiş yerleşiminin ötesinde kanülleri bağlayın.
8. Kalp kandan temizlenene kadar ventriküllere 15 dakika boyunca hafifçe masaj yaparken kalbi durulayın.
9. Duruladıktan sonra, iki yönlü muslukları kapatın ve üç yönlü musluktan ayırın. Kalbi 500 mL PBS-EDTA çözeltisi içeren 1 L plastik kimyasallara dayanıklı bir kaba aktarın.
10. PBS-EDTA çözeltisini, iki kanallı peristaltik bir pompa kullanarak bir duman davlumbazının altındaki termoplastik boruda yeniden dolaştırın. Pompa borusunu, boru hava kabarcıkları bulunmayana kadar astarlayın, daha sonra RT'de 80 mL / dak'da 2 saat boyunca devridaim yoluyla her koroner arter kanülünü perfüze edin.
11. Davlumbazın çalışır durumda olduğundan emin olun. Pompayı durdurun, çözeltiyi kaptan boşaltın ve 80 mL / dak'da RT'de 1 saat sabitlemek için formalin (% 10) ile değiştirin.
12. Fiksatifi her biri 80 mL / dak'da 15 dakika boyunca üç kez durulamak için formalin çözeltisini PBS ile değiştirin.

4. Doku dehidrasyonu ve kurutma:

NOT: Aynı perfüzyon hızını (80 mL/dak) kullanın ve dokunun RT'de kalmasına izin verin.

1. PBS çözeltisini% 20'de etanol ile değiştirin, ultra saf suda seyreltin ve en az 3 saat boyunca perfüze edin.
2. Bir dizi artan etanol konsantrasyonu kullanarak kalbi perfüze edin.
   1. % 20 etanol çözeltisini% 30'a seyreltilmiş etanol ile değiştirerek başlayın ve 2 saat boyunca perfüze edin.
   2. Her yinelemede etanol konsantrasyonunu %40, %50, %60, %65, %70, %75, %80, %95, %90, %95, %95, %99 ve %100 ile her adımda (konsantrasyon) minimum 1 saat süreyle artırarak perfüzyonu tekrarlayın.
      NOT: Kalp örnekleri, bu konsantrasyon için minimum 15 dakikalık perfüzyon gerçekleştiyse, herhangi bir etanol seyreltmesinde gece boyunca perfüzyon akışı olmadan dinlenebilir.
3. İSTEĞE BAĞLI: Perfüzyon yoluyla kontrast maddeler uygulanıyorsa, kalbi kontrast madde PMA ile desteklenmiş% 100 etanol ile, 48 saat boyunca% 1 ile perfüze edin. Kontrast maddeyi 2 saat boyunca% 100 etanol ile perfüzyon yoluyla durulayın.
4. Hava kurutmadan önce kalp dokusunu güçlendirmek için, 10 dakika boyunca 50:50 etanol ve hekzametildizilazan (HMDS) karışımını yeniden dolaştırın. Bunu 2 saat daha %100 HMDS ile takip edin.
   DİKKAT: HMDS oldukça toksik ve zararlı bir maddedir. Hava ile temas halinde güçlü bir amonyak kokusu salınır. Dahası, HMDS'nin sıvı formu oldukça uçucudur ve iyot içeren ajanlar tarafından katalize edilir.
5. Kanülleri borudan ayırın ve kalbi duman başlığının içindeki bir aort sütüründen askıya alın.
6. Fermuarlı bir torbayı kalbin üzerine dikkatlice kaydırın ve kalbin dolaşımdaki havaya maruz kalmasını azaltmak için torba contasını dikişin üzerine kapatın. Kalbin 1 hafta boyunca buharlaşma yoluyla kurumasına izin verin.
7. İSTEĞE BAĞLI: Difüzyon yüklü kontrast maddeler için, çalkalama sırasında kalbi 15 dakika boyunca% 100 etanol içinde yıkayın. Kalbi vakum altında 48 saat boyunca PMA ile% 1 ile desteklenmiş% 100 etanol içine batırın. 4.6 adımını yineleyin.

5. MikroCT:

NOT: Domuz kalplerini görüntülemek için bir masaüstü X-ışını mikroBT sistemi kullanılmıştır.

1. Hava ile kurutulmuş kalbi uygun bir numune tutucuya monte edin. Numune tutucuya tutturulmuş bir kelepçe kullanarak X-ışını mikroBT ölçümleri sırasında herhangi bir hareketi önleyin ve kalbi kurutulmuş ve sert aort yoluyla sabitleyin.
2. Kalp örneğinin merkezini uzunlamasına ekseni boyunca 0° ve 90° dönüş açıları için görüntüleme görüş alanının merkezi ile titizlikle hizalayın. Bunu tüm yönlerde başarmak için, kalbi numune desteğine sabitlenmiş bir aort kelepçesi ile havada askıya alın.
3. Yazılımı açtıktan ve X-ışını microCT sistemini başlattıktan sonra, X-ışını filtresi alüminyumunu, 1 mm, X-ışını kaynak voltajını 60 kV'a ve akımı 120 μA'ya uygulayın. görüntü boyutlarını 2016 x 1344 piksel ve piksel boyutunu 20 μm olarak ayarlayın.
4. Numune tutucuyu görüş alanının dışına geri çekin ve düz alan düzeltmesi elde ederek arka plan görüntüsünü ve X-ışını pozlama süresini kalibre edin. Ortalama arka plan X-ışını iletiminin% 80'den fazla olduğundan emin olun.
5. Kalbin uzunlamasına eksenindeki genel görüntüleme alanını belirlemek için desteğin uzunluğu boyunca X-ışını iletim görüntülerini izleyin. Tarama için 0,18°'lik bir döndürme adımı, ortalama 5'lik bir çerçeve ve 180°'lik bir örnek dönüşü kullanın. Örnek desteğinin tam genişliğini görüntülemek için ofset tarama modunu seçin.
   NOT: Bu bölümde belirtilen edinme parametreleri, topluluk kalp kompozisyonunun görüntü kalitesini optimize etmek için seçilmiştir.
6. Taradıktan sonra, izotropik üç boyutlu görüntü hacminin tomografik rekonstrüksiyonu için yazılımı kullanın. NRecon yazılımının uygulanması için, %10'luk ışın sertleştirme etkileri ve 8'lik halka artefakt azaltma dahil olmak üzere edinimle ilgili artefakt düzeltmesini kullanın.
7. Veri depolama sınırlamalarını optimize etmek için, kalbe özgü görüntü voksellerini kapsayan minimum dikdörtgen ilgi alanını uygulayın. Görüntüleri 8 bit bitmap formatında görüntü yığını olarak dışa aktarın.
8. DataViewer yazılımını kullanarak yeniden oluşturulan veri yığınını görselleştirin. Numunenin uzun ve kısa eksenlerini görüntü hacminin üç ana ekseniyle yeniden hizalamak için numuneyi görüntü sınırları içinde dijital olarak yönlendirin.
9. Toplam görüntü boyutunu en üst düzeye çıkarmak üzere görüntünün dış arka plan katmanlarını kaldırmak için görüntü hacmini üç eksende de kırpın.

Sonuçlar

Dehidrasyon ve hava kurutma yöntemi kullanılarak büyük memeli kalplerinin hazırlanması, numunedeki tüm su içeriğini giderir. HMDS yüklemesi sırasında etanol ile yetersiz su değişimine dair kanıtlar gözlemlenebilir (bakınız Protokol, adım 4.4). HMDS altındaki suyun varlığı, dokudan yükselen kabarcıklar yaratacaktır. Aşırı su seviyeleri durumunda, daldırma sıvısının sıcaklığında bir artış meydana gelebilir. İlk HMDS yüklemesi sırasında daldırma odasını buzla çevrili tutmak, doku ısıtmasının kötü etkilerini azaltabilir. Kontrast maddelerin yokluğunda kalpleri hava ile kuruttuktan sonra, numune beyaz renkte görünecektir (bkz. Protokol, adım 4.6). Dış yüzey sıklıkla intramural tabakalardan önce kurutuldu ve yapısal olarak stabildi. Kontrast madde yüklemeden önce etanolde durulama, beyaz birikintisini ortadan kaldırmıştır (bkz. Protokol, adım 4.7). Keskin bir bıçak kullanarak dokuyu dilimlemek, makroskopik olarak bireysel kas liflerini net bir şekilde ayırarak ortaya çıkarır. Kalp örneklerini kontrast madde ortamına batırarak kontrast yüklemesi, numunenin kalın ve yüksek kaslı bölgelerindeki difüzyon limitli eserlerden muzdaripti. Vakum altında difüzyon kontrast yüklemesi kaslarda daha homojen renklenme sağlamıştır (kalp örneği #1, kontrast madde yükleme süreleri için Tablo 1'e bakınız). Makroskopik olarak, yüzey kontrast madde dağılımı, kalp kası ile esas olarak hücre dışı bileşenlerden, özellikle yağ ve bağ dokusundan oluşan bölgeler arasında homojen bir lekelenme gösterdi. Kontrast madde yüklenmesinden önce veya sonra hava ile kurutulmuş doku örnekleri, stabil yapısal bütünlüğü korudu.

Yukarıda belirtilen tarama parametrelerini kullanarak numunenin tam genişliğini mikroCT altında 20 μm çözünürlükte taramak için gereken süre ve 1700 ms'lik bir maruz kalma süresi 6 saat 34 dak idi. Tarayıcının portal eksenindeki numunenin boyutuna bağlı olarak, bu süre numunenin tam uzunluğunu yakalamak için gereken pozisyon sayısı ile çarpıldı. Bu çalışmada domuz ve koyun kalpleri için üç ila dört pozisyon kullanılmıştır. NRecon yazılımı, X-ışını kaynağının ve dedektörünün her dönüş adımı için tek bir X-ışını projeksiyon görüntüsü oluşturmak üzere çok konumlu ve ofset taramalarını döşedi. Toplamda, 1000 projeksiyon 16 bit görüntüler olarak depolanır ve 30-40 GB veri üretir. Yeniden yapılandırılmış hacimsel görüntüler 52-70 GB idi.

Ventrikül boşlukları, septum ve ventriküllerin serbest duvarları da dahil olmak üzere başlıca anatomik yer işaretleri, difüzyon yüklemesi ile kontrast madde ile boyanmış hava ile kurutulmuş domuz kalplerinin X-ışını iletimi görüntülemesinden kolayca tanımlanabilir (Şekil 1A). Ayrıca, miyokard lifi oryantasyonu gibi mikroyapısal organizasyonu gösteren yüksek dokulu bölgeler de hassas X-ışını zayıflaması/iletimi nedeniyle gözlenmiştir (Şekil 1B). Üç boyutlu görüntü hacimlerinin tomografik rekonstrüksiyonları, hem epikardiyal hem de endotel sınırlarında doku ve arka plan arasında belirgin bir ayrım göstermiştir (Şekil 1D). İntramural olarak, düşük kontrast ve voksel yoğunluklu difüzyon gradyanı dokunun kalın transmural bölgelerinde gözlendi. Buna rağmen, bölünme düzlemleri ile ayrılan vaskülatür ve miyokard lifleri hala kolayca tanımlanabilirdi. Epikardial-en tabakada ve punktat sub-endokardiyal bölgelerde ikinci bir yüksek yoğunluklu kontrast bant genişliği gözlendi. Kontrast arttırımı, hücre dışı bileşenlerin, özellikle epikardiyal bağ dokusunun, epikardiyal yağın ve Purkinje fiber ağının bağ dokusu kılıfının biriktiği bölgelerde en büyüktü. Voksel sinyal yoğunluğu dağılımları, sıfır yoğunluklu arka plandan (hava) ve düşük ve yüksek kontrastlı dokunun iki baskın popülasyonundan yüksek ayrılık gösterdi (Şekil 1D).

MikroBT görüntü rekonstrüksiyonlarının kontrast arttırımını ve kalp örneklerinin kollajenöz bölmelerine seçiciliğini doğrulamak için histoloji, parlak alan mikroskobu ve floresan mikroskopi kullanıldı (Şekil 2). Parafin gömme ve kesitleme için önceden kontrast madde yüklemesi yapılmadan hava ile kurutulmuş bir kalpten transmural bir ventriküler doku bloğu hazırlandı. Mikroskop slaytlarına monte edilen bitişik doku dilimleri ya Masson'un trikrom boyaması, tedavi edilmemesi ya da 48 saat PMA (% 1) ile tedavi edildi. Slayta monte edilmiş doku kesitlerinin daldırılması, tüm kalp örneklerinde gözlenen boyama işleminin difüzyon gradyanı etkilerini ortadan kaldırdı. Mason'un trikrom boyaması, epitel ve endotel tabakalarında, perivasküler olarak subepikardiyal dokuda kollajen pozitif boyanma ve sol ventrikül boşluğuna çıkıntı yapan serbest çalışan bir Purkinje lifini çevreleyen bir bağ dokusu kılıfı gösterdi (Şekil 2A). Parlak alan aydınlatması, PMA boyaması sonrası kollajenöz yapılarda daha koyu renklenme göstererek PMA'nın tercihli birikimini desteklemiştir (Şekil 2B,C). Ayrıca, PMA tedavisinin daha önce kollajen makromoleküler komplekslerinin otofloresansını söndürdüğü gösterilmiştir³¹. Ventriküler doku kesitlerinin floresan görüntülerinde kollajen bölgelerinde PMA kaynaklı floresan kaybı vardı (Şekil 2D'ye karşı 2E, Şekil 2D'ye karşı 2E' ve Şekil 2D'ye karşı 2E'). Hem parlak alan hem de floresan görüntülemede, hücresel bölmeler PMA tedavisi ile değiştirilmedi ve kollajen, PMA boyama ve otofloresanın söndürülmesinin seçici bir birikimine sahipti.

Kalp örneği #2, hava kurutmadan önce perfüzyon yoluyla kontrast madde ile boyandı. Görüntü rekonstrüksiyonunda miyokard kompartmanı içinde oldukça yamalı boyanma saptandı (Şekil 3A). Kontrast arttırımı, epikardiyal veya sub-endokardiyal bölgelerde sinyal yoğunluğunun daha fazla artmamasıyla, doku kompozisyonunun seçici olmadığı ortaya çıktı. Ayrıca, düşük kontrastlı doku, arka plan yoğunluğundan zayıf bir şekilde ayrıldığını göstermiştir (Şekil 3B).

Ventriküler fibrozis miyokard enfarktüsü ve kronik iskemi ile indüklendi (Kalp örneği #3). Anteroapikal bir skar, miyositlerin vasküler embolizasyon bölgesine kadar olan dokudaki fibro-yağ birikintileri ile değiştirilmesiyle oluşmuştur. Kalp örneği #3 hazırlandı ve anterior sol ventrikül, septum ve sağ ventrikülsüz duvarı kaplayan disseke edilmiş bir ventriküler kama ile görüntülendi. Bu ventriküler kama konfigürasyonunun hazırlanması daha önce³² olarak tanımlanmış ve kardiyak görüntüleme için kama uygulaması ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir³³. Skar morfolojisi transmural fakat heterojendi (Şekil 4). Santral yoğun fibrotik lezyon gevşek ve heterojen bir sınır bölgesi ile çevriliydi (Şekil 4A). Ventriküler preparat, hava kurutması sonrası difüzyon yüklemeli ve vakumda boyandı. Şekil 4B-E, doku sınırlarında ve skar bölgelerinde yeniden yapılandırılmış mikroBT görüntü hacimlerinin en büyük sinyal yoğunluklarını göstermektedir. Kontrast maddeler sağlıklı miyokardın kötü boyanmasına rağmen mikroyapısal kontrast korunmuştur (Şekil 4C'). Sınır bölgesinde, skar dokusu hayatta kalan miyokard ile serpiştirildi (Şekil 4D'). Yoğun fibrozis transmural fakat dokulu olarak ortaya çıktı ve kompozisyondaki varyansları gösterdi (Şekil 4E'). Hava ile kurutulmuş ve PMA boyalı doku preparatının transmural sol ventrikül bölgesinin doku kesitleri, Masson'un trikrom boyaması ile karşılaştırılarak patolojik dokudaki kollajen için PMA seçiciliğini doğrulamak için kullanıldı (Şekil 4F). PMA boyaması kollajen (sub-epikard ve sub-endokard) için seçiciydi ve hayatta kalan miyokard bölgelerinde yoktu (Şekil 4G).

İndüklenmiş kalıcı atriyal fibrilasyona sahip kalp örneği #4, atriyal boşluğun doğal şeklini korurken hava ile kurutuldu. Atriyal apendiks kollapsı gözlenmedi. Başlıca anatomik işaretler morfolojik olarak yeniden yapılandırılmış görüntülerden (atriyal septum, pektinat kasları, koroner sinüs, pulmoner ven ostia, vena kava ve kristae terminalleri) tanımlanabilir. Vakum altında difüzyon boyaması, aort kökü ve atriyoventriküler kapaklarda ve çalışan miyokardın ayrık bölgelerinde kontrast artışı ile sonuçlandı. Kas boyama güçlendirmesi hem sol hem de sağ atriyumun atriyal ekleri ve arka duvarları ile sınırlıydı (Şekil 5).

Şekil 1: PMA kontrast maddesi ile muamele edilmiş hava ile kurutulmuş domuz kalbinin vakum altında difüzyon yoluyla mikroBT görüntülemesi . (A) X-ışını projeksiyon görüntüsü. (B) A. (C) Tomografik olarak yeniden yapılandırılmış üç boyutlu bir hacimden ventriküllerin kısa eksenli diliminde kırmızı çizgiden çıkarılan bir iletim profili. Sarı oklar, sub-endokardiyal Purkinje liflerine atfedilen noktasal kontrast bölgelerini gösterir. Mavi oklar vaskülatürü gösterir. (D) C. LV: SOL VENTRIKÜL ve RV: sağ ventrikülde gösterilen yeniden yapılandırılmış görüntü diliminin sinyal yoğunluğu dağılımı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kollajen için PMA seçiciliğinin doğrulanması . (A) Masson'un hava ile kurutulmuş bir kalbin ventriküllerinden bir transmural doku bölümünün trikrom boyaması. Miyokard kırmızıya boyanır ve kollajen yeşil renklenme ile gösterilir. Boyama olmayan bitişik doku kesitleri (B) veya PMA ile boyanmış (C) (%1), renklenmenin homojenliğini değerlendirmek için parlak alan aydınlatması ile görüntülendi. (D) Boyama bulunmayan doku kesitleri veya (E) PMA ile boyanmış olgular floresan mikroskopi ile görüntülenmiştir. D ' (düz kırmızı kutu) ve E' (kesikli kırmızı kutu) panelleri, lekesiz ve PMA lekeli bölümler için alt epikardın genişletilmiş görünümleridir. D '' (düz mavi kutu) ve E '' (kesikli mavi kutu) panelleri, sub-endokardın ve serbest çalışan bir Purkinje lifinin genişletilmiş görünümlerine karşılık gelir. Oklar, kolajen içeriği olan siteleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Hava kurutma ve MicroCT görüntülemeden önce PMA'nın perfüzyon yüklemesi . (A) Bir domuz kalbinden ventriküllerin yeniden yapılandırılmış görüntü hacminin kısa eksenli bir dilimi. Mavi oklar vaskülatürü gösterir. (B) Görüntü diliminin panel A'dan sinyal yoğunluğu dağılımı. LV: sol ventrikül ve RV: sağ ventrikül. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Kronik miyokard enfarktüsü geçiren bir koyun kalbinin mikroBT görüntülemesi. (A) Apikal bölgede yoğun bir yara izi oluştu (bkz. Apikal bölgenin endokardiyal perspektiften hacimsel olarak oluşturulmasına görüntü yoğunluğuna göre renklendirme atandı (skar dokusuna karşılık gelen kırmızı ve yeşil renkte miyokard). Gri tonlamalı yoğunluğun ortogonal dilimleri, yoğun skar dağılımını ve hayatta kalan miyokardın sınırlanmasını gösterir. Fibrotik doku ve miyokard arasındaki ayrım, yağ dokusunun bölgelerine karşılık gelir. (B) Miyokard enfarktüsünü takiben apikal skarlaşması olan bir koyundan hava ile kurutulmuş ventriküler kama preparatının bir fotoğrafı. Yeniden yapılandırılmış mikroBT görüntü hacminin eğik dilimleri, ventrikülleri baz ile tepe arasındaki orta seviyede ve (C) vasküler oklüzyon (B panelinde C- kırmızı çizgi), (D) yoğun skar ve sağlıklı miyokardın sınırlandığı peri-enfarkt bölgesi (B panelinde D- mavi çizgi) ve (E) yoğun fibroz bölgesi (B panelinde E - yeşil çizgi) bölgesine doğru çaprazlar. (C') Septal bölgenin genişletilmiş görünümü, C'de kırmızı kesikli bir kutu ile özetlenmiştir. (D') Sağ ventrikül tepesindeki enfarktüs bölgesinin genişletilmiş görünümü (panel D'de mavi kesikli kutu). (E') Sol ventrikül tepesindeki enfarktüs bölgesinin genişletilmiş bir görünümü (panel E'deki yeşil kesikli kutu). LV: Sol ventrikül boşluğu; RV: sağ ventrikül boşluğu; MB: moderatör grubu; Pap: papiller kas. Sarı ok, sol ön inen arteri gösterir. (F) Masson'un PMA boyalı hava ile kurutulmuş sol ventrikülden kesilmiş histolojik bir kesitin trikrom boyaması. Kollajen maviye, miyokard pembe/mora lekelidir. (G) PMA boyama dağılımının karşılık gelen doku kesiti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Kronik indüklenen atriyal fibrilasyonu takiben koyun kalbinin mikroBT görüntüsü. (A) Şekil 4A'da olduğu gibi renklendirme atanmış atriyumun hacimsel olarak oluşturulması. (B) Kalbin uzun ekseninde biatriyal mikroBT görüntü dilimi. Kısa eksenli dilimler (C) atriyoventriküler kapaklar (B panelinde C- kırmızı çizgi), (D) aort kökü (B panelinde D- mavi çizgi) ve (E) sol atriyal çatı (E- yeşil çizgi panel B) seviyesinde ekstrakte edildi. LA: sol atriyum; RA: sağ atriyum; LAA: sol atriyal apendiks; RAA: sağ atriyal apendiks; LV: sol ventrikül; RV: sağ ventrikül; LVOT: sol ventrikül çıkış yolu; RVOT: sağ ventrikül çıkış yolu ve PA: pulmoner arter. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek #	1	2	3	4
Tür	Domuz	Domuz	Koyun	Koyun
Vücut ağırlığı (kg)	32.4	31.2	47.2	53.4
Kalp ağırlığı (g)	191.2	186.2	202.4	207.6
Patoloji	-	-	Kronik MI	Kronik AF
Numune hazırlama	Bütün kalp	Bütün kalp	Ön kalbin kama	Bütün kalp
Kontrast yükleme modu	Difüzyon	Perfüzyon	Difüzyon	Difüzyon
Kontrast madde maruziyeti (h)	48	24	48	48

Tablo 1: Kalp örnekleri ve kontrast madde tedavisi.

Tartışmalar

Büyük doku preparatları için ayrıntılı bir protokol, daha sonraki yüksek çözünürlüklü yapısal görüntüleme için büyük memelilerden gelen tüm kalpler kullanılarak hazırlanmıştır. Hava ile kurutma yaklaşımı, arka plan X-ışını zayıflamasının etkilerini ortadan kaldırdı ve dokuyu maksimum derecede optimize etti: arka plan kontrastı²⁹. Bu yaklaşım kullanılarak, çapı 7,2 cm'ye kadar olan numunelerde hacimsel görüntüleme için 20 μm aralığında izotropik çözünürlük elde edildi. Bununla birlikte, yumuşak dokunun mikroBT'si tipik olarak X-ışını emilimini ve mikroBT sistemlerinin duyarlılığını iyileştirmek için spesifik olmayan kontrast maddelerin kullanımına dayanır³⁴. X-ışını kontrast ajanları genel X-ışını zayıflamasını ve yumuşak doku görüntüleme iyileştirmesini iyileştirse de, doku bileşenlerinin biyokimyasal bileşime göre ayrılması zor olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, laboratuvar ortamında yaygın bir X-ışını kontrast maddesi olan PMA ile kombinasyon halinde hava ile kurutulmuş kalplerin kullanılmasının, seçici olarak hücre dışı bileşenleri boyadığı gözlenmiştir. Sağlıklı miyokard ile ilişkili bağ dokusu ve kronik hastalıklarda patolojik yapısal düzelme geliştirilmiştir.

Biyolojik dokunun hava ile kurutulması işlemi, numunenin deformasyonuna direnmek için bir müdahale gerektirir. Elektron mikroskobu için numune hazırlama da benzer gereksinimlere sahiptir. Tipik olarak, dokunun sıvı içeriğinin yüzey gerilimini ortadan kaldırmak için doku daldırma ortamı, sıcaklık ve basınç dengesini kullanan kritik noktalı bir kurutma yöntemi kullanılır, bu da buharlaşma üzerine moleküler düzeyde deformasyona neden olur³⁵. Bu yaklaşım, numunenin su içeriğinin, küçük ve kolayca yayılabilir numunelerde daha güvenilir olan sıvı karbondioksit ile eşit şekilde değiştirilmesini gerektirir. Alternatif olarak, dokunun yapısal bütünlüğü iyileştirilebilir ve hava ile kurutma, yani buharlaşma aşaması, genel deformasyonu azaltmak için daha uzun bir süre boyunca uygulanabilir. HMDS molekülü, doku örneğinin moleküler organizasyonunu güçlendirmek ve stabilize etmek için silikon bazlı bir iskele oluşturmak üzere sililasyona tabi tutulur³⁶. Evaporasyon, özellikle numune yüzeyi ve intramural tabakalar arasında homojen olmayan buharlaşmayı önlemek için ortamdan dolaşımdaki hava akımlarını sınırlayarak daha da uzatılır.

Daha önce yumuşak dokuların mikroBT görüntülemesinde çok sayıda kontrast madde kullanılmıştır. En yaygın olanları iyot, fosfotungstik asit (PTA) ve PMA'dır. İyot özellikle daha yüksek difüzyon oranı^34,37,38 nedeniyle kullanılmıştır. Bununla birlikte, iyot, HMDS reaktifi^36'nın sililasyonu için bir katalizör görevi görür. Katalizörlü reaksiyon agresif ve ekzotermiktir, numunenin tahrip olma riski yüksektir ve numunenin eksik kurutulması nedeniyle artık HMDS kalırsa güvenlik riski yüksektir. Etanol içinde çözünmüş hem PTA hem de PMA, HMDS ile birlikte güvenle kullanılabilir. PTA ve PMA'nın, iyot boyama³⁸ ile karşılaştırıldığında, mineralize olmayan intervertebral disklerdeki ince yapıların daha fazla çözme gücü sağladığı gösterilmiştir. Memeli örneklerinin mikroBT görüntülemesinde, PTA ve PMA, fare embriyolarını³⁹, fare kardiyovasküler sistemini³⁷, tavşan kası ve beynini⁴⁰ ve domuz damarlarını⁴¹ boyamak için kullanılmıştır. PTA, PMA'dan daha yüksek bir moleküler kütleye ve çözelti yoğunluğuna sahiptir. Bu kısmen, PTA'daki başlıca zayıflatıcı element olan tungstenin daha yüksek atomik kütlesinden (atom numarası 74 g / mol'dür) kaynaklanmaktadır. Buna karşılık, PMA'daki en ağır element olan molibden, 42 g / mol'lük bir atom numarasına sahiptir. Hem atomik kütle hem de numune yoğunluğu, numune kalınlığı^42'ye ek olarak X-ışını zayıflamasının altında yatmaktadır. Numune boyutlarını artırarak X-ışını yolu uzunluğunu artıran X-ışını zayıflaması, artan numune yoğunluğuna karşı daha hassas hale gelir. Bu nedenle, aşırı zayıflama riskini azaltmak ve insan benzeri ölçekteki kalpler için dinamik görüntü kontrastı aralığını optimize etmek için düşük yoğunluklu PMA kontrast maddesi seçildi. Daha fazla kanıt, PMA'nın difüzyon yüklemesinin, kalp dokusundaki daha büyük molekül PTA'dan daha homojen boyama sağladığını göstermiştir⁴³.

Kontrast madde verme yöntemi, kalp dokusundaki kontrast madde dağılımının homojenliğini etkiler (Şekil 3). Etanol dehidrate kalpte kontrast maddelerin perfüzyonu, değişken vasküler direnç nedeniyle PMA'nın yamalı arka plan boyama seviyelerini gösterdi. Hava ile kurutulmuş kalpte, kas laminer yapısı, kas laminer ayrımını artıran numune kuruma işlemi ile vurgulanır. Bu sonuçta, difüzyon bazlı kontrast madde yüklemesi için dokunun genel geçirgenliğini arttırdı. Sonuç olarak, hava kuruması dokuyu kolaylaştırdı: laminer ve laminar iç seviyelerde hava kontrastı (Şekil 4). Ayrıca, difüzyon yüklemesi vakum altında uygulama ile daha da kolaylaştırılabilir. Ayrıca, kurutulmamış numunelerin doku büzülmesinin kontrast madde konsantrasyonuna bağlı olduğu gösterilmiştir⁴⁰. Bununla birlikte, numunenin hava kurutmayla önceden morfolojik stabilizasyonu, doku büzülme etkilerini inhibe eder²⁹.

Tüm organların yüksek çözünürlüklü mikroBT görüntüleri doğal olarak büyük veri hacimleri üretir. Tomografik görüntüleme tekniklerinin doğası, bilgisayar işleme ve bellek yükünü hafifleten dilim bazında görselleştirme ve görüntü işlemeyi mümkün kılar. Bununla birlikte, üç boyutlu görüntü yığınlarını görselleştirmek için, örneğin, örnek hacimlerini üç boyutlu gösterimlerde işlemek için, önerilen minimum bilgisayar özellikleri 128 GB RAM ve 3 GHz işlemci hızıdır.

Kardiyak alanda mikroBT görüntülemenin ortaya çıkması, translasyonel çalışmalar ve klinik validasyon için sayısız avantaj sağlamaktadır. Üç boyutlu ve mikrometrik görüntülemenin avantajları, ST elevasyonlu miyokard iskemisi hastalarının trombotik yükünün belirlenmesinde uygulamaları göstermiştir^44,45. Yapısal kalp hastalığı hastalarında potansiyel aritmi kaynaklarının haritalandırılması, büyük ölçüde fibrotik skar dokusunun dağılımının belirlenmesine ve hayatta kalan miyokardın iç içe geçmiş izlerinin lokalize edilmesine bağlıdır. Ventriküler aritmilerin tanısında ikinci basamak yaklaşımlarda manyetik rezonans görüntüleme^{46 kullanılmaktadır}. Yoğun fibrozisi sağlam bir şekilde lokalize edebilir, ancak düşük çözünürlüklü morfolojik karakterizasyon ile sınırlıdır ve fibrotik lezyonların mikroyapısal yeniden şekillenmesi ve diffüz dağılımları hakkında sınırlı bir fikir verir⁴⁷. Skar dağılımı ve karakterizasyonunun yüksek çözünürlüklü incelenmesi, kardiyak yapısal yeniden yapılanma ve kalp yetmezliği gelişme riski hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Özellikle, temel araştırma çalışmaları veya ölüm sonrası araştırmalar, kardiyak aritminin elektriksel haritalanması için doğrulayıcı yapısal görüntülerden yararlanacaktır.

Sonuç olarak, HMDS tedavisi ve hava kurutma ile güçlendirilmiş kalpler daha sonra hücre dışı bileşenlerin X-ışını zayıflamasını arttırmak için bir X-ışını kontrast maddesi ile boyanabilir. Spesifik olarak, sağlıklı miyokardda, PMA birikimi epitelde, kapak dokusunda ve bağ dokusu tarafından kaplanmış ventriküler iletim sisteminin bölmelerinde meydana gelir ve X-ışını zayıflamasının artmasına neden olur. Ayrıca, yapısal olarak hastalıklı miyokardda, artmış kontrast fibroz için daha seçiciydi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% neutral buffered formalin	Diapath	F0043
Calcium chloride solution	Honeywell	21114
Canulation Tubing PTFE	VWR	DENE3400102
Constant Head 1L Reservoir	Harvard Apparatus	50-0496
D-(+)-Glucose	Sigma	G5767
Ethanol absolute	VWR	20821.330
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	796881
Heparin sodium (5000 U/mL)	Panpharma	3400891287301.
Hexamethyldisilazane (HMDS)	Sigma	440191-1L
Hydrochloric acid, ACS reagent, 37%	Sigma	258148
Magnesium chloride solution	Honeywell	63020
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5368
Phosphomolybdic acid hydrate	Fisher Scientific	417895000
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Pump Tubing, 3-Stop	Ismatec	FV-96328-48
SkyScan, 1276	Bruker		micro CT
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761
Sodium Chloride	Sigma	S3014
Sodium hydroxide solution 50% in H2O	Sigma	415413
Tube Connector Kits	Harvard Apparatus	72-1407
Tubing pump	Ismatec	ISM 1089
Tubing Tygon R-3603 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm	VWR	228-1279
Tubing Tygon R-3603 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm	VWR	228-1283
Two-part single-use syringes 50 mL	Norm-Ject	4850001000	Pyrogen-free, PVC-free