Multipleks In Situ Hibridizasyonu Kullanan Fare Vagal Afferent Nöronlarında G Protein Bağlantılı Reseptör ekspresyonunun tespiti

Özet

Multipleks in situ hibridizasyon (ISH), yetişkin farenin tüm vagal gangliyonik kompleksinde iki G protein bağlantılı reseptör ve bir transkripsiyon faktörü için transkriptleri aynı anda görselleştirmek için kullanıldı. Bu protokol, vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmak için kullanılabilir.

Özet

Bu çalışmada, fare juguler-nodose gangliyonunun multipleks in situ hibridizasyonu (ISH) için bir protokol açıklanmaktadır ve özellikle G protein bağlantılı reseptörlerin (GPCR) ekspresyonunu tespit etmeye vurgulanmaktadır. Formalin-sabit juguler-nodose gangliyonları, iki temsili GPCR'nin (kolesistokin ve ghrelin reseptörleri) ifadesini nodose (eşleştirilmiş homeobox 2b, Phox2b) veya juguler afferent nöronların (PR etki alanı çinko parmak proteini 12, Prdm12) bir işaret geni ile birlikte aynı anda tespit etmek için RNAscope teknolojisi ile işlendi. Etiketli gangliyonlar, yukarıda belirtilen transkriptlerin dağılım ve ifade kalıplarını belirlemek için konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülenmiştir. Kısaca, Phox2b afferent nöronların kolesistokinin reseptörü (Cck1r) bolca ifade edildiği, ancak ghrelin reseptörü (Ghsr) ifade etmediği bulunmuştur. Prdm12 afferent nöronlarının küçük bir alt kümesinin de Ghsr ve/veya Cck1r'i ifade ettiği bulunmuştur. Bu makalede açıklanan yaklaşım, bilim adamlarının vagal afferent nöronların transkripsiyon profillerinin doğru haritalarını oluşturmalarına yardımcı olabilir.

Giriş

Vagal afferentlerin hücre gövdeleri juguler, petrosal ve nodose gangliyon¹,^2,3'te bulunur. Aksonları vagus sinirinin birkaç dalı aracılığıyla kraniyoserikal, torasik ve abdominal bölgelere birlikte seyahat eder^4,5,6,7. İçsel uçlarından, vagal afferentler çok çeşitli fizyolojik ve zararlı uyaranlara yanıt verebilir^8,9,10. Bununla birlikte, vagal alg....

Protokol

NOT: Bu çalışmada kullanılan fareler saf C57BL/6J arka plan üzerinde vahşi tip erkeklerdi. Multipleks ISH için toplam 4 fare kullanıldı. Tüm fareler kurban sırasında yaklaşık 8 haftalıktı. Yaşlanma ile ilişkili endojen floresan göstermek için bir erkek fare (yaklaşık bir yaşında) da kullanılmıştır. Hayvanlar, yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan bir bariyer tesisi içinde havalandırmalı kafeslerde barındırıldı. UT Southwestern Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi aşağıda açıklanan prosedürleri gözden geçirdi ve onayladı. Reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar Malzeme Tablosu 'ndabulunabilir.

1.....

Sonuçlar

RNAScope herhangi bir yaştan, cinsiyette veya genetik kökenden hayvanlara uygulanabilirken, genç yetişkinlerle (<3 aylık) çalışmanız önerilir. Bunun nedeni, floresan eserlerin (örneğin lipofuscin) yaşlı hayvanların nöronlarında yaygın bulgular olmasıdır⁴¹. Yaşlı farelerden formalin-sabit gangliyon genellikle kolayca gerçek boyama ile karıştırılabilecek şaşırtıcı derecede yoğun endojen floresan içerir (Şekil 1A,B). He.......

Tartışmalar

ISH tekniği 1960'ların sonunda icat edildi⁴². Ancak, 1980'lerin ortalarına kadar merkezi ve periferik sinir sistemlerinde mRNA'ların tespiti için uygulanmadı^43,44. Sinir sisteminin heterojenliği ve antikorlarla ilgili tekrarlayan sorunlar göz önüne alındığında, belirli bir transkriptin hücresel düzeyde lokalize edilmesi paha biçilmez bir araç olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, geleneksel ISH yöntemleri zahmetli v.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	Fisher Scientific	BP399-4
20x SSC	Invitrogen	AM9763
-80°C freezer	PHCBI	MDF-DU901VHA-PA
Adobe Photoshop 2021	Adobe		photo and design software
Baking oven	Thermo Scientific	Model:658
Confocal microscope	Zeiss	LSM880 Airyscan
Cover glass	Brain Research Laboratories	2460-1.5D
Cryostat	Leica	CM 3050 S
Dumont #5 Forceps	F.S.T.	11252-20
Ecomount	Biocare Medical	EM 897L	mounting medium
HybEZ oven			hybridization oven
Hydrophobic pen	Vector Laboratories	H-4000
ImageJ-Fiji	NIH
Large scissors	Henry Schein	100-7561
Micro centrifuge tubes	VWR	20170-333
Minipump variable flow	Fisher Scientific	13-876-1
Opal 520	Akoya biosciences	FP1 1487001KT	Fluorescent biomarker
Opal 570	Akoya biosciences	FP1 1488001KT	Fluorescent biomarker
Opal 690	Akoya biosciences	FP1 1497001KT	Fluorescent biomarker
ProLong Gold Antifade Mountant			mounting medium for fluorescently labeled cells
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2	ACD /Bio-Techne	323100	multiplex kit
RNAscope probe Mouse Cck1r-C3	ACD /Bio-Techne	313751-C3
RNAscope probe Mouse DapB	ACD /Bio-Techne	310043
RNAscope probe Mouse Ghsr	ACD /Bio-Techne	426141
RNAscope probe Mouse Phox2b-C2	ACD /Bio-Techne	407861-C2
RNAscope probe Mouse Prdm12-C2	ACD /Bio-Techne	524371-C2
RnaseZap	Sigma	R2020	Rnase decontaminating solution
Small dissecting scissors	Millipore Sigma	Z265977
Superfrost Plus slides	Fisherbrand	1255015
Tissue Tek OCT medium	Sakura	4583
User manual	ACD	323100 USM
Vannas Spring Scissors	Roboz	RS 5620
ZEN Imaging Software	Zeiss