Zebra Balığı Kullanarak Pigmentasyon Düzenleyicilerini Tanımlamak için Ters Genetik Yaklaşım

Özet

Melanosit fonksiyonlarının düzenleyicileri, pigmentasyon sonucundaki gözle görülür farklılıkları yönetir. Aday pigmentasyon geninin moleküler fonksiyonunu deşifre etmek bir zorluk teşkil eder. Burada, adayları tanımlamak ve bunları melanin içeriği ve melanosit sayısının düzenleyicileri olarak sınıflandırmak için bir zebra balığı model sisteminin kullanımını gösteriyoruz.

Özet

Melanositler, epidermal deride bulunan özelleşmiş nöral tepe türevli hücrelerdir. Bu hücreler, genomu zararlı ultraviyole radyasyonlardan koruyan melanin pigmentini sentezler. Melanosit fonksiyonlarındaki bozulmalar piebaldizm, albinizm, vitiligo, melazma ve melanom gibi pigmenter bozukluklara yol açar. Zebrafish, melanosit fonksiyonlarını anlamak için mükemmel bir model sistemdir. Göze çarpan pigmentli melanositlerin varlığı, genetik manipülasyon kolaylığı ve transgenik floresan hatlarının mevcudiyeti pigmentasyon çalışmasını kolaylaştırır. Bu çalışma, melanositlerin çeşitli aşamalarını işaretleyen mitfa ve tyrp1 promotörleri altında yeşil floresan protein (GFP) ekspresyonunu yönlendiren vahşi tip ve transgenik zebra balığı çizgilerinin kullanımını kullanmaktadır.

Larva pigmentasyonu üzerindeki fenotipik sonucu değerlendirmek için aday genlerin morfolino bazlı susturulması sağlanır ve pigmentasyon düzenleyicileri için tarama için uygulanabilir. Bu protokol, pigmentasyon sonucunu kapsamlı bir şekilde değerlendirmek için mikroenjeksiyondan görüntülemeye ve floresanla aktive hücre sıralama (FACS) bazlı fenotiplerin iki aday gen, karbonik anhidraz 14 (Ca14) ve bir histon varyantı (H2afv) kullanılarak diseksiyonuna kadar olan yöntemi göstermektedir. Ayrıca, bu protokol, aday genlerin, sırasıyla hücre başına melanosit sayılarını ve melanin içeriğini seçici olarak değiştiren melanosit belirteçlerine ve farklılaştırıcılarına ayrıldığını göstermektedir.

Giriş

Fotokoruma için melanin kullanımı hayvan krallığında birkaç kez evrimleşmiş olsa da, omurgalılar süreci mükemmelleştirmiş gibi görünmektedir. Melanini sentezlemek ve içermek için ayrıntılı bir makineye sahip özel pigment üreten hücreler balıklardan insanlara korunur¹. Bununla birlikte, pigmentasyonun sonucu, renkten resme kadar değişen ve bütünlükler, cilt ve saç² üzerinde canlı desenler olarak ortaya çıkan çarpıcı bir şekilde çeşitlidir. Çeşitliliğe rağmen, pigmentasyon yanıtında rol oynayan genlerin repertuarı çarpıcı bir şekilde korunmuştur. Melanin sentezleyen makinenin temel bileşenleri, örneğin anahtar melanin sentezleyici enzimler, melanozomların bileşenleri ve sinyal yoluna yukarı akış bağlantısı, organizmalar arasında temelde aynı kalır. İnce genetik farklılıklar, tür^3'te gözlenen pigmentasyon modellerinde dramatik değişiklikler meydana getirir. Bu nedenle, daha düşük omurgalı bir organizma olan zebra balığında (Danio rerio) ters genetik bir yaklaşım, genlerin pigmentli^{durumun 4} oluşturulmasındaki katılımını deşifre etmek için mükemmel bir fırsat sunar.

Zebra balığı embriyoları, tek hücreli döllenmiş bir zigottan larvaya döllenme sonrası ~24 saatlik bir süre içinde gelişir (hpf)⁵. Çarpıcı bir şekilde, melanosit eşdeğeri hücreler - melanoforlar - dermiste bulunan ve koyu melanin içeriği⁶ nedeniyle göze çarpan büyük hücrelerdir. Bu nöral tepe türevli hücreler ~11 hpf yayar ve ~24 hpf ^6,7 pigmente başlar. Korunmuş gen ekspresyon modülleri, melanosit fonksiyonlarını düzenleyen anahtar faktörlerin tanımlanmasını sağlamış ve melanosit gelişiminin seçici aşamalarını etiketleyen transgenik floresan muhabir hatları Tg (sox10: GFP), Tg (mitfa: GFP) ve Tg (ftyrp1: GFP) 8,9,10'un geliştirilmesine yol açmıştır. Bu transgenik balık çizgilerinin kullanılması, melanositlerin hücre biyolojisinin doku bağlamında organizma düzeyinde gelişimsel zaman çizelgelerine göre uygun ipuçlarıyla sorgulanmasını sağlar. Bu muhabirler, melanositlerin pigment bazlı kantitasyonunu tamamlar ve melanin içeriğinden bağımsız olarak melanosit sayılarının farklı bir şekilde değerlendirilmesini sağlar.

Bu makale, melanin içeriği ve melanosit sayıları olmak üzere iki kritik parametreyi değerlendirerek melanositlerin biyolojisini deşifre etmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Birincisi, bir hipopigmentasyon yanıtından kaynaklanan yaygın bir fonksiyonel okuma iken, ikincisi melanositlerin spesifikasyonunda veya hayatta kalmasında bir azalma ile ilişkilidir ve genellikle genetik veya edinilmiş depigmentasyon koşullarıyla ilişkilidir. Bu ters genetik taramanın genel stratejisi, bir morfolino kullanarak seçilmiş genleri susturmak ve melanosit spesifik sonuçları araştırmaktır. Melanin içeriği, ortalama gri değerlerin görüntüye dayalı nicelleştirilmesi kullanılarak analiz edilir ve ardından bir melanin içeriği testi kullanılarak doğrulanır. Olgunlaşmanın çeşitli aşamalarındaki melanositlerin sayısı, görüntü tabanlı kantitasyon kullanılarak analiz edilir ve FACS analizi kullanılarak daha da doğrulanır. Burada, tarama protokolü, melanogenezde rol oynayan karbonik anhidraz 14 olmak üzere iki aday gen ve nöral krest öncü popülasyonundan melanositlerin spesifikasyonunda yer alan bir histon varyantı H2AFZ.2 kullanılarak gösterilmiştir. Birincisi melanosit sayılarını değil melanin içeriğini değiştirirken, ikincisi belirtilen melanositlerin sayısını ve sonuç olarak embriyodaki melanin içeriğini değiştirir. Sonuçta, bu yöntem, bir aday genin pigmentasyondaki rolünü tanımlamak ve melanosit sayılarını melanin içeriğine karşı kontrol etmedeki rolünü ayırt etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Protokol

Zebra balığı deneyleri, Hindistan'daki CSIR-Genomik ve Bütünleştirici Biyoloji Enstitüsü'nün (IGIB) kurumsal hayvan etiği onayına (IAEC) sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi (Öneri No 45a). Hayvanların çektiği acıları en aza indirmek için tüm çabalar gösterildi.

1. Zebra balığı embriyolarına morfolino enjekte edilmesi

1. Standart bir iğne çektirici kullanarak, çok keskin ve kapalı uçlu pipetler çizin.
2. Morfolino içeren çözeltiyi bir mikroyükleyici ucu kullanarak mikropipetlere yükleyin ve mikroenjektör aparatına yerleştirin. Mikropipeti kilitlemek için vidayı düzgün bir şekilde sıkın.
   NOT: Morfolinoların dozaj standardizasyonu gereklidir. Uygun dozaj% >70 sağkalım oranına ve 24 hpf'de spesifik bir fenotipe sahiptir.
3. İnce forseps kullanarak mikropipetin ucunu kesin ve kalibre edin¹¹.
4. Kalibre etmek için, mikropipetten kılcal tüpe 1 hacim morfolino çözeltisi enjekte edin ve enjeksiyon süresini 1 sn'de tutun. Bunu beş kez tekrarlayın. 1 mm = 30 nL hacim standardını kullanarak, kılcal boruyu bir ölçüm ölçeğine karşı tutarak 5 saniyede enjekte edilen hacmi bulun. Yukarıdaki bilgileri kullanarak, enjeksiyon¹² başına 1-3 nL enjekte etmek için gereken süreyi (saniye cinsinden) hesaplayın.
   NOT: Standart, 1 mm = 30 nL, mikroenjektör basınç ayarlarına ve kalibrasyon için kullanılan kılcal damarın çapına özgüdür. İdeal olarak, enjeksiyon, döllenmeden sonra 15-20 dakika içinde oluşan yumurta sarısı hücresi arayüzüne yapılmalıdır. Çoklu enjeksiyonları kolaylaştırmak için, embriyoları daha düşük bir sıcaklıkta (18 ° C) tutarak gelişim biraz geciktirilebilir. Bununla birlikte, bu minimumda tutulmalı ve düşük sıcaklığın gen ekspresyon değişiklikleri üzerindeki bileşik etkisi nedeniyle 30 dakikadan fazla uzatılmamalıdır.
5. Embriyoları agaroz dökümlü bir Petri kabına (60 mm) monte edin. Embriyoları sırtların içine sıkıca istifleyin. Ateşle cilalanmış cam pipetler kullanarak, enjeksiyon için doğru yönde hizalayın.
6. Bir mikroskop altında, mikropipeti embriyoya yaklaştırmak için manipülatörler kullanın ve ayak pedalına basarak yumurta sarısı hücresi arayüzünün içine enjekte edin.
7. Tüm embriyoları benzer şekilde enjekte edin; Onları taze embriyo su ortamı içeren bir Petri kabında toplayın ve 28 ° C'de inkübe edin.
8. Enjekte edilen embriyoları 6-8 saat sonra kontrol edin. Yüksek opaklıkları nedeniyle tanımlanabilen tüm ölü embriyoları çıkarın ve enfeksiyonu önlemek için embriyo suyunu günde en az bir kez değiştirmeye devam edin.

2. Pigmentasyon analizi

1. 3 dpf zebra balığı embriyolarında lateral orta hat melanoforlarını saymak için hazırlık
   1. Embriyoları hareketsiz hale getirmek için% 0.016 nöro-müsküler anestezi ile tedavi edin.
   2. Embriyoları görüntüleme için monte etmek için, Petri kabına (60 mm) birkaç mililitre% 1.5-2 metilselüloz ekleyin, böylece ince bir tabaka oluşturur. Bir Pasteur pipet kullanarak, görüntüleme sırasında daha fazla hareketi kısıtlamak için embriyoları seçin ve yavaşça metilselüloz içine yerleştirin.
   3. Optimal lateral (dorsal şerit, ventral şerit, yumurta sarısı şeridi ve orta hat melanoforları) veya dorsal (başın dorsal kısmındaki melanoforlar) görüntüleme için konumlarını ayarlayın. Bitişik melanoforların daha iyi çözünürlüğü için, daha yüksek büyütmede görüntü (>5x)
2. Parlak alan görüntüleme
   NOT: Parlak alan görüntüleme, 8-10x büyütmeli bir stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirilir.
   1. Zebra balığı embriyolarını içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir manipülatör kullanarak, balığı bu yönde ayarlayın, böylece beş melanosit embriyonik çizgisinin tümü aynı anda görünür (dorsal, ventral, iki lateral, yumurta sarısı) (Şekil 1C). Alma yazılımını kullanarak görüntüleri hızla yakalayın. Hayvanın görüntülenmeden önce hareketi yeniden kazanması durumunda, tekrar anesteziye daldırın ve yeterince hareketsiz hale getirildikten sonra görüntülemeye devam edin.
   2. Bunu tüm balıklarla tekrarlayın ve büyütmenin her görüntü için aynı kalmasını sağlayın.
3. ImageJ yazılımını kullanarak ortalama gri değeri hesaplama
   1. 2 dpf zebra balığı embriyosunun dorsal ve lateral görüntülerini alın.
   2. Aç aracını kullanarak ImageJ'de ölçülecek görüntüyü açın. Analiz edilecek alanın ana hatlarını çizmek için serbest şekil aracını kullanın. Ölçümleri ayarla seçeneğine gidin ve Ortalama gri değer | alanı'nı seçin. M'ye basın (veya Analiz Et | Ölçüm) kullanarak seçilen alanın ortalama gri değerini hesaplar.
   3. Analiz edilecek alanı sabit tutarak, her hayvan için ortalama gri alanı ayrı ayrı hesaplayın.
   4. Elde edilen verilerle bir çubuk grafik çizin (Şekil 2F).
4. Melanin içeriği analizi
   1. 2 dpf'de, ~ 25 zebra balığı embriyosu toplamak için bir cam Pasteur pipet kullanın.
   2. 1 mL insülin iğneleri kullanarak manuel dekoryonasyon yapın ve bunları 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine ekleyin.
   3. Embriyo ortamını dikkatlice atın ve proteaz inhibitörü kokteyli ile 1 mL buz gibi soğuk lizis tamponu (20 mM sodyum fosfat (pH 6.8),% 1 Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM EDTA) ekleyin ve sonikasyon ile protein lizatları hazırlayın.
   4. Lizatları 1 mL 1 N NaOH içinde çözün ve numuneleri bir su banyosunda 50 dakika boyunca 100 ° C'de inkübe edin. Lizatları tamamen homojenize etmek için aralıklı olarak vorteks.
   5. Bir spektrofotometre kullanarak numunelerin 490 nm'de absorbans okumalarını alın.
   6. Numune absorbansını bilinen sentetik melanin konsantrasyonlarının standart bir eğrisiyle karşılaştırarak melanin içeriğini hesaplayın (Şekil 2G).

3. Melanofor sayısı

NOT: Transgenik Zebra balığı embriyolarında floresan analizi iki yöntemle yapılabilir: 1) GFP-pozitif hücrelerin sayılması; 2) floresan yoğunluğunun ölçülmesi.

1. Erken zebra balığı embriyolarında GFP-pozitif hücrelerin FACS tabanlı sayımı için hazırlık
   1. 200-250 ftyrp:GFP embriyo toplayın ve düz embriyo suyu kullanarak bir süzgeçte yıkayın. Negatif bir kontrol olarak, GFP-negatif, aşama uyumlu vahşi tip (Assam Wildtype) embriyoları^{işleyin 12}.
   2. İlgilenilen aşamaya bağlı olarak, embriyoları 0.6 mg / mL pronaz içeren bir Petri kabına aktarın. 5-10 dakika sonra, bir Pasteur pipet kullanarak, dekoryonlanmış embriyoları sade embriyo suyu içeren taze bir Petri kabına aktarın. Bir cam Pasteur pipet kullanarak, ~ 100 embriyo toplayın ve bunları 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   3. Ortamı dikkatlice atın ve 200 μL buz gibi soğuk Ringer çözeltisi (yumurta açma tamponu) ekleyin. Tüpü buz üzerinde tutarak, yumurta sarısı çözülene kadar içeriği ~ 20 kez yukarı ve aşağı doğru pipetleyin. Tüpleri 100 × g'da 4 °C'de bir masa üstü santrifüjde 1 dakika boyunca santrifüj edin. Tekrar santrifüj yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.
   4. 1 mL'lik bir pipet kullanarak, yumurta sarısı çıkarılmış embriyoları 10 mL tripsin çözeltisi (hücre ayrışma tamponu) içeren bir Petri kabına aktarın. Embriyoların aşırı kalabalıklaşmasını ve verimsiz tripsinizasyonu önlemek için birden fazla Petri kabında uygulayın. 1 mL'lik bir pipet kullanın, agregasyonu azaltmak için embriyo gövdelerini içeren çözeltiyi bir veya iki kez karıştırın.
   5. Petri kaplarını oda sıcaklığında 15 dakika (<24 hpf embriyo) veya 30 dakika (24-30 hpf embriyo) inkübe edin. Hücrelerin parçalanmasına yardımcı olmak için ara sıra 1 mL'lik bir pipet kullanarak süspansiyonu aspire edin ve dağıtın.
   6. Kuluçka döneminde, hücre sayımı için akış sitometre makinesini başlatın.
   7. 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için tripnize edilmiş süspansiyonu süzgeçten geçirin. Petri bulaşıklarını yüzeye yapışmış hücreleri çıkarmak için aynı süspansiyonla birkaç kez yıkayın.
   8. Numuneleri 450 × g, 4 °C'de sallanan kova rotorunda 5 dakika boyunca döndürün.
   9. Süpernatantı atın ve peleti 1mL buz gibi soğuk 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yeniden askıya alın.
   10. 450 × g, 4 ° C'de 5 dakika boyunca tekrar döndürün ve süpernatanı atın.
   11. Son olarak, pelet PBS +% 5 fetal sığır serumunda tekrar askıya alın ve FACS çalışana kadar buz üzerinde tutun.
2. Akış sitometresinin hazırlanması
   1. Akış sitometresini açın ve başlatmayı başlatın.
      NOT: Makineyi açmadan önce, atık kutusunu boşaltın ve kılıf sıvısı tankını doldurun.
   2. 70 μm (veya 85 μm) nozul için akışın akışını normalleştirin. Kararsızsa 10-15 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
3. Bir akış sitometresi kullanarak floresan olarak etiketlenmiş hücreleri sayma
   1. Yeni bir deneme klasörü başlatın ve yan saçılmaya karşı ileri saçılmanın ve floresein izotiyosiyanat (FITC) yoğunluğunun histogramının bir dağılım grafiğini oluşturun.
   2. İleri ve yan saçılma kapılarını (çiftleri ve kalıntıları dışlamak için) ve FITC eşiğini ayarlamak için önce vahşi tip hücreleri yükleyin.
   3. Kapılar ayarlandıktan sonra, numuneyi çıkarın ve melanositleri saymak için Tg (ftyrp1: GFP) embriyolarından izole edilen hücreleri yükleyin.
      NOT: Burada, ftyrp1: GFP özellikle olgun melanositleri etiketlediğinden, FITC kapısı altındaki GFP-pozitif hücrelerin sayısı melanosit sayısına karşılık gelecektir.
   4. Melanosit sayısını kontrol ile tahmin etmek ve karşılaştırmak için yukarıdaki adımı morfolino enjekte edilmiş örneklerle tekrarlayın.
4. Zebra balığı embriyolarında floresan yoğunluğunun ölçülmesi
   1. Bir cam Pasteur pipet kullanarak, 100-120 embriyo toplayın ve bunları düz embriyo suyu içeren bir Petri kabına aktarın.
   2. ~ 10-12 hpf'de, pigmentasyonu inhibe etmek için embriyoları% 0.003 1-fenil-2-tiyoüreye aktarın.
   3. <48 hpf embriyoları görüntülemek için insülin iğneleri kullanarak manuel dekoryonasyon gerçekleştirin.
   4. Embriyoları hareketsiz hale getirmek için,% 0.016 trikain ile tedavi edin.
   5. Görüntüleme için embriyoları monte etmek için, Petri kabına (60 mm) birkaç mL% 1.5-2 metilselüloz koyun, böylece ince bir tabaka oluşturur. Görüntüleme sırasında daha fazla hareketi kısıtlamak için embriyoları metilselüloza ekleyin. Örnekleri içeren Petri kabını mikroskop altına yerleştirin. Bir pipet ucu kullanarak, hayvanı istediğiniz yönde ayarlayın.
   6. Alma yazılımını kullanarak görüntüleri alın. <24 hpf embriyolar için, tüm embriyoyu bir kerede 10x büyütme altında yakalayın. >24 hpf aşamaları için, birden fazla tarama alanı elde edin ve daha sonra bunları bir araya getirin (dikin).
   7. Bunu tüm balıklarla tekrarlayın ve edinme ayarının deney boyunca sabit kaldığından emin olun.
5. Miktar
   1. ImageJ yazılımını kullanarak görüntüyü daha fazla analiz edin.
   2. Aç aracını kullanarak ImageJ'de ölçülecek görüntüyü açın.
   3. Analiz için alanın ana hatlarını çizmek üzere serbest şekil aracını kullanın (Şekil 3E).
   4. M'ye basın (veya Analiz Et | Ölçüm) seçili bir alan yoğunluğu ölçümü elde etmek için.
   5. Analiz edilecek alanı sabit tutarak, her hayvan için alan başına ortalama yoğunluğu ayrı ayrı hesaplayın.

Sonuçlar

Şekil 1'de açıklanan iş akışı, zebra balığı tek hücreli aşamasında morfolino bazlı genetik pertürbasyon gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Pigmentasyon analizi aşağıda belirtildiği gibi çeşitli yöntemler kullanılarak yapılmıştır. Temsili sonuçları göstermek için, zebra balığı embriyosunun sarısına veya tek hücreli aşamasına h2afv ve ca14 genlerini hedef alan standartlaştırılmış antisens morfolino hacimleri enjekte edildi....

Tartışmalar

Pigmentasyon fenotipi genellikle melanin içeriğindeki değişiklikler veya pigment taşıyan melanositlerin sayısındaki değişiklikler olarak kendini gösterir. Burada açıklanan yöntem, bu dikotominin diseksiyonuna izin verir ve melanin içeriğinden bağımsız olarak, melanin içeriğinin ve embriyo başına melanofor sayısının kalitatif ve kantitatif olarak değerlendirilmesine izin verir. Zebra balıklarının yüksek doğurganlığı, pigmentli melanositlerin görünür doğası ve melanozom transferinin ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microtubes	Axygen	MCT-150-A	For preparing MO solution
2 mL Microtubes	Axygen	MCT-200-C	For washing steps in FACS protocol
Agarose	Sigma-Aldrich	A-9539-500G	For microinjection
BD FACSAria II	BD Biosciences	NA	For cell sorting
Capillary tube	Drummond	1-000-0010
Corning cell strainer	Corning	CLS431751	For making single cell suspension
DMEM High Glucose Media	Sigma-Aldrich	D5648	FACS protocol
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)	Sigma-Aldrich	E10521-50G	to immobilize ZF for imaging
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134	For cold lysis buffer
FACS tubes	BD-Biosciences	342065	FACS protocol
Fetal bovine serum (FBS)	Invitrogen	10270	FACS protocol
Graphpad prism Software	Graphstats Technologies	NA	For data representation
ImageJ Software	National Institute of health	NA	For image analysis
Insulin Syringes (1 mL)	DispoVan	NA	For manual dechorionation
Melanin, Synthetic	Sigma-Aldrich	M8631	For melanin content assay
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M7027-250G	to immobilize ZF for imaging
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	For microinjection
Morpholino	Gene-tools	NA	For knock-down experiments
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629	to inhibit melanin formation
Needle puller	Sutter Instrument	P-97	For microinjection
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	FACS protocol
Petridish (60 mm)	Tarsons	460090	For embryo plates
Phenylmethylsulphonyl fluoride	Sigma-Aldrich	10837091001	For cold lysis buffer
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TL1099-500mL	For washing cells
Pronase	Sigma-Aldrich	53702	For dechorionation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For cold lysis buffer
Sheath fluid	BD FACSFlowTM	342003	FACS protocol
Sodium phosphate	Merck	7558-79-4	Cold lysis buffer
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML	For cold lysis buffer
TrypLE	Gibco	1677119	For trypsinization