Farede Gelişmekte Olan Yumurtalık Rezervinin Kantitatif 3D Analizi için Tüm Yumurtalık İmmünofloresansı, Temizleme ve Multifoton Mikroskobu

Özet

Burada, tam montajlı immünoboyama, çoklu foton mikroskobu ve 3D görselleştirme ve analiz kullanarak kantitatif ve kalitatif analizler için tüm yumurtalıkları görüntülemek için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlilleri için geçerli olan yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi kapsar.

Özet

Kadın fertilitesi ve üreme ömrü, yumurtalık oosit rezervinin kalitesine ve miktarına bağlıdır. Mayotik faz I'e giren dişi germ hücrelerinin tahmini% 80'i, Fetal Oosit Yıpranması (FOA) ve doğum sonrası yaşamın ilk haftasında elimine edilir. Üç ana mekanizma, gelişim sırasında hayatta kalan oosit sayısını düzenler ve ergenliğe giren kadınlarda yumurtalık rezervini oluşturur. Yumurta kaybının ilk dalgasında, oositlerin% 30-50'si, yüksek Uzun serpiştirilmiş nükleer element-1 (LINE-1) ekspresyonuna atfedilen bir fenomen olan erken FOA sırasında elimine edilir. Oosit kaybının ikinci dalgası, mayotik defekti olan oositlerin mayotik kalite kontrol noktası ile ortadan kaldırılmasıdır. Oosit kaybının üçüncü dalgası, primordiyal folikül oluşumu sırasında, bazı oositlerin folikül oluşturamadığı durumlarda perinatal olarak ortaya çıkar. Bu üç oosit kaybı dalgasının her birini neyin düzenlediği ve farelerde veya insanlarda yumurtalık rezervini nasıl şekillendirdikleri belirsizliğini korumaktadır.

İmmünofloresan ve 3D görselleştirme, oosit gelişimini daha az bilgilendirici 2D bölümlerden ziyade tüm yumurtalık bağlamında görüntülemek ve analiz etmek için yeni bir yol açmıştır. Bu makale, tüm yumurtalık immün boyama ve optik temizleme için kapsamlı bir protokol sunarak, multifoton mikroskobu kullanarak görüntüleme ve ticari olarak temin edilebilen yazılımı kullanarak 3D modelleme için preparatlar sunmaktadır. Bu yöntemin C57BL / 6J farelerde yumurtalık gelişimi sırasında yumurta yıpranmasının dinamiklerini göstermek ve üç yumurta eliminasyon dalgası sırasında yumurta kaybını ölçmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu protokol, oosit görselleştirme ve nicelleştirme için prenatal ve erken postnatal yumurtalıklara ve diğer kantitatif yaklaşımlara uygulanabilir. Daha da önemlisi, protokol, toksikoloji, klinik teşhis ve yumurtalık fonksiyonunun genomik tahlillerindeki ihtiyaçları karşılayabilecek yüksek verimli, güvenilir ve tekrarlanabilir işlemeyi barındırmak için stratejik olarak geliştirilmiştir.

Giriş

Çoğu memeli dişi, primordiyal foliküllerde depolanan ve yumurtalık rezervini (^{OR) oluşturan} sınırlı sayıda mayotik olarak tutuklanmış oositle doğar1,2. Ameliyathane, genel kadın üreme ömrünü ve sağlığını belirler³. Ameliyathane normalde yaşlanma ile birlikte küçülür ve bazı genotoksik ajanlara (radyasyon / kemoterapi) ve çevresel streslere (yetersiz beslenme) maruz kalındığında erken tükenebilir ve bu da infertiliteye yol açar ^4,5,6. İdiyopatik kadın infertilitesi sıklıkla ameliyathaneden gelişen yumurtaların genetik ve fizyolojik kalitesine bağlanabilir ve hala tam olarak anlaşılamamıştır ^7,8. Kadın folikül bağışı büyük ölçüde doğumla önceden belirlendiğinden, ameliyathanenin kurulması ve sürdürülmesinde yer alan düzenleyici mekanizmaları anlamak önemlidir.

Farelerde, OR oluşumu, Embriyonik gün (E) 7.5² civarında ilkel germ hücrelerinin (PGC'ler) spesifikasyonu ile başlar. PGC'ler genital sırtlara göç eder ve burada yaklaşık E10.5⁹ tarafından ikamet ederler. Aşağıdaki yaygın proliferasyon, tamamlanmamış sitokinezi ile ortaya çıkar ve daha sonra gelişme^10,11'de parçalanacak kistlerin oluşumuna neden olur. Yaklaşık E12.5'te gonadal cinsiyet belirlenir ve PGC proliferasyonu yumurtalıklarda durur. Kadınlarda, PGC'ler, şimdi oositler, yaklaşık E13.5^12,13'te mayotik faz I'e (MPI) girerler. Oositler uzatılmış MPI ile ilerler ve doğum sırasında diktiyat aşamasında tutuklanır. Doğumdan sonraki ilk hafta boyunca, tutuklanan her oosit granüloza hücreleri ile çevrilidir, böylece ilkel bir folikül oluşturur.

Bir dişinin ameliyathanesindeki primordiyal foliküllerin sayısı, MPI tutuklamasından önce ve sırasında apoptoz, otofaji veya nekroz yoluyla meydana gelen oosit eliminasyon dalgalarından kaç oositin kurtulduğuna bağlıdır^14,15. İlk dalga fetal gelişim sırasında ortaya çıkar ve FOA olarak bilinir. FOA, dişilerde (memeli ve memeli olmayan) evrimsel olarak korunmuş bir süreçtir ve bu sayede yumurta türlerinin tahmini% 50-80'i dişi türlere bağlı olarak elimine edilir^16,17,18,19. Farelerde, FOA E15.5 ila E18.5 arasında meydana gelir ve oosit ölümüne neden olan retrotranspozon LINE-1 sekanslarının reaktivasyonu ve ekspresyonuna atfedilmiştir^20,21. Oosit eliminasyonunun ikinci dalgası, onarılmamış DNA çift iplikçik kırılmaları (DSB'ler) gibi mayotik defektlere sahip oositleri ortadan kaldıran mayotik bir kontrol noktasından ^{gerçekleşir22,23}. Bir sonraki oosit eliminasyon dalgası, kist parçalanması sırasında meydana gelir ve her biri tek bir oosit^10,11,24,25 içeren ilkel foliküllerin oluşumu sırasında doruğa ulaşır.

Farelerde, ilkel folikül rezervi büyük ölçüde ergenlik döneminde kurulur, daha sonra ilkel foliküller düzenli üreme döngüleri sırasında büyüme için aktive edildikçe azalır. Ameliyathane büyüklüğü bireysel kadınlar arasında ve farelerin farklı genetik suşları arasında değişir; Ancak, ameliyathane büyüklüğünün genetik regülasyonu iyi anlaşılmamıştır^26,27,28,29. Ameliyathane regülasyonunun genetik çalışmaları, doğum öncesi ve doğum sonrası gelişim sırasında oosit eliminasyon dalgalarını incelemek için standartlaştırılmış protokollerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Farelerde çeşitli oosit niceleme metodolojileri geliştirilmiştir, bunların en yaygın ve yaygın olarak kullanılanı histolojik kesitlerin histomorfometrik değerlendirilmesidir^30,31. Bu teknikte oositler, hematoksilin ve eozin (H&E) ve periyodik asit-Schiff (PAS) veya floresan belirteçler gibi histolojik lekelere sahip seri kesitlerde tanımlanır. Bu teknik, kesit kalınlığı, yumurtalık boyunca tüm bölümlerin verimli bir şekilde geri kazanılması ve bireysel laboratuvarların sayım şemaları dahil olmak üzere tüm koşullar sabit kalırsa güvenilirdir. Bununla birlikte, farklı laboratuvarlar tarafından bildirilen sayılar genellikle önemli ölçüde farklılık gösterir ve bu nedenle kolayca karşılaştırılamaz.

Ayrıca, genetik farklılıklar göz önüne alındığında, farklı fare suşlarının kullanımı da yumurta sayımlarını etkileyebilir. Histomorfometrik değerlendirme için ek hesaplamalı yaklaşımlar geliştirilmiştir ve fraksiyonatör yaklaşımını kullanarak oositlerin otomatik tespitini, hesaplamalı algoritmaları kullanarak otomatik sayımı ve aynı oositin birden fazla sayımını önlemek için histolojik görüntülerin 3D rekonstrüksiyonunu içerir^{31,32,33,34,35,36} . Histomorfometrik değerlendirmeye eklenen bu iyileştirmelerle bile, teknik, özellikle büyük ölçekli ve yüksek verimli çalışmalar için nispeten emek yoğundur. Toplanan veriler, sayım şemaları, bilgisayar algoritmaları ve kullanılan yazılımlardaki farklılıklar nedeniyle çalışmalar arasında tekrarlanabilir ve karşılaştırılabilir olmayabilir.

Son zamanlarda, yeni orta çözünürlüklü multifoton ve ışık tabakası mikroskobu ve optik doku temizleme yöntemlerinin geliştirilmesiyle hızlanan bozulmamış yumurtalıklar için 3D modelleme ve analiz teknikleri, yumurta sayılarını verimli bir şekilde ölçmek ve protein lokalizasyonunu ve dinamiklerini incelemek için tercih edilen yöntem haline gelmektedir^37,38. Bu 3D yöntemler, dokular ve organlar daha iyi korunduğu ve bozulmadan tutulduğu için histolojik yöntemlere kıyasla tipik olarak avantajlıdır. Ayrıca, 3D analiz ve modelleme, 2D analizde kaçırılabilecek organ içindeki hücre nişleri veya alt yapıları içindeki ve arasındaki işlev ve etkileşimler hakkında ek bilgiler sağlar.

Tüm organların 3D analizi, yumurtalıklar gibi bireysel organlar için doku bozulması veya hasarı olmadan fiksasyon, immün boyama ve optik temizleme protokollerinin optimizasyonunu gerektirir. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için görüntüleme için numune montajının ek optimizasyonu gereklidir ve mevcut görüntüleme platformuna bağlı olabilir. Son olarak, tüm bozulmamış yumurtalığın görüntülenmesi, sonraki hesaplamalı analizler için büyük miktarda veri üretir. Bu nedenle, karşılaştırmalı çalışmalar için ve gelişim aşamaları boyunca oositlerin sayımı için standartlaştırılmış 3D yöntemler geliştirmeye ihtiyaç vardır.

Bu protokol, standart immünoboyama ve daha önce bildirilen temizleme protokollerini kullanır ve basit, kullanıcı dostu ve yüksek verimli bir yaklaşıma odaklanır 38,39,40,41. Protokol, doğum sonrası 28. güne (P28) kadar çok sayıda doğum öncesi ve doğum sonrası yumurtalıkları ve farklı fare genetik geçmişlerinden gelen farklı boyutlardaki yumurtalıkları analiz etmek için optimize edilmiştir. İmmün boyama adımları tüm aşamalar için benzerdir; Bununla birlikte, temizleme protokolleri daha büyük boyutları, küçük ve büyük yumurtalıklar için sırasıyla ^40,41 olan ScaleS4 (0) ve CUBIC nedeniyle pubertal yumurtalıklar için farklılık göstermektedir. Ayrıca, kan hücrelerinden otofloresan önlemek için fiksasyondan önce P28 farelerde tüm vücut perfüzyonu gerçekleştirilir. Görüntü elde etmek için ışık tabakası mikroskobuna alternatif olarak Leica DIVE/4Tune platformu üzerine çok fotonlu mikroskop inşa edildi ve bu protokol için çeşitli analitik araçlara sahip IMARIS 3D Görselleştirme ve Analiz yazılımı seçildi. Bu protokolün takip edilmesi kolaydır ve daha az pratiktir, bu nedenle zaman kazandırır. Ayrıca, yumurtalığın büyüklüğüne ve yumurtaların düzenlenmesine bağlı olarak yumurta miktarı nispeten hızlıdır.

Protokol

Kullanılan tüm fareler C57BL/6J genetik suşu içerisindeydi (bakınız Malzeme Tablosu). Bu suş tamamen sıralanmıştır ve yumurtalık yapısı ve fonksiyonu ile ilgili birçok çalışma için standarttır. Fareler NIH kurallarına göre barındırıldı ve yapılan prosedürler Jackson Laboratuvarı Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan reaktifler ve bileşimler sırasıyla Malzeme Tablosu ve Tablo 1'de listelenmiştir.

1. Reaktiflerin hazırlanması

1. Fiksatif: 1x PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın. Örneğin, 24 numune için (0,5 mL/numune = 12 mL toplam hacim), 9 mL'lik 1x PBS'ye 3 mL'lik %16 PFA elektron mikroskobu sınıfı ekleyin.
2. Geçirgenlik tamponu
   1. Polivinil alkolü (PVA), geçirgenlik tamponuna ihtiyaç duyulmadan bir gün önce 1x PBS içeren 250 mL'lik bir plastik beherin içine ölçün. PVA'nın tamamen çözünmesini sağlamak için çözeltiyi gece boyunca karıştırın.
   2. Çözünmüş PVA'ya sodyum borohidrit ekleyin ve karışımın yaklaşık 3-5 dakika homojenleşmesine izin verin. Çözeltinin köpürmesini bekleyin.
   3. Çözeltiye Triton X-100 ekleyin ve Triton X-100 çözüldükten sonra tamponu kullanın.
      NOT: PVA'nın çözünmesi uzun zaman alır (en az 3 saat) ve antikorun penetrasyonu ne kadar iyi çözündüğüne bağlıdır. Daha büyük yumurtalıklar için, PVA'nın tamamen çözülmesi çok önemlidir.
3. Arabelleği engelleme
   1. Sığır serum albüminini (BSA) 1x PBS ile bir beherin içine ölçün. BSA çözülene kadar çözeltiyi karıştırın.
   2. Glisin, Triton X-100, Penisilin-streptomisin ve sodyum azid ekleyin. Çözelti homojenleşene kadar karıştırın. Tamponu bir şişeye aktarın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce normal keçi serumu ekleyin.
4. Yıkama tamponu: PVA'yı 1x PBS içeren bir beherde ölçün. PVA'nın çözünmesine izin vermek için çözeltiyi gece boyunca karıştırın. Triton X-100 ve sodyum azid ekleyin. Tampon karıştırıldıktan sonra 4 °C'de saklayın.
5. ScaleS4(0) çözeltisi (pH 8.1): D-sorbitol'ü PBS'de ≤100 °C'de karıştırılarak bir beherde çözün. Çözeltiye üre ekleyin ve üre çözündükten sonra, ısıyı kapatın ve çözeltinin tamamen çözünene kadar karışmasına izin verin. Gliserol ve dimetil sülfoksit ekleyin ve çözelti homojenleşene kadar karıştırın. Çözeltiyi karanlıkta oda sıcaklığında saklayın.
   NOT: ScaleS4(0) solüsyonu, yumurtalıkların temizlenmesinin ilk gününde taze hale getirilmelidir.
6. ScaleCUBIC-1 çözümü
   1. Üreyi PBS içeren bir beher içinde ≤100 °C sıcaklıkta karıştırarak çözün. N, N, N'��, n′-tetrakis (2-hidroksipropil) etilendiamin ayrı bir beher içine ölçün, daha sonra çözünmüş üreyi ekleyin ve reaktifler tamamen çözünene kadar ≤100 ° C sıcaklıkta karıştırın. Tüm reaktifler çözeltiye girdikten sonra, ısıyı kapatın ve oda sıcaklığında soğutun. Karanlıkta saklayın.
   2. Çözeltiyi bir filtreleme şişesine aktararak gazdan arındırın. Şişeyi borulu bir vakuma takın, şişeyi örtün ve çözeltideki kabarcıklar kaybolana kadar vakumu açın. Bu gaz giderme işleminden sonra çözeltiyi kullanın.
      NOT: Çözüm, bir aya kadar kullanmak üzere karanlıkta saklanabilir.
7. Sakkaroz çözeltisi: Sakkarozu 1x PBS'de çözün; daha sonra kullanmadan önce çözeltinin gazını çözün.
   NOT: Kullanmadan önce çözeltiyi taze olarak hazırlayın.
8. ScaleCUBIC-2 çözümü
   1. Sakkarozu PBS içeren bir beher içinde ≤100 °C sıcaklıkta karıştırarak çözün. Üre ekleyin ve üre eriyene kadar ≤100 °C sıcaklıkta karıştırın. Isıyı kapatın.
   2. Trietanolamin ve Triton X-100 ekleyin. Çözelti homojenleşene kadar karıştırın. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasına izin verin ve karanlıkta saklayın. Kullanmadan önce çözeltinin gazını çözün.
      NOT: Çözüm, bir aya kadar kullanmak üzere karanlıkta saklanabilir.

2. Prenatal yumurtalıkların diseksiyonu ve fiksasyonu (Şekil 1A)

1. Yetişkin dişileri (≥8 hafta) ve erkekleri onaylanmış kurumsal protokole göre eşleştirin. Her sabah vajinal tıkaçları kontrol edin.
   NOT: Vajinal tıkaçların sabahı, koitum (dphc) veya E0.5 sonrası 0,5 gün olarak belirlenmiştir.
2. Diseksiyon gününde,% 4 paraformaldehit (PFA) ve aliquot ~ 0.5 mL'yi tezgah tarafına yerleştirilmiş mikrosantrifüj tüplerine hazırlayın (hamile kadın başına ~ 4).
   NOT: PFA tehlikeli bir maddedir ve kimyasal bir başlık altında tutulmalıdır.
3. Her hamile kadın için ~ 10 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren üç adet 100 mm plaka hazırlayın (uterus hasadı, mezonefr-yumurtalık kompleksinin diseksiyonu ve yumurtalıkların izole edilmesi için).
4. Tercih edilen gelişim aşamasının embriyolarını taşıyan ve diseksiyona devam eden hamile kadınları ötenazi yapın. Bir seferde en fazla 1-2 dişi ötenazi. Gebe farelerin ötenazisi için onaylanmış bir protokol kullanın (örneğin, CO₂ maruziyeti ve ardından servikal çıkık).
5. Bir dişi ötenazi yapıldıktan sonra, karnına% 70 etanol püskürtün. Forseps kullanarak, karın derisini kaldırın ve karın ve vücut duvarından V şeklinde bir kesi yapmak için makas kullanın. Kesinin iki tarafını kesin ve uterustaki iç organları ve fetüsleri açığa çıkarmak için cildi tekrar soyun.
6. Forseps ve makas ile uterusu fetuslarla karın yağından ve yumurtalık arterlerinden ve damarlarından kesin ve ayırın. Uterusu çıkarın ve 1x PBS içeren 100 mm'lik bir plakaya yerleştirin. Rahim duvarını keserek ve yumurta sarısı kesesini delerek fetüsleri PBS'ye bırakın. Göbek kordonunu kesin.
   NOT: Gebelikte 15 günden küçük fetüsler için, annenin ötenazisi ve uterustan çıkarılması fetüsün hızlı ölümünü sağlar. Gebelikten doğuma kadar 15 günden daha eski fetüsler dekapitasyon ile ötenazi yapılmalıdır.
7. Bir fetüsü taze 1x PBS ile yeni bir plakaya aktarın. Bir E15.5 fetüsün kafasını kesmek için, fetüsü hareketsiz hale getirmek için iki arka bacağı plaketle plaka üzerinde dikkatlice ayırın. Baskın elde tutulan ikinci bir çift forseps kullanarak, boynu forseps uçları arasında tutun ve fetüsün başını kesmek için sıkın veya boynu kesmek için makas kullanın.
8. Baskın el forsepsleri ile ön ayakların altını kesin ve üst gövdeyi yavaşça çekin. Daha sonra, baskın el forsepslerinin bir uç noktasını peritoneal boşluğa dikey olarak karın bölgesinin açıklığına yerleştirin, forsepslerin diğer uç noktası dışarıda kalır. Forsepsleri kapatın, kesmek için vücut duvarını sıkıştırın ve iç organları açığa çıkarın.
9. Aynı forsepsle, böbrek ve üreme organları görünür hale gelene kadar bağırsaklar ve karaciğer de dahil olmak üzere organları nazikçe çıkarın. Fetüsün cinsiyetini belirleyin: E15.5'te, testisler oval iken yumurtalıklar uzun sosis benzeri bir şekle sahiptir.
   NOT: Daha erken aşamalarda, cinsiyeti belirlemek için genotipleme gerekebilir.
10. Bir çift forseps kullanarak, dişi fetüsü aşağı doğru tutun ve her mezonefrros-yumurtalık kompleksini kavramak için diğer forsepsleri kullanın ve böbreklerden ve Müllerian kanallarından yavaşça ayırın. Yumurtalıkları 1x PBS'li yeni bir plakaya yerleştirin, mezonefrleri bağlı bırakın, ancak yumurtalıkların açığa çıkmasını sağlamak için çevredeki dokuları çıkarın. Her iki yumurtalık da mikrosantrifüj tüplerinde ~ 0.5 mL% 4 PFA'ya yerleştirin ve gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin. Ertesi gün, PFA'yı% 70 etanol ile değiştirin.
11. E18.5 yumurtalıklarının diseksiyonu ve fiksasyonu için, fetüsleri yukarıda tarif edildiği gibi uterustan ayırın ve daha sonra bölüm 3'te açıklanan prepubertal yavrular için protokolü izleyin (Şekil 1B).

3. Prepubertal yumurtalıkların diseksiyonu ve fiksasyonu (Şekil 1B)

1. % 4 PFA ve aliquot ~ 0.5 mL'yi 1.5 mL tüplere hazırlayın ve bunları tezgah tarafına yerleştirin (yavru başına ~ bir tüp). 1x PBS (~ yavru başına bir) ile 35 mm'lik plakalar hazırlayın. Onaylanmış kurumsal protokolü kullanarak yavruları ötenazileştirin.
   NOT: Dekapitasyon, 8 günlük veya daha küçük fareler için tercih edilen ötenazi yöntemidir. Yenidoğan fareleri, 3-4" diseksiyon makası veya 5-7" Mayo makası kullanılarak kafası kesilebilir.
2. Erkeklerde kadınlardan daha büyük olan anogenital mesafeyi ölçerek yavruların cinsiyetini belirleyin. Dişi yavruların kafasını kesmek için keskin kafa kesme makası kullanın. Kanı boşaltmak için vücudu açık kesilmiş tarafı aşağı doğru bir kağıt havluya yerleştirin (~ 5-10 s).
3. Her ayağın pençe pedine bir iğne yerleştirerek yavruyu sırtına sabitleyin. Karnına% 70 etanol püskürtün. Yavrunun cildini vücuttan uzak tutmak için forseps kullanın ve alt karın derisinde küçük V şeklinde bir kesi yapmak için makas kullanın.
4. Makası cildin altındaki kesiye yerleştirin ve karnın her iki tarafı boyunca kesin. Forsepsleri cildi nazikçe soymak ve alt karnı ortaya çıkarmak için kullanın. Bağırsağı yavaşça yukarı doğru hareket ettirin ve uterus boynuzlarını mesanenin yanına yerleştirin. Her rahim boynuzunu böbreğe doğru takip edin ve yumurtalığı her böbreğin altında çevreleyen yağ dokusu ile bulun.
5. Yumurtalıkları diseke etmek için, uterus boynuzunu yumurtalık ve yumurta kanalının altında bir çift forseps (forseps A, Şekil 1B) ile tutun ve yavaşça vücuttan uzaklaştırın. Başka bir çift forseps (forseps B) kullanarak, ilk forseps çiftinin altından yavaşça tutun, böylece yağ pedindeki yumurtalık ve yumurta kanalı ikinci forseps çiftinin üzerinde görülebilir. Daha sonra, ikinci forseps çiftinin altını makasla kesin veya yumurtalıkları ve bağlı dokuları ayırmak için dikkatlice çekin.
6. İzole edilmiş organları 1x PBS'li bir plakaya yerleştirin. Yumurtalıkları temizlemek ve izole etmek için ekstra yağ dokusunu, yumurta kanalını ve uterus boynuzunu kesin. Yumurtalıkları çevreleyen bursayı nazikçe açın ve tüm yumurtalığı açığa çıkarın.
7. Yumurtalıklara zarar vermeden bursa zarını kesin ve Şekil 1B, P5'te gösterildiği gibi yumurtalıkla başa çıkmak için hilumun etrafındaki dokuyu (yumurtalık ve üreme sistemi arasındaki bağ benzeri yapı) bırakın. Yumurtalıklar kesildikten sonra,% 4 PFA'ya yerleştirin ve yumurtalıkları gece boyunca 4 ° C'de sabitleyin. Ertesi gün,% 4 PFA'yı% 70 etanol ile değiştirin ve bağışıklık boyama protokolü adımına kadar yumurtalıkları 4 ° C'de saklayın.

4. Pubertal yumurtalıkların perfüzyonu, diseksiyonu ve fiksasyonu (Şekil 1C)

1. Perfuse fareleri kurumsal olarak onaylanmış protokollere göre fare ile derin anestezi altında kimyasal bir duman başlığı içinde. Perfüzyon ekipmanını ve reaktiflerini hazırlayın. ^42'deki ayrıntılı protokole bakın.
   NOT: Perfüzyon, vasküler sistem boyunca kanı bir doku fiksatif ile değiştiren bir terminal ötenazi prosedürüdür.
2. Ergenlik çağındaki dişi fareyi (P28) tartın ve farenin ağırlığını kaydedin (tipik olarak 13 g ila 15 g arasında). Kullanılacak onaylı anestezi ajanının miktarını hesaplayın.
   NOT: Burada, bu protokolde 10 g vücut ağırlığı başına 0.35 mL tribromoetanol kullanılmıştır.
3. Şırıngayı onaylanmış anestezik ajanla doldurmak için 20 G iğneli 10 mL'lik tek kullanımlık bir şırınga kullanın. 20 G iğneyi 26 G x 3/8 iğne ile değiştirin.
4. Sırt boynu derisini tek elinizle karıştırarak fareyi dikkatlice kısıtlayın. Karnı ortaya çıkarmak için fareyi ters çevirin. Daha önce hesaplanan anestezik miktarını periton boşluğuna enjekte edin. Anestezi etkili olana kadar fareyi kapaklı bir kaba yerleştirin (yani, fare artık hareket etmez).
5. Fare hareket etmeyi bıraktığında, yanıt olmadığını kontrol etmek için ayaklarını hafifçe sıkıştırın ve perfüzyonu başlatmadan önce farenin tamamen anestezi altına alındığından emin olun. Dört bacağın tümünü pençe pedlerinden bir tahtaya hafifçe sabitleyerek fareyi sırtına yerleştirin ve sabitleyin. Bacakların aşırı gerilmemiş, rahat bir pozisyonda sabitlendiğinden emin olun.
6. Fareyi karından göğüs bölgesine% 70 etanol ile püskürtün. Karın derisini hafifçe sıkıştırmak ve kaldırmak için forseps kullanın ve ardından cilt ve vücut duvarından V şeklinde küçük bir kesim yapmak için makas kullanın.
7. Cilt kapağını vücut boşluğundan kaldırın ve makası cildin ve vücut duvarının altına yerleştirin. Cildi ve vücut duvarını doğrudan başa, sternumdaki göğüs boşluğunun kenarına doğru kesin.
8. Sternumun her iki tarafındaki kaburgaları kürek kemiğinin hemen altına dikkatlice keserek göğüs boşluğunu açın. Göğüs kafesinin altındaki akciğerleri delmemeye dikkat edin. Deri / kaburga kapaklarını forseps ile tutun ve iç organları açığa çıkarmak için sabitleyin.
9. Timus gibi kalbe net erişimi engelleyebilecek herhangi bir dokuyu nazikçe kesin. Alt karın da dahil olmak üzere tüm vücudun perfüze edildiğinin görsel olarak doğrulanmasını sağlamak için gastrointestinal sistem de dahil olmak üzere tüm organları açığa çıkarın.
10. Kalbin sağ atriyumunu kesmek ve sistemden kan salmak için diseksiyon makası kullanın. Kalbi forseps ile yavaşça tutun ve sol ventriküle bir perfüzyon iğnesi (peristaltik pompa kontrolörüne bağlı) yerleştirin.
11. Karaciğer, böbrekler ve üreme sistemi gibi dokular (Şekil 1E, F) pembeden beyaza dönene kadar yumuşak ama sabit bir basınçla ~ 10 mL PBS pompalayın. Daha sonra, PBS'yi yeni yapılmış% 1 PFA ile değiştirin ve yaklaşık 10 mL PFA ile veya farenin alt gövdesinde (örneğin, kuyruk) seğirme meydana gelene kadar perfüzyona devam edin.
    NOT: Bu fiksasyon titremeleri başarılı perfüzyonu gösterir.
12. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, yağ yastığını böbreğin altındaki yumurtalıklarla birlikte yerleştirin ve yağ pedi, yumurtalıklar ve uterus boynuzları dahil olmak üzere tüm üreme sistemini nazikçe diseke edin ve yolu% 4 PFA'lı bir şişeye yerleştirin. Yumurtalıkları gece boyunca oda sıcaklığında sabitleyin (~ 16-24 saat). Daha sonra,% 4 PFA'yı en az bir gün boyunca% 70 etanol ile değiştirin ve immün boyama protokolüne başlamadan önce yumurtalıkları (Şekil 1E, F) yukarıda açıklandığı gibi kesin.

5. Tam mount over immün boyama (Şekil 2A)

NOT: Uzun inkübasyon dönemlerinde kontaminasyonu önlemek için immün boyama protokolü sırasında, özellikle tamponları değiştirirken steril teknikler uygulayın.

1. Tüm immün boyama adımlarını Şekil 2A'da gösterildiği gibi 24 delikli bir plakada gerçekleştirin. Diğer formatlar için reaktif birimlerini ayarlayın. Küçük prenatal ve prepubertal yumurtalıkları kaybetmemek için tamponları dikkatlice değiştirin.
   NOT: 48 ve 96 delikli plakalar gibi diğer formatlar kullanılabilir, ancak daha derin kuyucuklar ve daha dar açıklıklar, yumurtalıkları kaybetmeden veya zarar vermeden tamponların aspire edilmesini zorlaştırır.
2. 1. Gün
   1. Pipet, temiz bir 24 delikli plakada ihtiyaç duyulan kuyu sayısına 1 mL PBS / kuyu içine yerleştirin. Geniş bir açıklık açmak için 200 μL'lik pipet ucunun ucunu kesin ve prepubertal yumurtalıkları %70 etanol içeren 1,5 mL tüplerden kuyucuklara nazikçe aktarmak için kullanın. Pubertal yumurtalıklar için, transfer için ucu kesilmiş 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanın.
      NOT: Ucun daha geniş açılması, transfer sırasında doku hasarını önler.
   2. Tüm numuneler kuyucuklara aktarıldıktan sonra, PBS'yi aspire etmek için yeni bir uç kullanın ve taze 0,8 mL PBS / kuyu ile değiştirin. Numuneleri oda sıcaklığında gece boyunca ~ 100-150 rpm'de bir çalkalayıcıda inkübe edin. Geçirgenlik tamponunun hazırlanmasına başlayın (bakınız Tablo 1 ve bölüm 1 ).
      NOT: Yeni uç, yumurtalıkların uca yapışmasını önler ve PBS inkübasyon adımı, yumurtalıkların PBS'de dengelenmesini ve lekelenmeden önce yeniden hidratlanmasını sağlar.
3. 2. Gün
   1. Geçirgenlik tamponunun hazırlığını tamamlayın. PBS'yi kuyulardan aspire edin ve kuyucuk başına 0,8 mL geçirgenlik tamponu ile değiştirin. Plakaları tekrar çalkalayıcıya yerleştirin ve numuneleri oda sıcaklığında 4 saat boyunca inkübe edin.
   2. 4 saatlik inkübasyondan sonra, geçirgenlik tamponunu tamamen aspire edin ve 0,5 mL bloke edici tampon ile değiştirin (bakınız Tablo 1 ve bölüm 1 ). Buharlaşmayı önlemek için plakayı parafilm ile kapatın, bir çalkalayıcı üzerinde güvenli bir şekilde kaplanmış bir kaba koyun ve numuneleri oda sıcaklığında gece boyunca (16-24 saat) tamponu bloke etmek için nazik bir ajitasyonla inkübe edin.
4. 3. Gün
   1. Primer antikorları bloke edici tamponda seyrelterek hazırlayın. Oositleri görselleştirmek için, oosit belirteçleri kullanın, örneğin, hem prenatal hem de prepubertal yumurtalıklar için sıçan anti-germ hücresi nükleer asidik peptidaz (GCNA) / TRA98 ve hem prepubertal hem de pubertal yumurtalıklar için tavşan anti-DEAD-box helikaz 4 (DDX4) / fare vaza homologu (MVH). Prenatal yumurtalıklarda LINE-1 ORF1p ekspresyonunu ölçmek için, tavşan anti-LINE-1 ORF1p veya başka bir mevcut antikor kullanın.
      NOT: GCNA/TRA98 sinyali pubertal yumurtalıklarda saptanamaz.
   2. Bloke edici tamponu numunelerden aspire edin ve 0.5 mL seyreltilmiş birincil antikorlarla değiştirin. Buharlaşmayı önlemek için plakayı parafilm ile kapatın. Kuluçka sırasında numunelerin kurumasını önlemek için plakaları kapaklı bir kaba yerleştirin. Kabı çalkalayıcıya yerleştirin ve numuneleri oda sıcaklığında 3-4 gün boyunca inkübe edin.
5. 7. Gün
   1. Parafilmi plakalardan yavaşça çıkarın ve birincil antikor karışımını numunelerden aspire edin. Birincil antikor karışımlarını 4 ° C'de saklayın (bir aya veya üç kullanıma kadar) ve daha sonra taze antikorlarla takviye edilerek tekrar kullanın (örneğin, daha önce kullanılan karışımın 5 mL'si başına 2 μL taze antikor alikotu).
   2. Numunelere kuyucuk başına 1 mL yıkama tamponu ekleyin (bakınız Tablo 1 ve bölüm 1) ve artık antikorları durulamak için plakaları birkaç saniye hafifçe sallayın. Yıkama tamponunu dikkatlice aspire edin ve 0,8 mL taze yıkama tamponu ile değiştirin ve plakaları gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayın.
6. 8. Gün
   1. Gece boyunca yıkama tamponunu aspire edin, 0,8 mL taze yıkama tamponu ile değiştirin ve oda sıcaklığında 2 saat çalkalayın. Yıkama adımını taze yıkama tamponuyla 2 saat daha tekrarlayın.
   2. Son yıkamadan sonra, yıkama tamponunu bloke edici bir tamponda seyreltilmiş 0,5 mL ikincil antikor karışımları ile değiştirin, örneğin, keçi anti-sıçan Alexa Fluor 555 ve keçi anti-tavşan Alexa Fluor 647 1:1.000 seyreltmede. Her immün boyama deneyi için ikincil antikor karışımını taze olarak hazırlayın.
   3. Kuluçka sırasında buharlaşmayı önlemek için plakayı parafilm ile kapatın. Numuneleri oda sıcaklığında karanlıkta veya alüminyum folyo ile kaplı plakalarda 3 gün boyunca nazik ajitasyonla inkübe edin.
      NOT: Bu adım ve sonraki tüm adımlar karanlıkta veya alüminyum folyo sargı ile gerçekleşir.
7. 11. Gün
   1. İkincil antikor karışımını aspire edin ve 1 mL yıkama tamponu ile ilk yıkamayı gerçekleştirin. Artık ikincil antikorları durulamak için plakaları birkaç saniye hafifçe sallayın.
   2. Yıkama tamponunu aspire edin, 0,8 mL taze yıkama tamponu ile değiştirin ve numuneleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca çalkalayarak inkübe edin, ışıktan koruyun. Toplam 3 yıkama için yıkama adımını 2 kez tekrarlayın. Üçüncü yıkamadan sonra, temizleme adımına geçin (bölüm 6).

6. İmmün boyalı tam montajlı yumurtalıkların temizlenmesi (Şekil 2A).

NOT: Plakaları alüminyum folyoya sararak veya opak kaplara yerleştirerek karanlıkta tüm temizleme adımlarını gerçekleştirin. Temizleme adımları prepubertal ve pubertal yumurtalıklar için farklılık gösterir.

1. 11. Gün [Prenatal ve prepubertal yumurtalıklar tek adımlı bir protokolle temizlenir]
   1. Son yıkamadan sonra, yıkama tamponunu aspire edin ve 0,8 mL taze yapılmış ScaleS4(0) çözeltisi ile değiştirin (bkz. Tablo 1 ve bölüm 1 ). Plakayı parafilm ile kapatın ve görüntülemeden önce numuneleri oda sıcaklığında çalkalayarak karanlıkta inkübe edin.
   2. Gerekirse ScaleS4(0) çözümünü her gün yeni bir çözeltiyle değiştirin; Solüsyonları değiştirirken dikkatli olun, çünkü temizlenmiş yumurtalıklar şeffaf hale gelir ve görülmesi zorlaşır. Temizledikten sonra, numune kurulumu ve görüntülemeye devam edin (bölüm 7).
      NOT: Değişen çözümler görüntü kalitesini önemli ölçüde artırmadı. Günlük değişiklikler, küçük ve çoğunlukla şeffaf numuneleri kaybetme olasılığını artırır.
2. 11-15. Günler [Pubertal yumurtalıklar iki aşamalı bir protokolle temizlenir]
   1. Son immün boyama yıkamasından sonra, yıkama tamponunu aspire edin ve 0,8 mL ScaleCUBIC-1 ile değiştirin (bakınız Tablo 1 ve bölüm 1 ). Plakayı parafilm ile kapatın ve örnekleri karanlıkta 3 gün boyunca 37 ° C'de hafifçe sallayın. ScaleCUBIC-1 çözümünü her gün taze çözeltiyle değiştirin.
   2. 15. günde, numuneleri oda sıcaklığında 0,8 mL PBS'de her seferinde 10 dakika boyunca 3 kez hafifçe çalkalayarak yıkayın. PBS'yi, PBS ile taze olarak hazırlanan 0,8 mL gazdan arındırılmış% 20 sakkaroz ile değiştirin. Oda sıcaklığında 1 saat hafifçe çalkalayın.
   3. %20 sakkaroz çözeltisini 0,8 mL ScaleCUBIC-2 Çözeltisi ile değiştirin (bkz. Tablo 1 ve bölüm 1 ), plakayı parafilm ile kapatın ve ScaleCUBIC-2 Çözeltisinin günlük değişiklikleriyle oda sıcaklığında hafifçe çalkalayın. 4-5 gün boyunca temizleyin ve görüntüye devam edin. Temizlenmiş yumurtalıklar şeffaf ve görülmesi zor olduğundan numune kaybını önlemek için çözelti alışverişinde bulunurken dikkatli olun. Örnek oluşturma ve görüntülemeye devam edin (bölüm 7).

7. Çoklu foton mikroskobu ile numune kurulumu ve görüntüleme

NOT: Aşağıda açıklanan tüm adımlar, maksimum 2,2 mm çalışma mesafesine sahip çoklu daldırma 16x/NA0,6 hedefi (daldırma sıvısı = gliserol) ile 120 fs darbe süresine sahip iki ayarlanabilir mod kilitli Ti:Safir multifoton lazere sahip bir Leica DIVE/4TUNE/FALCON ile gerçekleştirilmiştir. Görüntü alma yazılımı hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. Ek Tablo S1 ve Ek Şekil S1, bu protokol için kullanılan ayarları gösterir. Diğer görüntüleme platformları için, mikroskopi çekirdeğine danışın veya üreticilerin spesifikasyonlarına/tavsiyelerine uyun.

1. Örnek kurulum
   1. Numuneleri monte etmek için kurulumu hazırlayın. Örneğin, bir yapışkan kuyu oluşturmak için yapışkan ve esnek bir silikon conta kullanın. Yumurtalıkların yerleştirileceği bir kuyu oluşturmak için yapıştırıcı kuyusunu bir adet 25 mm x 25mm No. 1.5 mikro kapak kayması üzerine yerleştirin (Şekil 2B).
      NOT: 1 mm kalınlığında bir conta tüm yumurtalık boyutlarını barındırır. Bu kurulum, görüntüleme sırasında yumurtalık hareketini ortadan kaldırdığı için önerilir; bu, yumurtalıklar cam tabanlı bir tabakta montajcıya yerleştirildiğinde ortaya çıkabilir.
   2. Ucu kesilmiş bir pipet ucu kullanarak (doğum öncesi ve prepubertal için 20 μL), ~5-10 μL ScaleS4(0) çözeltisi içeren yumurtalıkları, Şekil 2B'de gösterildiği gibi yapıştırıcının ortasına aktarın. Pubertal yumurtalıklar için, ucu yumurtalıkları transfer edecek kadar kesilmiş 200 μL'lik bir pipet ucu kullanın. Yapışkan kutucuğun ortasına ~15-20 μL ScaleCUBIC-2 Çözeltisi ekleyin.
      NOT: Çok fazla çözüm mikroskop aşamasına sızmaya neden olabilir ve çok az çözüm düşük görüntü kalitesine neden olur. Temizlenmiş yumurtalıklar saydamlaştıkça ve görülmesi zorlaştıkça örnekleri aktarmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
   3. Yumurtalıklar bir damla temizleme çözeltisi ile ayrı kuyucuklara aktarıldıktan sonra, yapışkan kuyucuğun üzerine yavaşça başka bir kapak camı yerleştirin, bir conta oluşturmak için bastırın ve numuneleri iki kapak fişi arasına sıkıştırılmış küçük bir temizleme çözeltisi havuzunda yerinde tutun (Şekil 2B). Görüntüleme için, kapak fişini "sandviç" i 3D baskılı mikroskop adaptörü slaytına yerleştirin (örneğin, ^43).
      NOT: Yapışkan kuyular, "sandviç" in yapısökülmesinden ve suyla yıkanmasından sonra tekrar kullanılabilir.
2. Görüntüleme (Ek Tablo S1 ve Ek Şekil S1)
   1. Mikroskop çekirdeğinin veya üreticinin yönergelerine göre mikroskop ve yazılımı açın. Monte edilmiş numuneleri mikroskop sahnesine yerleştirin ve düşük güçlü bir LED floresan lamba ile aydınlatılan numuneyi bulmak için göz merceğinden bakın.
   2. Numuneler bulunduktan sonra, lazerleri açın ve her dedektörü belirli bir Alexa Fluor boyasına/işaretleyicisine atayın. Birden fazla lazer için, sıralı görüntü alımına izin verin. Lazerleri değiştirmeden önce tüm yığını edinin.
      NOT: Bu protokol için, hem 555 nm hem de 647 nm floroforların görüntü elde edilmesi için bir lazer kullanılmıştır.
   3. Görüntü alma parametrelerini mikroskopi çekirdeğinin veya üreticinin spesifikasyonlarına göre ayarlayın. Tarama süresini kısaltmak ve verimliliği artırmak için varsa çift yönlü görüntü yakalamayı kullanın. Satır ortalaması (1), kare ortalaması (1) ve kare birikimi (1) gibi diğer ayarları yapın.
      NOT: Çift yönlü görüntü alma, lazerlerin X ekseni üzerinde hareket ederken her iki yönde de tarama yapmasına olanak tanır.
   4. Z-Stack'i başlangıç (numunenin altı/alt cam kapağın altı) ve bitiş konumunu (numunenin üst kısmı/üst cam kapağın üstü) tanımlayarak ayarlayın. Prepubertal yumurtalıklar için 2 μm ve pubertal yumurtalıklar için 5 μm'lik bir Z-adım boyutu seçin.
   5. Z-kompanzasyon özelliğini etkinleştirin ve bu özellik içinde uyarma kazancını etkinleştirin. Hem alt (düşük yoğunluklu) hem de üst yığın (yüksek yoğunluklu) için bir lazer yoğunluğu seçerek numunenin alt ve üst kısmı için Z-kompanzasyonunu ayarlayın. Bkz. Ek Şekil S1, Doğrusal Z-telafisi, burada uyarma kazancı kutusu seçilir ve alt (0) ve üst (347.75) için lazer yoğunluğu sırasıyla 10 ve 12 olarak ayarlanır.
   6. Tek bir görüş alanında yakalanamayan daha büyük örnekler için döşeme modunu kullanın. Görüntü gezginini etkinleştirin ve dikdörtgen işaretleme aracını kullanarak tüm numuneyi yakalamak için gereken kutucuk sayısını belirtin.
   7. Görüntü alımını başlatın. Birden fazla kutucuk içeren görüntüler için, tüm kutucukları yakalamak üzere gezginle görüntü yakalamaya başlayın. Görüntü alma işlemi tamamlandıktan sonra, önce tüm görüntüleri kaydedin ve birden fazla döşeme edinilmişse, döşemeleri tek bir görüntüde birleştirmek için mozaik birleştirme aracını çalıştırın.
   8. Gigabayt boyutundaki görüntülerle çalışmayı kolaylaştırmak için birleştirilmiş dosyaları ayrı bir proje klasörüne kaydedin. 3D görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı ile görüntü işleme dosyalarını aktarın. Şekil 3 , iki belirteçle (GCNA ve DDX4) farklı aşamalarda çekilen temsili görüntüleri göstermektedir.

8. Görüntü işleme

NOT: Aşağıda açıklanan tüm adımlar IMARIS 3D görüntü görselleştirme ve analiz yazılımı kullanılarak geliştirilmiş ve gerçekleştirilmiştir.

1. Görüntü(ler)i 3B görüntü görselleştirme ve analiz yazılımına aktarın ve gerekirse dosyaları orijinal biçimden (ör. .lif, .czi, .lsm, .lei, .oib, .oif, .nd2) .ims biçimine dönüştürün.
2. Gerekirse, pikselleşmeyi azaltmak için görüntüleri gauss filtresiyle işleyin (Şekil 4A). 3B görünüm özelliğini kullanarak görüntüyü konumlandırın ve çerçeve seçeneğinin seçimini kaldırın (kareyi kaldırmak için).
   NOT: Pikselleşmeyi azaltmak ve arka plan yoğunluğunu azaltmak için kullanılabilecek başka isteğe bağlı filtreler de vardır.
3. Görüntüyü belirli bir ölçeğe büyütün ve Anlık Görüntü özelliğini kullanın. Tercihleri aşağıdaki gibi ayarlayın: 300 DPI öğesini seçin, TIFF Görüntüsü olarak kaydedin ve Saydam Arka Plan olarak kaydedin. Görüntünün anlık görüntüsünü alın ve kaydedin. Şekil 3'te birleştirilmiş görüntülerin tamamı gösterilmektedir.

9. Yumurta Ölçümü

NOT: Nokta özelliği kullanılarak bütün yumurtalıklardaki yumurta sayılarının tahmini için bütün yumurtalık immünofloresansı ve 3D görüntü görselleştirme ve analizi kullanılabilir (Şekil 3 ve Şekil 4). GCNA sinyali, Şekil 4'te (P5) gösterildiği gibi, prenatal ve prepubertal yumurtalıklardaki oositleri ölçmek için kullanılabilir. Pubertal yumurtalıklarda, büyümeyen foliküllerde ("halka benzeri" yapı, kapalı ok) ve büyüyen foliküllerde (büyük yapılar, açık ok, Şekil 4, P28) iki yumurta popülasyonunu ölçmek için DDX4 sinyalini kullanın.

1. Adım 9.2'deki Lekeler özelliği ile oositleri ölçmek için parametre olarak kullanılacak yumurtaların boyutunu belirleyin.
   1. Görüntüyü açın ve Z-yığını görüntüsünü açmak için Dilimle seçeneğini belirleyin.
   2. Ölçü panelinde Çizgi seçeneğini belirleyin ve sayılacak yumurta türünün/boyutunun XY çapını belirlemek için oositin/işaretleyicinin bir kenarından diğer kenarına en geniş noktada bir çizgi çizerek mesafeyi ölçün. Yığın boyunca ilerleyin ve aynı tipteki çoklu oositler için çap aralığını elde edin. Yumurta sayıları için boyut seçim kriteri olarak en kısa uzunluğu kullanın.
2. Noktalar özelliği: 3B Görünüm seçeneğini belirleyin ve Algoritma panelini açmak için Sahne panelinde Yeni Noktalar Ekle işlevini etkinleştirin. Adım 9.1'de elde edilen oosit boyutuna sahip boyut seçim filtresi kullanılacağı için tüm algoritma ayarlarının seçimini kaldırın.
   1. Kaynak Kanal'a gitmek için tek ileri oka tıklayın. Adım 9.1'de elde edilen Tahmini XY Çapı'nda tercih edilen işaretleyiciye sahip Kanalı ve türü seçin. Örneğin, doğum öncesi oositler için tahmini XY çapı 7 μm ve P5 oositler için 11 μm kullanın (GCNA = yeşil sinyal; Şekil 3 ve Şekil 4A).
   2. P5 yumurtalıklarında büyüyen foliküllerdeki oosit sayısını tahmin etmek için DDX4 sinyali için 30 μm kullanın (DDX4 = macenta sinyali; Şekil 3 ve Şekil 4A). Pubertal yumurtalıklar için, oosit nicelikleri için DDX4 sinyalini kullanın. Örneğin, Şekil 4A'da gösterildiği gibi, büyümeyen foliküller ve büyüyen foliküller içindeki oositleri tanımlamak için sırasıyla 15 μm ve 80 μm'lik XY çaplarını kullanın.
      NOT: Seçilen boyut, görüntü alma kriterlerine ve kullanılan mikroskop türüne bağlı olarak değişebilir. Seçim, genetik suşlar arasında da değişebilir, çünkü daha fazla oositli yumurtalıklar, daha iyi otomatik oosit tespiti için daha küçük boyutlu seçimler gerektirecektir.
   3. Boyut seçiminden sonra, otomatik olarak belirlenen Model PSF uzama ve Arka Plan çıkarma özelliklerini etkinleştirin. Filtre Noktaları paneline gitmek için tek ileri oku seçin. Kalite filtresini ekleyin ve bir eşik belirleyin. Oosit sayılarının doğru tahmin edilmesini sağlamak için, eşik oositlerin çoğunu seçen bir eşik değeri seçecek şekilde ayarlandığında görüntüyü büyütün. Otomatik sayımları tamamlamak için çift oka tıklayın.
   4. Kaçırılan oositleri seçmek için Düzenle sekmesini kullanarak seçilen oositleri manuel olarak kontrol edin veya otomatik eşik tarafından seçilen oosit olmayan parçacıkların seçimini kaldırın. Daha fazla analiz için verileri Genel sekmesinin altındaki İstatistikler sekmesine kaydedin.
      NOT: Noktaları saymak için kullanılan parametreler kaydedilebilir ve başka bir numune seti için kullanılabilir, ancak toplu analiz çalıştırılmadan önce manuel kontrol yapılması önerilir.
   5. Parametreleri depolamak için Oluşturma sekmesine tıklayın ve Toplu İşlem için Parametreleri Depola'ya tıklayın.
      NOT: Nükleer belirteçler (GCNA+ oositler, Şekil 4A) nokta özelliği ile kolayca tanımlanır ve çok fazla manuel ayarlama gerektirmeyebilir. Bununla birlikte, sitoplazmik belirteç (DDX4 + oosit, Şekil 3 (P28, kapalı ok) ve Şekil 4A), doğru oosit boyutunun / tipinin tanımlanmasını sağlamak için daha fazla manuel ayarlama gerektirecektir.

10. Yumurtalıklarda protein ekspresyonunun ölçülmesi

NOT: Hem Noktalar özelliğini (bölüm 9 ve adım 10.1) hem de Yüzeyler özelliğini (adım 10.2) kullanarak belirli belirteçlerin oosit ekspresyonunu ölçmenin birkaç yolu vardır. Lekeler özelliği, nükleer belirteçler (GCNA) gibi farklı lokalizasyon paternlerine sahip proteinler için kullanılabilir ve Yüzeyler özelliği, E15.5 ve E18.5 yumurtalıklarındaki LINE-1 ORF1p yoğunluklarının ölçüldüğü Şekil 5A'da gösterildiği gibi düzgün olmayan lokalizasyon paternlerine sahip proteinler için kullanılabilir. İlgilenilen proteinin yoğunluğunu iki örnek (örneğin, zaman noktaları, tedaviler veya genotipler) arasında hesaplamak ve karşılaştırmak için, aynı özelliklere sahip görüntüler toplayın. Diğer numuneler için saklanabilecek ve kullanılabilecek parametreleri belirlemek için daha yoğun sinyalli numuneler kullanın.

1. Lekeler özelliği ile protein ekspresyonunu elde etmek için, önce oositleri vurgulandığı gibi tanımlayın (bölüm 9).
   1. Ardından, Noktalar özelliğinin altında, İstatistikler sekmesini ve ardından Ayrıntılı sekmesini seçin. Aşağı oka tıklayın ve altında farklı ölçümler içeren başka bir sekme açacak olan Belirli Değerler'i seçin. Yüzey üretimi için kullanılan kanalın Yoğunluk Ortalamasını seçin (veya Yoğunluk Medyanı gibi diğer yoğunluk ölçümlerini seçin).
   2. Birleşik/ortalama istatistiksel bilgileri elde etmek için, Ortalama Değerler ölçütünü seçin. İşiniz bittiğinde, daha fazla analiz için verileri dışa aktarın ve kaydedin.
2. Yüzeyler özelliğiyle protein ifadesini elde etmek için görüntüyü açın, 3B Görünüm seçeneğini belirleyin ve Algoritma panelini açmak için Sahne panelinde Yeni Yüzeyler Ekle işlevini etkinleştirin. Gerekirse tüm algoritma ayarlarının seçimini kaldırın ve Kaynak Kanal'a gitmek için tek ileri oka tıklayın.
   1. Ölçülecek antikor sinyalinin bulunduğu kanalı seçin. Seçilecek diğer özellikler kullanıcıya özel seçeneklerdir. Burada, LINE-1 sinyali bir işaretleyici olarak kullanılmıştır. Yüzey Ayrıntısı ve Arka Plan Çıkarma (Yerel Kontrast) değerleri sırasıyla 1,42 ve 5,33 varsayılan değerlerinde tutulmuştur.
   2. Eşik paneline gitmek için ileri okunu tıklatın. Her iki örnekte de karşılaştırılabilir bir eşik değeri seçin (örneğin, burada, bir eşik seçmek için E18.5'teki LINE-1 ifadesi kullanılmıştır). Varsayılan Çekirdek Nokta Çapı 7,10 olan Etkinleştir'i seçin (bu değer görüntüler için en uygun bulunmuştur, ancak özelliklerin beklenen piksel boyutuna bağlı olabilir).
   3. Filtre Yüzeyleri paneline gitmek için ileri okunu tıklatın. Bir Kalite filtresi kullanıldı ve değeri, Eşik değerinde olduğu gibi, her iki yumurtalık örneğindeki proteinlerin ekspresyonuna dayandırın. filter özelliği seçildikten sonra, yüzeyin oluşturulmasını tamamlamak için çift ileri oka tıklayın.
   4. Yoğunluk değerlerini elde etmek için İstatistikler sekmesini ve ardından Ayrıntılı sekmesini seçin. Aşağı oka tıklayın ve altında farklı ölçümler içeren başka bir sekme açacak olan Belirli Değerler'i seçin.
   5. Yüzey üretimi için kullanılan kanalın Yoğunluk Ortalamasını seçin (veya Yoğunluk medyanı gibi diğer yoğunluk ölçümlerini seçin).
   6. Birleşik/ortalama istatistiksel bilgileri elde etmek için, Ortalama Değerler ölçütünü seçin. İşiniz bittiğinde, daha fazla analiz için verileri dışa aktarın ve kaydedin (Şekil 5C).

11. Hasarlı yumurtalıktaki toplam oosit sayılarının hesaplamalı düzeltme ile tahmin edilmesi

NOT: Diseksiyon sırasında küçük bir yumurtalık hasarı meydana gelirse, toplam yumurta sayısını hesaplamalı olarak tahmin etmek mümkün olabilir. Şekil 6'da gösterildiği gibi yumurta sayısı tahmini için aynı suş ve gelişim aşamasından sağlam yumurtalıkların kullanılması önerilir. E15.5'te yumurtalıklarla yapılan simülasyonlar, %≥30'luk bir kaybın düzeltilmesinin gerçek sayılardan önemli bir sapmaya neden olduğunu göstermektedir (Şekil 6C).

1. IMARIS ile bozulmamış yumurtalıkların görüntülerini açın ve Çerçeve özelliğini seçin. Çerçeve Ayarları altında, Kutu, Kılavuz, Onay İşaretleri ve Eksen etiketlerini seçin. X/Y/Z Konumu sekmesi altında, tüm X /Y/Z konumlarında 200 μm boşluklu onay işaretleri oluşturmak için 200 μm'yi seçin.
   NOT: Onay işaretleri, belirli bir bölgedeki oositleri tanımlamak için X, Y ve Z düzlemlerinde bir ızgara/cetvel oluşturur.
2. Bölüm 9'da vurgulandığı gibi oositleri tanımlamak için Lekeler özelliğini etkinleştirin (Şekil 4). Noktalar özelliğindeki Noktalar Stili/Kalite sekmesi altında Küre'yi seçerek simülasyon için kullanılan tüm bozulmamış yumurtalıklarda tanımlanan oositleri kullanarak bir 3B model oluşturun.
   NOT: Piksel Genişliği , Noktalar Stili/Kalite sekmesi altında da değiştirilebilir.
3. Adım 11.1'de oluşturulan kutuyla, bozulmamış yumurtalıkların 3B modellerini Şekil 6A'da gösterildiği gibi aynı yönde hizalayın.
4. 200 μm onay işaretlerini kullanarak (adım 11.1), her yumurtalık hacminin% 50'sine giren oositleri seçin. Lekeler özelliğine tıklayın ve Şekil 6A'da gösterildiği gibi %50 bölgesine giren oositleri renge göre sınıflandırmak için Etiketleri Düzenle'yi seçin.
   NOT: Yumurtalar bir bölgede sınıflandırıldıktan sonra, her sınıfa giren oosit sayısı sağlanacaktır.
5. %50 bölgesini yakınlaştırın ve oosit tanımlaması için daha küçük bir cetvel yapmak üzere onay işaretlerini 200 μm'den 50 μm'ye değiştirin. Tüm görüntülerde yakınlaştırma yüzdesini koruyun. Kılavuz olarak 50 μm onay işaretleriyle, %50 bölgesini beş eşit parçaya bölün.
   NOT: Her bir parçadaki oositler, Şekil 6A'da vurgulandığı gibi hacmin% 10'unu temsil edecektir; burada bozulmamış bir yumurtalık, yumurtalıkların üst yarısındaki, her renk% 10'luk bir hacimsel bölgedeki oositleri temsil eden beş farklı renkle sınıflandırılmış yumurtaları gösterir.
6. Her %10'luk bölgedeki yumurta sayılarını Şekil 6A,B'de gösterildiği gibi kaydedin. % 10, 20, 30, 40 ve% 50'lik artışlar için ortalama yumurta sayısını hesaplayın.
7. Hasarlı kısmi yumurtalıkta oosit sayıları elde etmek için 11.1 ila 11.6 arasındaki adımlarda vurgulananları kullanın. Hasarlı yumurtalığı sağlam yumurtalıklarla aynı yönde konumlandırın ve yukarıda açıklandığı gibi eksik hacmi / yüzdeyi tahmin edin.
8. Tüm yumurtalıktaki toplam oosit sayısını tahmin etmek için, kısmi yumurtalıktan elde edilen sayıya benzer bir hacim için hesaplanan ortalama oosit sayısını ekleyin (Şekil 6B).

Sonuçlar

Tüm yumurtalığın immün boyanması ve görüntülenmesi, aynı teknik ve belirteçler kullanılarak farklı gelişim evrelerinde yumurtalıklardaki oositlerin veya protein ekspresyonunun görüntülenmesini ve nicelleştirilmesini sağlar (Şekil 3). Bu protokol, yumurtalıkların birden fazla aşamada ve birden fazla fare suşundan analizinin gerekli olduğu büyük ölçekli bir proje için geliştirilmiştir. Burada, genetik analiz için standart bir suş olan C57BL6 / J suşu için t...

Tartışmalar

Bu makalede, germ hücresi niceliği ve protein lokalizasyonu için yüksek verimli ve karşılaştırmalı çalışmalar için prenatal ve postnatal yumurtalıklar için ayrıntılı bir 3D immünoboyama ve görüntüleme protokolü sunulmaktadır. Bu protokolü, yumurtalıklardaki oosit sayılarını (N = 6-12), 2-4 24 kuyucuklu plakanın tipik olarak bir seferde işlendiği 10-16 farklı suştaki altı gelişimsel zaman noktasında analiz etmek için geliştirdik. Bu yöntem diğer organlar veya hücresel belirteçler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Benchtop Incubator	Benchmark Scientific	H2200-H	37 °C incubator
Bovine Serum Albumin (BSA)	VWR	97061-416
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	000664	mouse inbred strain
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D1435	Hazardous material
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S6021
Dumont #5 Forceps	FST	91150-20
FastWells Reagent Barriers	GraceBio	664113	Sticky and flexible silicone gasket (adhesive well)
Fine Scissors	FST	91460-11
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025
Glycine	ThermoFisher Scientific	BP381-500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21246	Dilution 1:1000
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555	Invitrogen	A-21434	Dilution 1:1000
Goat serum	Sigma-Aldrich	G9023
IMARIS Software	Oxford Instruments	Version 9.7.0	Image visualization and analysis software
Insight X3	Spectra-Physics	InSight X3 Tunable Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
LASX software	Leica	Version 3.5.6	Image acquisition software
Leica DIVE/4TUNE/FALCON	Leica	Leica Dmi8, 2P-M-ready: # 158005406	Multiphoton Microscope
MaiTai HP	Spectra-Physics	Mai Tai DeepSee One Box Ultrafast Laser	Laser for Multiphoton Imaging
Masterflex Pump Controller	SPW Industrial	Model: 7553-50	Peristaltic pump for perfusion
Mayo Scissors	FST	14010-17	5” –7” blunt/blunt scissors for decapitation
Micro Cover Glasses, Square, No. 1.5 25x25mm	VWR	48366-249
Mini BioMixer	Benchmark Scientific	B3D1020	shaker/nutator for 37 °C incubator
Nikon Ergonomic SMZ1270	Leica	SMZ1270	stereomicroscope
Paraformaldehyde 16% (formaldehyde aqueous solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	Hazardous material
PBS Tablets, Phosphate-buffered Saline	ThermoFisher Scientific	BP2944100	Dissolve in Milli-Q water
Penicillin-Streptomycin, 200x, Dual Antibiotic Solution	ThermoFisher Scientific	ICN1670249
Polyvinyl alcohol (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Quadrol (N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropylethylenediamine)	Sigma-Aldrich	122262
Rabbit anti-DDX4/MVH	Abcam	ab27591	Dilution 1:500
Rabbit anti-LINE-1 ORF1p	Abcam	ab216324	Dilution 1:500
Rat anti-TRA98/GCNA	Abcam	ab82527	Dilution 1:500
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002	Hazardous material
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	Hazardous material
Sucrose	ThermoFisher Scientific	S0389
Tekmar Orbital Shaker	Bimedis	VXR-S10	shaker for room temperature
Triethanolamine	Sigma-Aldrich	90279
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
UNOLOK Infusion Set	MYCO Medical	7001-23	needles for perfusion
Urea	Amresco	97061-920
X-Cite 120LED	Excelitas	S/N XT640-W-0147	low-power LED fluorescence lamp