Polikistik Over Sendromu Fare Modelinde Hepatik Glikoz Üretiminin Değerlendirilmesi

Özet

Bu çalışma, polikistik over sendromu fare modelinde hepatik glikoz üretiminin hem oruç hem de glikoz bakımından zengin durumlarda kuyruk damarı yoluyla stabil bir izotopik glikoz izleyici kullanılarak doğrudan ölçülen ölçümünü açıklar.

Özet

Polikistik over sendromu (PKOS), insülin direnci ve glikoz intoleransı gibi glikoz metabolizması bozuklukları ile sonuçlanan yaygın bir hastalıktır. Düzensiz glikoz metabolizması hastalığın önemli bir tezahürüdür ve patogenezinin anahtarıdır. Bu nedenle PKOS'ta glikoz metabolizmasının değerlendirilmesini içeren çalışmalar son derece önemlidir. Çok az çalışma radyoaktif olmayan glikoz izleyiciler kullanarak doğrudan PKOS modellerinde hepatik glikoz üretimini ölçtü. Bu çalışmada, gaz kromatografisi - kütle spektrometresi (GCMS) aracılığıyla kararlı bir izotopik glikoz izleyicisi olan M+2 zenginleştirmesini ölçerek bir PKOS fare modelinde hepatik glikoz üretim oranının ölçülmesi için adım adım talimatları tartışıyoruz. Bu prosedür, stabil izotopik glukoz izleyici çözeltisinin oluşturulmasını, kuyruk damar kateteri yerleşiminin kullanılmasını ve aynı farede hem oruç hem de glikoz bakımından zengin durumlarda glikoz izleyicinin infüzyonunu içerir. [^6,6-2H2]glikozun zenginleştirilmesi GCMS'de pentaasetat türevi kullanılarak ölçülür. Bu teknik, hepatik glikoz üretim oranının doğrudan ölçülünü içeren çok çeşitli çalışmalara uygulanabilir.

Giriş

Polikistik over sendromu (PKOS), üreme çağındaki kadınların %12-20'sinde görülen yaygın bir ^{hastalıktır1,2}. Polikistik overler, düzensiz mensesler ve hiperandrogenemi klinik veya laboratuvar kanıtlarını içeren değişken fenotiplerle sonuçlanan karmaşık bir hastalıktır ve tipik olarak bir kadın üç kriterden ikisini karşıladığında teşhis ^edilir3. PKOS'un baskın bir yönü ve patogenezinde önemli bir faktör, hastalığı olan kadınlarda bulunan metabolik dengesizliklerdir. PKOS'li kadınlarda insülin direnci, glikoz intoleransı, obezite ve metabolik sendrom görülme sıklığı daha yüksektir3,4,5,6. İnsülin direnci sadece hastalığın bir tezahürü değildir, aynı zamanda yumurtalıktaki luteinize edici hormonun etkisini etkileyerek patogenezine katkıda bulunduğu ve böylece androjen üretiminin artmasına yol açtığı ^{düşünülmektedir7,8}. İnsülin direncinin birkaç olası kökene sahip olduğu düşünülmektedir, ancak çalışmalar bunun anormal insülin reseptör sinyalleri örüntülerinden kaynaklanabileceğini ^{göstermektedir9,10}. Çalışmalar, hiperinsülinemik-ögllikemik kelepçenin altın standart tekniğini kullanarak PKOS hastalarında insülin direncini değerlendirmiş11,12,13,14,15. VKİ'den bağımsız olarak PKOS'lu kadınlar, kontrollere kıyasla daha yüksek insülin direnci seviyelerine sahiptir. Aşırı glikoz üretimine yol açan insülin direnci bozukluklarında glikoz üretimi üzerinde insülin kontrolü bozulur. Örneğin, diyabetik hastalarda glukogenez oranları artmış ve glikojenoliz baskılanması ^bozulmuş16. Ayrıca diyabetik sıçanlarda glikoz üretiminin baskılanmasında bozulma ^{gözlenmiştir17}. Kelepçe çalışmaları insülin direnci ölçümü verebilse de, PKOS'ta çok az çalışma oruç ve beslenen durumlarda glikoz üretiminin doğrudan ölçümüne odaklanmaktadır. Bu, radyoaktif olmayan izotopik glukoz izleyici infüzyonu ve kütle spektrometresi yoluyla ölçüm kullanılmasını gerektirir.

Hayvan modelleri PKOS araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hem yağsız hem de obez tipi PKOS murine modelleri androjenlerin prenatal, prepubertal veya post-ergenlik döneminden sonra uygulanmasıyla ^{oluşturulmuştur18}. Kemirgen PKOS modelleri de ilgili kontrollerine kıyasla metabolik farklılıklar gösterir. Laboratuvarımızdan elde edilen önceki veriler, PCOS fare modellerinde (yalın ve obez) insan PKOS literatürü ile uyumlu anormal glikoz tolerans testleri (GTT) ^{göstermiştir19}. Yalın ve obez bir hayvan modelinin kullanılması metabolik farklılıkların daha fazla araştırılmasını sağlar. Özellikle, bu model doğrudan izotopik glikoz izleyicileri kullanılarak glikoz üretim oranının değerlendirilmesine izin verir. En sık kullanılan stabil izotopik glukoz izleyicilerinden biri [6,6-2H2]glikozdur. [6,6-2H2]glikoz zenginleştirme, daha önce açıklandığı gibi bir pentaasetat türevi kullanılarak ölçülebilir20.

Bu çalışmada amacımız izotopik glikoz infüzyonu kullanarak PKOS farelerinde oruç ve glikoz bakımından zengin durumda hepatik glikoz üretim oranını ölçmekti. Bu teknikler glikoz kinetiği içeren çok çeşitli deneylere uygulanabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

1. [6,6-2H2] glikozun hazırlanması

1. İşlemden bir gün önce, normal salin içinde kararlı izotop glukoz izleyicisini hazırlayın. Bu deney için plazma glukoz görünüm oranını ölçmek için izleyici olarak [_6,6-2H2]glikoz kullanılmıştır.
   NOT: Bu deneyde, oruç sırasında glikoz üretimi ve glikoz bakımından zengin koşullar ölçüldü, bu nedenle glikoz izotop iki farklı preparat halinde hazırlandı. Çözeltileri, son infüzyon dozu sırasıyla 1 mg/(kg·dk) ve 2 mg/(kg·dk)'a yakın olacak şekilde hazırlayın. Bu konsantrasyonlar daha önceki birkaç pilot çalışma ile optimize edilmiştir.
2. Steril ve pirojen içermeyen [6,6-2H2]glikoz'u steril %0,9 sodyum klorür çözeltisinde eriterek oruç durumunu temsil etmek için ilk infüzyonu sadece [6,6-2H2]glikoz ile hazırlayın.
3. Fed durumunu simüle etmek için steril % 0,9 sodyum klorür çözeltisinde izotopik olmayan glikoz (~20 mg/kg·dk) ile birlikte [6,6-2H2]glikoz izleyicisini çözerek ikinci infüzeyi hazırlayın.
   NOT: Mevcut deneyde, (~) 1.08 mg/(kg·dk) (açlık durumu) ve (~) 1.9 mg/kg·dk (glikoz bakımından zengin durum) seviyesinde [_6,6-2H2]glikoz astarlı sabit oran infüzyonu kullanılmıştır. 'Glikoz bakımından zengin durumu' taklit etmek için D-glikoz infüzyon oranı (~) 18,8 mg/(kg·dk) olarak belirlendi.
4. Çözeltiler hazırlandıktan sonra, çözeltileri 0,22 μm filtre ile steril filtreleyin ve 4 °C'de saklayın. Çözeltileri infüzyondan önce oda sıcaklığına ısıtın. Çözeltileri önceden etiketlenmiş 1 mL şırınna yükleyin.
5. Pompayı, yalnızca izleyiciyi içeren ilk infüzyonun (bazal durum için) astarlı sabit oran infüzyonunu kolaylaştırmak için ayarlayın ve pompayı 3 saat boyunca 150 μL / s'de izotopun sabit bir oran infüzyonu için programlayın.
6. 3 saat oruç kurulumunun sonunda, ilk infüzyon şırıngını izotopik izleyici ve D-glikoz içeren ikinci infüzyon şırıngıyla değiştirin (simüle edilmiş fed durumu için) ve infüzyonu 600 μL / s'de 15 dakika boyunca astar edin. Pompayı ek 3 saat için 150 μL/s sabit bir hız infüzyona ayarlayın.

2. infüzyon deneylerinin kurulumu

1. Fareleri ev kafeslerinden çıkarın ve deney başlamadan 3 saat önce oruç kafeslerine yerleştirin. Bu deney için, C57BL / 6J suşundan 4 aylık bir dişi fare kullanıldı.
   NOT: Bu prosedür, minimal invaziv yapısı göz önüne alındığında işlemden önce veya işlem sırasında herhangi bir analjezi gerektirmez.
2. Fareleri insülin pompası başına belirli sayıda fareye gruplandırarak kafes ekipmanını monte edin. Fareler için bireysel tezgahlar yapmak için bölümleri düz, kararlı bir tabanın üzerine yerleştirin. infüzyonun çalışması için kuyruk damar kateterine erişime sahip olmak önemlidir, bu nedenle kafes kapısının dibinde bir çentik olduğundan emin olun.
   NOT: Videoda gösterilen kafesler bu deney için özel olarak yapılmıştır. Kafesler berraktır ve pleksiglastan yapılmıştır. Bölümlerin üzerine oturduğu düz, kararlı bir taban (standart kafes ekipmanı) vardır. Bu kurulum, tablonun yüksekliğine ve deneycinin gereksinimlerine bağlı olarak birkaç farklı ortamda kurulum kolaylığı sağlamak için birkaç parçadan oluşur. Kafesin kapısı kapanmak için kayar ve kuyruğun sığmasını sağlamak için altta bir çentik vardır.
3. 1 mL bazal infüzyon içeren 1 mL şırınnaları monte edin ve ardından 0,28 mm ID x 0,61 mm polietilen boruyu kullanarak infüzyon pompası tüpüne bağlayın.
4. Oranı bazal hız olan 150 μL/sa'ye ayarlayarak infüzyon pompasını hazırlayın.
5. Bir su banyosuzları 48 °C'ye ısıtın.
6. 30 G 0,5 inç iğneler, 0,3 mm kimlik x 0,64 mm silastic boru ve 1 inç şeffaf transpore bant içeren su banyosuna bitişik kateter yerleştirme istasyonunu hazırlayın.
7. 3 saat oruç tuttuktan sonra, aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan kateter takma işlemine başlayın.

3. Kateter takılması

1. Bir fare seçin ve kuyruğa erişimi olan güvenli bir tutucuya yerleştirin. Ne kullanılacağına bir örnek, kuyruk için bir çentikle ikiye kesilmiş bir şişedir. Tutucuyu düz bir tabana yerleştirin. Kateter takılması için daha fazla boşluk sağlamak için kuyruğun proksimal kısmının üzerine bir parça bant yerleştirin.
   NOT: Bu görev için seçilen bant türü orta mukavemete ve yapışkanlığa sahip olmalıdır. Bu deneyde çok amaçlı, kağıt bazlı etiketleme bandı hafif ve soyulması kolay olduğu için kullanılmıştır.
2. Kateteri (0,3 mm silastic boruya bağlı 30 G iğne ve PE- 10 gaz sterilize edildi) steril heparinize salin yıkama içeren 1 mL şırıngaya takarak hazırlayın. Kateteri nazikçe yıkayın.
3. Fareyi su banyosuna getirin ve kuyruğu yaklaşık 30-45 sn su banyosuna yerleştirin. Bu, kateter yerleşimi için kuyruk vaskülatını genişletmeye yardımcı olur.
4. Kateter yerleştirme işlemini steril koşullarda gerçekleştirin. Kuyruk ısındıktan sonra kuyruğu benzalkonyum mendillerle temizleyin ve kuyruğun proksimal ucunda turnike olarak daha önce kuyruğun şekline konturlanmış küçük bir bakır, dişsiz timsah kelepçesi yerleştirin. Yanal kuyruk damarını büyüteç altında görselleştirin ve ardından kateteri dikkatlice kuyruk damarına yerleştirin ve iğneyi geri çekin. Kateterin açıklığını sağlamak için çözeltiyi hafifçe yıkayın.
5. Kateteri sabitlemek için ekleme bölgesinin etrafına 1 inç transpore bant parçası sarın. Küçük turnikeyi kuyruktan çıkarın.

4. İnfüzyon kurulumu ve ilk infüzyon

1. Fareyi tek tek kafesine yerleştirin ve kayan kapıyı kapatın, kuyruğun çentikten çıkıntılı olduğundan ve kafesin dışında kaldığından emin olun.
2. Kafesin taban plakasına sabitlemek için tüm kateter ve kuyruğun üzerine ek bir bant yerleştirin. Bu adım için çok amaçlı renkli, etiket bandı kullanılmıştır.
3. Floşun kuyruk damarı kateterinden çıkarın ve demlenme hattını pompadan bağlarken geri akışı önlemek için kateterin siltik tüpüne küçük bir kelepçe yerleştirin.
4. Güvenli bir şekilde bağlandıktan sonra, kelepçeyi çıkarın ve infüzyondan oluşan astar çözeltisi ile yıkayın. Çözeltinin tüpte açık olduğundan ve kan lekeli olmadığından emin olun.
5. Toplam yaklaşık 3 saat boyunca çalıştığından emin olmak için infüzyonun başlama zamanını not edin. Aynı anda birden fazla kafes kullanılıyorsa, infüzyon sürelerini etkili bir şekilde yönetmek için kademelendirilmelidir.
6. infüzyon çizgilerinin düzgün çalıştığından, kapağı fareden çıkarın. Farenin etrafına standart yatak takımları yerleştirin.
7. İnfüzyonu izleyiciyi içeren ilk infüzyonla başlatın ve sürekli olarak 3 saat çalıştırın. infüzyon süresince, infüzyon hatlarının yanı sıra farelerin refahını kontrol etmeye devam edin. infüzyon borusundan düzgün bir şekilde emin olun ve hat bağlantı noktalarından sızıntı olmamasını sağlayın.

5. Kan örneklemesi

1. İlk infüzyon tamamlandıktan sonra, infüzyonu durdurun, geri akışı önlemek için kateter üzerindeki sylaztik boruya bir kelepçe yerleştirin. Kan toplamak için kateteri bozmadan fareleri muhafazalarından yavaşça çıkarın. Kan almak için kafeslerin yakınındaki bir yere yerleştirin. Bu deney için, fareler 4 mm'lik bir mızrak kullanarak yanak venipunkture geçirdiler.
2. İstenilen şişede ~ 75 μL kan toplayın. Kütle spektrometresine hazırlık için örnekleri deproteinize etmek için, 500 μL asetona yaklaşık 15 μL kan ekleyin. Kalan kan, kan şekeri seviyesini glukometre ile kontrol etmek için kullanılabilir ve/veya gelecekteki hormon tahlilleri için plazmayı ayırmak için santrifüjlenebilir.

6. İkinci infüzyon

1. Boruyu şırındlardan ayırarak infüzyonları şırındıcı pompalarından çıkarın ve glikozla birlikte izleyiciyi içeren ikinci infüzyonla değiştirin. Glikoz bakımından zengin izotopik glukoz infüzyonunu kullanarak 4.2 ile 4.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
   1. Sabit bir duruma ulaşmak için, 15 dakika boyunca 600 μL / s'de ikinci infüzyonun bir bolus'ını çalıştırın. Her kafes grubunun başlangıç saatine dikkat edin. Toplam infüzyon süresinin 3 saatini tamamlamak için infüzyon oranını 150 μL/s'ye düşürin.
2. 5.1 ve 5.2 adımlarını yineleyin.
3. infüzyon pompasını durdurun ve kuyruk damar kateterini nazikçe çıkarın, kanama durana kadar kateter bölgelerine basınç uygulayın ve fareleri ev kafeslerine geri verin.
4. Kafes kurulumunu standart sabun ve suyla iyice santize edin ve dezenfekte edin.
   NOT: Bu bir hayatta kalma prosedürüdür. Fareler kafeslere geri döndürülebilir ve gerekirse daha fazla deneyim için tutulabilir. Yeterli hayvan refahını sağlamak için bu prosedürü takip eden en az bir hafta boyunca daha fazla deneyimlenme yapılmaması önerilir.

7. Kütle spektrometresi

1. Kütle spektrometresi için örnekleri gönderin.
2. Analiz
   1. Pentaasetat türevini kullanarak [6,6-2H2]glikozun gaskromatografi - kütle spektrometresi (GCMS) ile izotopik zenginleştirmesini ^{ölçün21,22}. Kısaca, bu yöntem glikozun pentaasetat türevinin hazırlanmasını ve ardından GCMS ^20,22 kullanılarak örnek analizi ^içerir.
3. Hesaplama
   1. Tüm kinetik ölçümleri sabit durum koşullarında gerçekleştirin. Toplam plazma glukoz görünüm oranı (glikoz _Ra), kurulan izotop seyreltme denklemleri kullanılarak plazmadaki [6,6-2H2]glikozun M+² zenginleştirilmesinden hesaplanmıştır21. Sabit durum koşullarında, glikozun ortaya çıkma oranının glikozun kaybolma hızına eşit olduğu varsayılıyor. Endojen glikoz üretim oranı (mg/(kg·dk)) (GPR) = glikozRa - eksojen glikoz.

Sonuçlar

Daha önce tanımlanmış izotop seyreltme denklemleri kullanılarak, toplam plazma glikoz oranı (glikozRa), _pentaasetat türevi kullanılarak oruç ve glikoz bakımından zengin koşullarda [6,6-2H2]glikozun M+₂ zenginleştirilmesinden hesaplanmıştır21. Sabit durum koşullarında, glikozun ortaya çıkma oranının glikozun kaybolma hızına eşit olduğu varsayılıyor. Kontrol grubunda glikoz bakımından zengin koşullarda 6 saat oruç sonrası t...

Tartışmalar

Hiperglisemi ve anormal glikoz metabolizması/homeostaz PKOS'un özellikleridir. Kan şekeri seviyesi, hormon ve enzimlerin kontrolü altında glikogenoliz ve glukogenez ve glikogenez yoluyla diyet ve glikoz üretiminden elde edilen glikozun bir kombinasyonu ile korunur. Hepatik glikoz üretimi, dolaşımdaki glikoz seviyelerinin artmasıyla bastırılır. Anormal glikoz metabolizması bozukluklarında, glikoz üretiminin baskılanması düzenlemesi hiperglisemiye yol açan tehlikeye girer. Birçok çalışma bi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride solution	McKesson	275595
10 mL BD Luer-Lok tip syringe	VWR	75846-756	Two syringes per animal (one for isotopic glucose solution, one for glucose-rich isotopic solution)
1-inch clear transpore tape	3M	70200400169
1-inch Labeling tape	Fisher	GS07F161BA	Brand is example
5 mL syringe containing heparanized saline flush	McKesson	191-MIH-2235	One can also prepare a heparin flush solution (10 units/mL heparin in 0.9% sodium chloride)
5 mm Medipoint Goldenrod animal lancets	Fisher Scientific	NC9891620	5 mm if animal is between 2 and 6 months
Acetone	Sigma-Aldrich	650501
Advanced hot plate stirrer	VWR	97042-602	Brand is example
BD 27 gauge 0.5 inch needles	Health Warehouse	A283952
BD 30 gauge 0.5 inch needles	Medvet	305106
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
BD Intramedic Polyethylene (PE) tubing 0.28 mm ID x 0.61 mm	VWR	63019-004
Beaker, 1000 mL			Any brand
Caging pellets
Clear VOA glass vials with closed-top cap	Fisher Scientific	05-719-120	For storage of acetone and blood draw samples
Copper toothless alligator clamp for tourniquet	Amazon		Any Brand; smooth toothless alligator clips made of solid copper
D-(+)-glucose >99.5%	Sigma-Aldrich	G8270
D-glucose (6,6-D2, 99%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-349-PK
Dow Corning silastic tubing 0.3 mm ID x 0.64 mm OD	VWR	62999-042
Magnifying glass	Amazon		Any brand; similar to LANCOSC Magnifying Glass with Light and Stand
Microbalance	Ohaus Adventurer Pro	AV264C	Any similar model with 0.0001g accuracy can be used
Nalgene bottle, 500 mL	Sigma-Aldrich	B0158-12EA	Or any Similar brand; saw in half (including lid) and cut tail-sized notch in the bottom
PHD Ultra multi-syringe pump	Harvard Apparatus	70-3024A
Plexiglass sheet			Any brand; to stabalize mouse during catheter insertion
Plexiglass sheets and dividers			Any brand; used to cage mice during infusion