JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

RNA teslimatı da dahil olmak üzere ilaç dağıtım sistemlerinde (DDS) mikroakışkan bazlı lipid nanopartikül (LNP) üretim yöntemleri dikkat çekmiştir. Bu protokol, iLiNP adlı orijinal mikroakışkan cihazımızı kullanarak imalat, LNP (siRNA yüklü LNP) üretimi ve LNP değerlendirme süreçlerini açıklar.

Özet

Fonksiyonel lipid nanopartiküllerinin (LNP) geliştirilmesi, ilaç dağıtım sistemleri (DDS) alanındaki en önemli zorluklardan biridir. Son zamanlarda, LNP tabanlı RNA dağıtım sistemleri, yani RNA yüklü LNP'ler RNA tedavisi için dikkat çekmektedir. Özellikle, mRNA yüklü LNP aşıları COVID-19'u önlemek için onaylandı ve böylece yeni nesil nanotıpların geliştirilmesine doğru paradigma değişimine yol açtı. LNP tabanlı nanotıplar için LNP boyutu, LNP biyodistribution ve LNP performansını kontrol etmede önemli bir faktördür. Bu nedenle, hassas bir LNP boyut kontrol tekniği LNP üretim süreci için vazgeçilmezdir. Burada, iLiNP adlı mikroakışkan bir cihaz kullanarak boyut kontrollü LNP üretimi için bir protokol bildiriyoruz. siRNA yüklü LNP'ler de iLiNP cihazı kullanılarak üretilir ve in vitro deney ile değerlendirilir. SiRNA yüklü LNP'ler, Z potansiyeli, siRNA kapsülleme verimliliği, sitotoksiklik ve hedef gen susturma aktivitesi dahil olmak üzere LNP boyutu için temsili sonuçlar gösterilmiştir.

Giriş

Lipid nanopartikül (LNP), RNA dağıtım sistemleri için en yaygın kullanılan nanokarrierlerden biridir. Son zamanlarda, mRNA yüklü LNP'ler COVID-191,2,3'ün önlenmesi için aşı olarak onaylanmıştır. Genel olarak, LNP'nin büyüklüğü, gen susturma veya protein ifadesi4,5,6 dahil olmak üzere biyodistribution ve ilaç dağıtım sistemleri (DDS) performansında çok önemli bir rol oynar. Bu nedenle, LNP üretim süreci için kesin bir LNP boyut kontrol yöntemi gereklidir.

Boyut kontrollü LNP'lerin üretimi için mikroakışkan cihazlar yıllar içinde dikkat çekmiştir7. 2018 yılında, ilk Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı siRNA yüklü LNP'ler (örneğin, Onpattro) mikroakışkan cihaz8,9 kullanılarak geliştirilmiştir. Mikroakışkan bazlı LNP üretim yönteminde, bir lipid çözeltisi ve sulu bir çözelti mikroakışkan cihaza ayrı ayrı sokulur ve daha sonra mikrokanete karıştırılır. Karıştırma verimliliğini artırmak için, kaotik karıştırıcı cihazı LNP üretimi için kullanılmıştır10,11,12. Kaotik karıştırıcı cihaz, belirli boyutlu LNP'ler üretmeyi mümkün kılar.

Şaşırtıcı yapılarla donatılmış invaziv lipid nanopartikül üretimi (iLiNP) adlı basit bir mikroakışkan cihaz, LNP boyutunu tam olarak kontrol etmek için geliştirilmiştir13,14. Kaotik karıştırıcı cihazla karşılaştırıldığında, iLiNP cihazı 10 nm aralıklarla 20 ila 100 nm arasında değişen LNP boyutunu kontrol edebildi. Buna ek olarak, iLiNP cihazı siRNA yüklü LNPs6, mRNA yüklü LNPs15, riboniklioprotein yüklü LNPs16 ve eksozom benzeri LNPs17 üretti. Bu makalenin amacı, iLiNP cihazının imalat vesiRNA yüklü LNP üretim sürecini tanıtmak ve iLiNP cihazı tarafından üretilen LNP değerlendirme sürecini tanımlamaktır.

Protokol

1. iLiNP cihazının imalatı

NOT: iLiNP cihazı standart yumuşak litografi yöntemi kullanılarak üretilmiştir18. Ayrıntılı imalat protokolü daha önce 10,13 bildirilmiştir.

  1. SU-8 kalıp imalatı
    1. SU-8 3050'i 3 inç silikon gofrete dökün. 100 μm kalınlığında bir SU-8 tabakası elde etmek için silikon gofreti döndürün.
    2. Silikon gofretleri 65 °C'de bir ocak üzerine 5 dakika ve 95 °C'de 45 dakika boyunca yerleştirerek pişirin.
    3. Pişirdikten sonra, silikon gofredi masaüstü maskesiz litografi sisteminin sahnesine yerleştirin.
    4. Silikon gofretini bir pozisyon başına 1,5 sn için 365 nm'de UV ışığına maruz bırak.
      NOT: Bu deneyde masaüstü maskesiz litografi sistemi kullanılmıştır. Sistem, UV ışığını otomatik olarak mikrokanenin bölünmüş ışınlama alanında (bir konum) gösterir.
    5. UV ışınlamadan sonra, silikon gofret 65 °C'de 1 dakika ve 95 °C'de 5 dakika pişirin.
    6. Silikon gofret soğutun ve ardından pozlanmamış SU-8'i çıkarmak için 15 dakika boyunca bir SU-8 geliştiricisine batırın.
    7. Su-8 kalıbını Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane'nin buharını bir kurutucu ve vakum pompası kullanarak tedavi edin.
  2. iLiNP cihazının imalatı
    1. Silikon tabanı ve polidimetilsiloksisan (PDMS) kür maddesini 10:1 oranında (w/w) karıştırın.
    2. Karışımı vakum pompası ve kurutucu kullanarak gazdan arındırın.
      NOT: PDMS, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca vakum pompası kullanılarak gazdan arındırıldı.
    3. Gazdan arındırılan PDMS'yi SU-8 kalıbına 0,5 ila 1 cm kalınlıkta 100 mm Petri kabında dökün, ardından 80 °C'de bir fırında 1 saat pişirin.
    4. Kalıbı soğutun ve ardından PDMS substratını bir cımbız kullanarak SU-8 kalıbından soyun.
    5. PDMS alt tabakasında üç delik (0,5 mm) delin. Bir iLiNP cihazı oluşturmak için PDMS alt tabakasını ve bir cam kaydırağı oksijen plazma temizleyicisi kullanarak yapıştırın (bkz. Şekil 1)13.
    6. Üç PEEK kılcal damarı (I.D. 0.3 mm, O.D. 0.5 mm) iLiNP cihazının giriş ve çıkışına bağlayın ve bir superglue ile kürleyin.
      NOT: PEEK kılcal damarlarının uzunluğu ayarlanabilir ve deneye bağlıdır.

2. Lipit çözeltilerinin hazırlanması

  1. Lipid/etanol çözeltileri hazırlayın: 13,4 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glisiro-3-fosfokolin (POPC), 10 mM 1,2-Distearoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propan (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glisero-3-metoksipolyethylene glikol-2000 (DMG-PEG2k) ve 20 mM kolesterol. Deneyden önce stok çözümlerini -20 °C'de saklayın.
  2. SiRNA yüklü LNP'leri üretmek için DOTAP, DSPC, kolesterol ve DMG-PEG2k çözeltilerini 50/10/38.5/1.5 molar oranında karıştırın. Toplam lipit konsantrasyonu 8 mM'ye ayarlanır.

3. Sulu çözümlerin hazırlanması

  1. Sulu çözeltiler hazırlayın: 154 mM NaCl (salin), 25 mM asetat tampon pH 4.0'da DNase/RNase içermeyen damıtılmış su kullanarak.
  2. Çözeltileri 0,2 μm boyutlu membran filtreleri veya şırınna filtreleri ile filtreleyin.

4. SiRNA/tampon çözeltisinin hazırlanması

  1. 70 μg siGL4'i 1 mL 25 mM asetat tamponuna (pH 4.0) çözün.
    NOT: siGL4 luciferaz geninin devrilmesi için kullanılır.

5. iLiNP cihazının kurulumu ve LNP'lerin üretimi

NOT: Şemalar için Şekil 1'e bakın.

  1. 1 mL cam şırınnaları sırasıyla lipit ve sulu çözeltilerle (bireysel şırınçlarda 3.1 ve 4.1 adımlarından) doldurun.
    NOT: Lipid ve sulu çözelti hacmini LNP değerlendirme denemesi için gereken miktara bağlı olarak ayarlayın.
  2. Cam şırınnaları şırınna konektörlerini kullanarak PEEK kılcal damarlarına bağlayın.
  3. Lipit ve sulu çözeltilerin akış hızını ayarlayın.
    NOT: Sulu fazın lipid fazı akış hızı oranı (FRR) 3:1 ile 9:1 arasında değişmektedir.
  4. Lipid ve sulu çözeltileri şırınna pompaları kullanarak iLiNP cihazına ayrı ayrı tanıtın.
  5. LNP süspansiyonlarını iLiNP cihazının çıkışından bir mikrotüpte toplayın (Şekil 1).

6. LNP süspansiyonunun diyalizi ve LNP boyut ölçümü

  1. LNP süspansiyonunu, sırasıyla POPC LNP'ler ve siRNA yüklü LNP'ler için salin veya D-PBS'ye karşı bir gecede 4 °C'de diyaliz membranı (12−14 kDa MW kesme) kullanarak dialyze edin.
    NOT: POPC tuzlu suda çözülmez (Lütfen bkz. 2.1). POPC/etanol çözeltisi iLiNP cihazında salin ile seyreltilir.
  2. Çaprazlanmış LNP süspansiyonlarını mikrotüplerde toplayın.
  3. Pipet 20-30 μL LNP süspansiyonu bir mikro kuvars hücreye.
  4. Dinamik ışık saçılım (DLS) ile LNP boyutunu, LNP boyut dağılımını ve çok disiplinlilik dizinini ölçün.

7. LNP'nin Z potansiyelinin ölçültünü

NOT: Z potansiyelinin ölçümü için, üreticinin talimatını takiben bir parçacık analizörü (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.

  1. Adım 6.1'den elde edilen LNP süspansiyonu 10 mM HEPES tamponu (pH 7.4) ile 35 kez seyreltin.
  2. Pipet 700 ila 1000 μL seyreltilmiş LNP süspansiyonu kılcal hücreye.
  3. Üreticinin talimatına göre Z potansiyelini ölçün.

8. RiboGreen tahlil tarafından siRNA kapsülleme verimliliği

NOT: Ribogreen tahlili, lnps19 içine siRNA kapsülleme değerlendirmek için gerçekleştirilir. Ribogreen tahlili, LNP'lerin içindeki ve dışındaki RNA'ların miktarını yüzey aktif maddeli/yüzey aktif maddesiz (örneğin, TritonX-100) ölçebilir.

  1. 2 mg/mL siGL4'ü 10 mM HEPES tamponu (pH 7.4) ile 500 ng/mL siGL4 çözeltisi ile seyreltin.
  2. Triton (+) ve Triton (-) numuneleri için kalibrasyon eğrisi yapmak için siGL4 çözeltisinin seyreltme serisini (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/mL) hazırlayın.
  3. LNP süspansiyonu 10 mM HEPES tamponu (pH 7.4) ile 100 kez seyreltin.
  4. Triton (+) çözümü için aşağıdakileri karıştırın: 980 μL 10 mM HEPES (pH 7.4), 20 μL% 10 w /v TritonX-100 ve 1.25 μL RiboGreen 96 kuyulu bir mikro plakanın 10 kuyusu için.
  5. Triton (-) çözeltisi için aşağıdakileri karıştırın: 1000 μL 10 mM HEPES (pH 7.4) ve 1.25 μL RiboGreen 96 kuyulu bir mikro plakanın 10 kuyusu için.
  6. SiGL4 çözeltisinin seyreltme serisinin pipet 100 μL'si ve siyah 96 kuyulu bir mikro plakanın kuyularına seyreltilmiş LNP süspansiyonları.
    NOT: SiGL4 çözeltisinin seyreltme serisi ve seyreltilmiş LNP süspansiyonları her koşula dört mikrowells içine dağıtıldı.
  7. Pipet 100 μL algılama çözeltisi (TritonX-100 (+) veya Triton (-)) kuyulara.
    NOT: Algılama çözeltisi (TritonX-100 (+)) her durum için numune başına iki kuyuya, TritonX-100 (-) çözeltisi ise numune durumu başına kalan iki kuyuya dağıtıldı.
  8. Mikro plakayı oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  9. 475 nm dalga boyunda bir mikro plaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün.
  10. Aşağıdaki denklemden siRNA kapsülleme verimliliğini hesaplayın19.
    figure-protocol-7480

9. Hücre kültürü

  1. DMEM, ısı inaktive 10% FBS, 100 U /mL penisilin, 100 μg/ mL streptomisin ve 400 μg / mL G418 içeren bir büyüme ortamı hazırlayın.
  2. Kültür HeLa hücreleri, %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de büyüme ortamını içeren 100 mm TC ile işlenmiş bir hücre kültürü çanağı içinde ateş böceği ve Renilla luciferaz (HeLa-dluc) ile kasten ifade eder.

10. Hücre canlılığı tahlilleri

  1. Büyüme ortamındaki (6 x 103 hücre/kuyu) HeLa hücrelerinin 96 kuyulu bir mikro plakada süspansiyonunun 100 μL tohum.
    NOT: Hücreler bir hücre sayacı plakası ve mikroskop kullanılarak sayıldı.
  2. Mikro plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
  3. SiRNA yüklü LNP'leri DMEM (FBS (-)) ile 10 ve 100 nM siRNA konsantrasyonlarında seyreltin.
  4. Kuyu başına seyreltilmiş siRNA yüklü LNP süspansiyonunun 100 μL'sini dağıtın.
  5. Mikro plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
  6. LNP süspansiyonu çıkarın ve 100 μL DMEM (FBS (+)) ekleyin.
  7. Mikro plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 20 saat kuluçkaya yatırın.
  8. Üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir kit kullanarak hücre canlılığını ölçün.
    NOT: Negatif kontrol olarak D-PBS (-) kullanılmıştır.

11. Luciferase gen nakavt tahlil

  1. Büyüme ortamındaki (4,5 x 103 hücre/kuyu) HeLa hücrelerinin 96 kuyulu bir mikro plakada süspansiyonunun 75 μL tohumu.
  2. Mikro plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
  3. SiRNA yüklü LNP'leri DMEM (FBS (-)) ile 10 ve 100 nM siRNA konsantrasyonlarında seyreltin.
  4. Seyreltilmiş siRNA yüklü LNP süspansiyonunun 75 μL'lik kısmını bir kuyu başına dağıtın.
  5. Mikro plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
  6. LNP süspansiyonu çıkarın ve 75 μL DMEM (FBS (+)) ekleyin.
  7. Mikro plakayı %5 CO2 inkübatörde 37 °C'de 20 saat kuluçkaya yatırın.
  8. Luciferaz ifadesini, üreticinin protokolüne göre piyasada bulunan bir kit kullanarak ölçün.
    NOT: Negatif kontrol olarak D-PBS (-) kullandık.

Sonuçlar

Şekil 2A,B, farklı akış koşullarında üretilen POPC LNP boyut dağılımını gösterir. Mikroakışkan tabanlı LNP hazırlama yöntemi, toplam akış hızı (TFR) ve FRR gibi akış koşullarına göre LNP'lerin boyutunu kontrol edebilir. Kaotik karıştırıcı cihaz ve akış odaklı mikroakışkan cihaz da dahil olmak üzere tipik mikroakışkan cihazlarla karşılaştırıldığında, iLiNP cihazı 20 ila 100 nm arasında değişen hassas LNP boyut kontrolünü etkinleştirdi (Şekil 2). Yüksek toplam akış hızı koşullarında küçük boyutlu LNP'ler oluşturulmuştur. Buna ek olarak, 5 FRR'de oluşturulan LNP boyutları, toplam akış hızına bakılmaksızın 3'ün FRR'sinden daha küçüktü13.

siRNA yüklü LNP'ler de iLiNP cihazı kullanılarak hazırlanmıştır (Şekil 3A). SiRNA yüklü LNP hazırlığı için, siRNA'yı LNP'lere etkili bir şekilde kapsüllemek için katyonik bir lipit olan DOTAP kullanıldı. iLiNP cihazı, dar dağılıma sahip 90 nm boyutlu siRNA yüklü katyonik LNP'ler üretti (Şekil 3A,B). Cationic lipid ile negatif yüklü siRNA'lar arasındaki elektrostatik etkileşim nedeniyle siRNA kapsülleme verimliliği %95 idi (Şekil 3C).

Sitotoksiklik ve 90 nm boyutlu siRNA yüklü LNP'lerin gen susturma aktivitesi Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterildiği gibi değerlendirildi. siRNA yüklü LNP'ler 10 ve 100 nM siRNA dozda sitotoksiklik gösterdi. Ayrıca siRNA konsantrasyonuna bağlı olarak luciferaz ekspresyon seviyesinin azaldığını doğruladık. SiRNA yüklü LNP'ler 100 nM siRNA dozda% 80 luciferaz ekspresyonunu bastırdı. LNP boyutunun gen susturma aktivitesi üzerindeki etkisi daha önce 6,13,17 bildirilmiştir.

figure-results-2053
Şekil 1: (A) Şematik çizim ve (B) iLiNP cihazının fotoğrafı. iLiNP cihazı PDMS ve cam yüzeylerden oluşur. iLiNP cihazı PEEK kılcal damarlarına bir superglue ile bağlanır. Lipid ve siRNA/tampon çözeltileri şırınna pompaları kullanılarak iLiNP cihazına ayrı ayrı sokulur. LNP süspansiyonu bir mikrotüpte toplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2730
Şekil 2: iLiNP cihazı tarafından farklı akış hızı oranlarında (FRR) üretilen POPC LNP boyut dağılımları. POPC LNP boyutu dinamik ışık saçılımı (DLS) ile ölçülür. POPC LNP'leri toplam akış hızı ve FRR: (A) 3 FRR ve (B) 5 FRR değiştirerek hazırlanır. Küçük boyutlu LNP'ler yüksek toplam akış hızı koşullarında oluşturulur. Buna ek olarak, 5 FRR'de oluşturulan LNP boyutları 3 FRR'dekilerden daha küçüktü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3531
Şekil 3: SiRNA yüklü LNP'lerin karakterizasyonu. (A) SiRNA yüklü LNP'lerin boyut dağılımı. siRNA'lar (siGL4), katyonik lipit (DOTAP) ve negatif yüklü siRNA'lar arasındaki elektrostatik etkileşimle LNP'lere kapsüllenir. (B) siRNA yüklü LNP'lerin Z potansiyeli. LNP süspansiyonu ölçümden önce 10 mM HEPES tamponu (pH 7.4) ile seyreltildi. Veriler ortalama ± SD (Standart Sapma) olarak temsil edilir. n = 3. (C) DOTAP tabanlı LNP'lerin siRNA kapsülleme verimliliği. Kapsülleme verimliliği RiboGreen tahlil ile belirlendi. Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4527
Şekil 4: SiRNA yüklü LNP'lerin sitotoksikliği. siRNA yüklü LNP'ler DMEM (FBS (-)) ile seyreltilerek 10 ve 100 nM'lik siGL4 konsantrasyonları elde edildi. LNP süspansiyonları HeLa-dLuc hücrelerine eklenir ve% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edilir. N.T.: Tedavi edilmez (D-PBS(-)). Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5255
Şekil 5: SiRNA yüklü LNP'lerle tedavi edilen Luciferaze gen nakavt aktivitesi. siRNA yüklü LNP'ler hücre canlılığı testine göre hazırlanır. Luciferaz ekspresyon seviyesi Çift Glo Luciferaz Tahlil Sistemi kullanılarak ölçülür. N.T.: Tedavi edilmez (D-PBS(-)). Veriler ortalama ± SD olarak temsil edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

LNP boyutu LNP biyodistribution, anti-tümör etkisi ve gen susturma performansını etkiler. Bu nedenle, LNP boyut kontrol yöntemi, RNA dağıtım sistemleri de dahil olmak üzere DDS nanotıpları üretmek için önemli bir tekniktir. Bu makalenin amacı, LNP'lerin hassas boyut ayarı ve uygulaması için iLiNP cihazını siRNA yüklü LNP üretimine tanıtmaktır. iLiNP cihazı, 20 ila 100 nm arasında değişen LNP boyutunu kontrol edebildi (Şekil 2)13. Toplam akış hızı ve FRR gibi akış koşulları LNP boyutunu kontrol etmek için değiştirildiğinde, çözelti akışını stabilize etmek için LNP süspansiyonu yaklaşık 5 ila 10 sn sonra toplanmalıdır. iLiNP cihazının çıkışından toplanan LNP süspansiyonu, etanol kaldırmak ve LNP toplamasını önlemek için tampon çözeltisine karşı hemen çaprazlandı.

LNP boyut kontrolü, DDS alanındaki en büyük zorluklardan biridir. Genellikle, lipid film hidrasyon yöntemi gibi geleneksel LNP üretim süreci, LNP prodüksiyon20'den sonra bir boyut ayarlama işlemine ihtiyaç duyar. Öte yandan, mikroakışkan tabanlı LNP'ler üretim yöntemi, lipid ve sulu çözeltileri mikroakışkan cihaza sokarak boyut kontrollü LNP'leri üretebilir6,11,13. Diyaliz işlemi LNP süspansiyonundan etanol çıkarmak için gerekli olsa da, mikroakışkan cihaz tarafından teğetsel akış sistemi ile birleştirilen sürekli bir süreç LNP üretim sürecinin otomasyonu vaat eder14. Literatüre göre, POPC LNP boyutları, akış odaklı mikroakışkan cihaz21 ve kaotik karıştırıcı cihaz için sırasıyla 50-60 nm ve 30-60 nm'ydi. Diğer mikroakışkan cihazlarla karşılaştırıldığında, iLiNP cihazı POPC LNP boyut kontrolünü 20 ila 100 nm arasında geniş bir aralıkta sağlar.

Kullanılan iLiNP cihazının imalat süreci standart yumuşak litografiydi. Böylece, iLiNP cihazı hızlı prototipleme tekniği ile seri olarak üretilebilir ve tek kullanımlık bir cihaz kullanarak çözeltilerin çapraz kirlenmesini önleyebilir. iLiNP cihazı, POPC LNP üretim yöntemiyle aynı şekilde siRNA yüklü LNP'ler üretebilir. iLiNP aygıtını kullanan LNP üretim yöntemi için kullanıcı herhangi bir karmaşık yordam gerektirmez. Bu nedenlerden dolayı, iLiNP cihazı da dahil olmak üzere mikroakışkan tabanlı LNP üretim yönteminin standart LNP üretim yöntemi olarak istihdam edilmesi beklenecektir. Bu makalenin protokolü LNP üretimi için diğer mikroakışkan cihazlara uyarlanabilir. Buna ek olarak, mRNA yüklü LNP'lerin üretimi, siRNA/buffer çözeltisi mRNA'lar içeren bir arabellek çözümüne değiştirilerek de etkinleştirilir.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japan, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japan, JST, SCORE, Japan, Special Education and Research Expenses of the Education, Culture, Sports, Science and Technology, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140 ve Iketani Science and Technology Foundation tarafından desteklendi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC)NOF Corp.MC-6081
1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2K)NOF Corp.GM-020
1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP)NOF Corp.CL-8181TA
1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinev (DSPC)NOF Corp.MC-8080
10 x D-PBS (-)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.048-29805
Acetic acidFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.017-00251
CellTiter-Blue Cell Viability AssayPromegaG8081
cholesterolSigma-AldrichC8667-5G
Desktop maskless lithography systemNEOARK CORPORATIONDDB-701-DL4
Dialysis membraneRepligen132697
Dual-Glo Luciferase Assay SystemPromegaE2940
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher ScientificLot: 42G6587K
G418Nacalai Tesque08973-14
Glass substrateMatsunami Glass Ind., Ltd.S1111
Glass syringeHamiltonGASSTIGHT 1002
HeLa cellHeLa-dluc cells were provided from Dr. Yusuke Sato at Hokkaido University
HEPESFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.342-01375
Low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)Sigma-AldrichD6046-500ML
Oxygen plasma cleanerFemto ScienceCUTE-1MP/R
Penicillin–streptomycin, trypsin (2.5%)Thermo Fisher Scientific15140122
Quant-iT RiboGreen RNA ReagentThermo Fisher ScientificR11491
siGL4Hokkaido System Science Co., LtdThe sense and antisense strand sequences of siGL4 are 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT
-3' and 5'-UUGCUCACGAAUACGACGGTsT
-3', respectively.
Silicon waferGTC
SILPOT 184 W/C (PDMS)Dow Corning Toray Co., Ltd.silicone base and curing agent are included
Sodium acetateFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.192-01075
Sodium chlorideFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.191-01665
SU-8 3050Nippon Kyaku Co., Ltd.
Syringe connectorInstitute of microchemical Technology Co., Ltd.ISC-011
Syringe pumpChemyxCX07200
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma-Aldrich448931-10G
TritonX-100Nacalai Tesque35501-15
UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Zetasizer Nano ZS Malvern InstrumentsZEN3600

Referanslar

  1. Schoenmaker, L., et al. mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586 (2021).
  2. Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design. ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).
  3. Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
  4. Cabral, H., et al. Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size. Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).
  5. Sato, Y., et al. Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery. Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).
  6. Kimura, N., et al. Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production. RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).
  7. Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).
  8. Akinc, A., et al. The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs. Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).
  9. Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics. Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).
  10. Maeki, M., et al. Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers. PLoS One. 12 (11), 0187962 (2017).
  11. Maeki, M., et al. A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure. RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).
  12. Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, 37 (2012).
  13. Kimura, N., et al. Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery. ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).
  14. Kimura, N., et al. Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery. ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).
  15. Hashiba, A., et al. The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery. Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).
  16. Suzuki, Y., et al. Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition. Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).
  17. Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery. ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).
  18. Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction. Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).
  19. Sato, Y., et al. A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).
  20. Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes. Pharmaceutics. 8 (4), (2016).
  21. Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyokimyaSay 181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır