Ökaryotik Glikojen Metabolizmasının İncelenmesi için Spektrofotometrik Yöntemler

Özet

Glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitesini ölçmek için teknikler, görünür aralıkta çalışan basit bir spektrofotometre kullanılarak sunulmaktadır.

Özet

Glikojen glikozun bir depolama formu olarak, bakterilerden hayvanlara kadar çok çeşitli organizmalar tarafından sentezlenir. Molekül, α1,4 bağlantılı glikoz kalıntılarının doğrusal zincirlerini ve α1,6 bağlantılarının eklenmesiyle ortaya çıkan dalları içerir. Glikojen sentezinin ve bozunmasının nasıl düzenlendiğini ve glikojen karakteristik dallanmış yapısına nasıl ulaştığını anlamak, glikojen depolama enzimlerinin incelenmesini gerektirir. Bununla birlikte, bu enzim aktivitelerini incelemek için en yaygın olarak kullanılan yöntemler tipik olarak tüm araştırmacılar için mevcut olmayan reaktifleri veya teknikleri kullanır. Burada, teknik olarak basit, uygun maliyetli ve yine de glikojen depolamanın kontrolü hakkında değerli bilgiler sağlayabilen bir dizi prosedürü tartışıyoruz. Teknikler, 330 ila 800 nm aralığında çalışan bir spektrofotometreye erişim gerektirir ve kullanıcıların tek kullanımlık, plastik küvetler kullanacağı varsayılarak açıklanmaktadır. Bununla birlikte, prosedürler kolayca ölçeklenebilir ve bir mikroplaka okuyucuda kullanılmak üzere değiştirilebilir, bu da oldukça paralel analizlere izin verir.

Giriş

Glikojen doğada yaygın olarak dağılmıştır, bileşik bakterilerde, birçok protistte, mantarda ve hayvanda bulunur. Mikroorganizmalarda, besinler sınırlandığında glikojen hücre sağkalımı için önemlidir ve memeliler gibi daha yüksek organizmalarda, glikojen sentezi ve bozulması kan şekeri seviyelerini tamponlamaya hizmet eder ^1,2,3. Bu nedenle, glikojen metabolizmasının incelenmesi, mikrobiyoloji ve memeli fizyolojisi gibi çeşitli alanlar için önemlidir. Glikojen metabolizmasını anlamak, glikojen sentezinin (glikojen sentaz ve dallanma enzimi) ve glikojen yıkımının (glikojen fosforilaz ve dallanma enzimi) anahtar enzimlerinin incelenmesini gerektirir. Glikojen sentaz, fosforilaz, dallanma ve dallanma enzim aktivitelerinin altın standart tahlilleri radyoaktif izotoplar kullanır. Örneğin, glikojen sentaz genellikle durdurulmuş bir radyokimyasal tahlilde, glikozun UDP-[14 C] glikozdan (hayvan ve mantar enzimleri durumunda) veya ADP-[¹⁴C] glikozdan (bakteriyel enzimler durumunda) glikojen ^4,5'e dahil edilmesini takiben ölçülür. Benzer şekilde, glikojen fosforilaz, glikozun [¹⁴C] glikoz-1-fosfattan glikojen^6'ya dahil edilmesini takiben, glikojen sentezi yönünde ölçülür. Dallanma enzimi, bu enzimin [14 C] glikozun glukoz-1-fosfattan ^α1,4bağlantılı zincirlere glikojen fosforilaz⁷ ile dahil edilmesini uyarma kabiliyeti ölçülerek test edilir ve debranching enzim aktivitesi, enzimin [¹⁴C] glikozu glikojen^8'e dahil etme kabiliyeti izlenerek belirlenir. . Çok hassas olmakla birlikte, düşük enzim aktivitesi seviyelerine sahip ham hücre ekstraktlarında kullanımlarına izin verirken, radyoaktif substratlar pahalıdır ve radyoizotop kullanımına eşlik eden düzenleyici gerekliliklere tabidir. Bu engeller, bazı tahlillerin kullanımını birçok işçinin erişemeyeceği bir yere yerleştirmektedir. Bununla birlikte, uzun yıllar boyunca, bu enzimlerin ölçümüne yönelik etkileyici çeşitlilikte spektrofotometrik yaklaşımlar tanımlanmıştır. Genel olarak, bu yaklaşımlar nihayetinde NADH / NADPH'nin üretimini veya tüketimini veya glikojen ve iyot arasındaki renkli komplekslerin oluşumunu ölçmeye dayanır. Bu nedenle, basittirler ve sadece tungsten veya xenon flaş lambaları ile donatılmış basit spektrofotometreler kullanılarak gerçekleştirilebilirler.

Glikojen sentazın spektrofotometrik testleri, büyüyen glikojen zincirine glikoz eklendikçe şeker nükleotid donöründen salınan nükleozid difosfatın ölçülmesine dayanır ^9,10. Aşağıdaki protokolün 1. bölümünde açıklanan glikojen sentaz aktivitesini ölçme prosedürü, Wayllace ve ^ark.11 tarafından özetlenenlerin bir modifikasyonudur ve bağlantı şeması aşağıda gösterilmiştir:

(Glikoz) _n + UPD-glukoz → (Glikoz)_n+1 + UDP

UDP + ATP → ADP + UTP

ADP + fosfoenolpiruvat → piruvat + ATP

Piruvat + NADH + H ⁺ → Laktat + NAD ⁺

Glikojen sentaz, UDP-glikozdan glikozu glikojene ekler. Bu işlemde üretilen UDP, ADP üreten bir reaksiyonda nükleozid difosfat kinaz (NDP kinaz) tarafından UTP'ye dönüştürülür. ADP, sırayla, daha sonra, bir fosfat donörü olarak fosfoenolpiruvat kullanarak ADP'yi fosforile eden piruvat kinaz için bir substrat görevi görür. Elde edilen piruvat, NADH tüketen bir reaksiyonda laktat dehidrogenaz enzimi tarafından laktata dönüştürülür. Bu nedenle tahlil, NADH tüketildikçe 340 nm'de absorbanstaki azalmayı izleyerek sürekli bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bir glikoz donörü olarak ADP-glikoz gerektiren enzimlerle kullanım için kolayca uyarlanmıştır. Burada, glikojen sentazın etkisiyle salınan ADP, doğrudan piruvat kinaz tarafından etki edildiğinden, bağlantı adımları daha basittir.

Glikojen fosforilaz aktivitesinin belirlenmesi için çeşitli spektrofotometrik testler mevcuttur. Klasik versiyonda, enzim aşağıda gösterildiği gibi glikojen sentezi yönünde geriye doğru sürülür:

(Glikoz) n + Glikoz-1-fosfat → (Glikoz)_n + _{1 +} P_i

Zamanlanmış aralıklarda, reaksiyon karışımının alikotları çıkarılır ve serbest bırakılan fosfat miktarı^12,13 olarak ölçülür. Ellerimizde, bu tahlil, fosforilaz etkisi için gerekli olan yüksek konsantrasyonlarda glikoz-1-fosfat ile birlikte, glikoz-1-fosfatın birçok ticari preparatında kolayca ölçülebilir serbest fosfatın varlığı nedeniyle sınırlı bir kullanım alanına sahiptir. Daha ziyade, glikojen fosforilaz¹³ tarafından parçalanırken salınan glikoz-1-fosfatı ölçen alternatif bir testi rutin olarak kullandık. Aşağıda gösterilen birleştirilmiş bir reaksiyon şeması kullanılır.

(Glikoz) n + P_i → (Glikoz)_n-1 + _{Glikoz-1-fosfat}

Glikoz-1-fosfat → Glikoz-6-fosfat

Glukoz-6-fosfat + NADP + → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H ⁺

Glikoz-1-fosfat, fosfoglukomutaz tarafından glikoz-6-fosfata dönüştürülür ve glikoz-6-fosfat daha sonra NADP ⁺ 'nın NADPH'ye eşzamanlı indirgenmesi ile 6-fosfoglukonolakton'a oksitlenir. Aşağıdaki protokolün 2. bölümünde ayrıntılı olarak açıklanan prosedür, Mendicino ve ark.14 ve Schreiber & Bowling¹⁵ tarafından açıklanan yöntemlerden türetilmiştir. Tahlil, zaman içinde 340 nm'de absorbanstaki artışla sürekli bir şekilde kolayca gerçekleştirilebilir ve reaksiyon hızının belirlenmesine izin verir.

Dallanma enzimi aktivitesinin spektrofotometrik tayini, enzimin fosforilaz limitli dekstrin¹⁶ üzerindeki etkisiyle salınan glikozun ölçümüne dayanır. Bu bileşik, glikojen fosforilaz ile kapsamlı bir şekilde glikojen muamelesi yapılarak yapılır. Glikojen fosforilaz etkisi, 4 glikoz kalıntısını α1,6 dallı bir noktadan uzakta durdurduğundan, sınır dekstrin, dış zincirleri ~ 4 glikoz kalıntısına kısaltılmış glikojeni içerir. Fosforilaz limit dekstrinin hazırlanması, Taylor ve ^ark.17 ve Makino & Omichi¹⁸ tarafından geliştirilenlerden türetilen bir prosedür kullanılarak burada açıklanmaktadır.

Dallanma iki adımlı bir işlemdir. İki fonksiyonlu dallanma enziminin 4-α-glukanotransferaz aktivitesi ilk önce üç glikoz kalıntısını dal noktasından yakındaki α1,4 bağlı glikoz zincirinin indirgemesiz ucuna aktarır. Dallanma noktasında kalan tek, α1,6 bağlantılı glikoz kalıntısı daha sonra α1,6-glukozidaz aktivitesi¹⁹ tarafından hidrolize edilir. Tahlil tipik olarak durdurulmuş bir şekilde gerçekleştirilir, belirli bir süreden sonra salınan glikoz (veya bir dizi kez) aşağıda gösterildiği gibi birleştirilmiş bir enzim tahlilinde ölçülür:

(Glikoz) n → (Glikoz)_n-1 + Glikoz

Glikoz + ATP → Glikoz-6-fosfat + ADP

Glukoz-6-fosfat + NADP + → 6-fosfoglukonolakton + NADPH + H ⁺

Üretilen NADPH'nin belirlenmesi, glikoz üretiminin bir ölçüsünü verir. Aşağıdaki protokolün 3. bölümünde özetlenen prosedür, Nelson ve ^ark.16 tarafından açıklanan prosedüre dayanmaktadır. NADH / NADPH'nin tüketimine veya üretilmesine dayanan diğer yöntemler gibi, tahlil de oldukça hassastır. Bununla birlikte, fosforilaz limit dekstrinden serbest glikozu da serbest bırakabilen amilazların veya diğer glukozidazların varlığı, önemli bir girişime neden olacaktır (bkz.

Dallanan enzim aktivitesinin kolorimetrik tayini, α1,4 bağlı glikoz zincirlerinin, iyota bağlanan ve renkli kompleksler oluşturan sarmal yapıları benimsemesine dayanır²⁰. Oluşan kompleksin rengi, α1,4 bağlantılı zincirlerin uzunluğuna bağlıdır. Böylece, uzun, büyük ölçüde dallanmamış α1,4 bağlı glikoz zincirlerinden oluşan amiloz, iyot ile derin mavi bir kompleks oluşturur. Buna karşılık, dış zincirleri genellikle sadece 6 ila 8 glikoz kalıntısı uzunluğunda olan glikojen maddeler turuncu-kırmızı kompleksler oluşturur. Bir amiloz çözeltisi dallanma enzimi ile inkübe edilirse, dalların amiloza sokulması, daha kısa α1,4 bağlı glikoz zincirlerinin üretilmesiyle sonuçlanır. Böylece, amiloz / iyot komplekslerinin emilim maksimumu daha kısa dalga boylarına doğru kayar. Burada tartışılan prosedür, Boyer & Preiss²¹ tarafından detaylandırılan prosedürden türetilmiştir ve dallanma enzim aktivitesi, zamanla 660 nm'de amiloz / iyot kompleksinin emiliminde bir azalma olarak ölçülür.

Yukarıdaki tartışmadan kolayca anlaşılacağı gibi, iyot ve α1,4-glikoz zincirleri arasında oluşan komplekslerin renklerinin zincir uzunluğuna göre değişmesi, glikojen / iyot komplekslerinin absorbans spektrumlarının glikojen dallanma derecesine göre değişmesi gerektiği anlamına gelir. Bu gerçekten de böyledir ve daha uzun dış zincirlere sahip daha az dallanmış glikojen / glikojen maddeler, daha dallanmış / daha kısa dış zincirlere sahip glikojenlerden daha uzun bir dalga boyunda ışığı emer. Bu nedenle iyot boyama reaksiyonu, glikojen dallanma derecesi²² hakkında hızlı, kalitatif veriler elde etmek için kullanılabilir. Turuncu-kahverengi renk, iyotlu glikojen kompleksleri özellikle yoğun olmadığında oluşur. Bununla birlikte, doymuş kalsiyum klorür çözeltisi^22'nin dahil edilmesiyle renk gelişimi arttırılabilir. Bu, yöntemin duyarlılığını yaklaşık 10 kat artırır ve mikrogram glikojenin hazır analizine izin verir. Aşağıdaki protokolün 4. bölümünde açıklanan dallanmanın belirlenmesi için tahlil, Krisman²² tarafından geliştirilen bir prosedürden uyarlanmıştır. Glikojen numunesinin bir küvette iyot çözeltisi ve kalsiyum klorür ile birleştirilmesi ve absorpsiyon spektrumunun 330 nm ila 800 nm arasında toplanmasıyla gerçekleştirilir. Absorbans maksimumu, dallanma derecesi azaldıkça daha uzun dalga boylarına doğru kayar.

Toplu olarak, burada açıklanan yöntemler, glikojen metabolizmasının anahtar enzimlerinin aktivitelerini değerlendirmek ve glikojen dallanmasının derecesi hakkında nitel veriler elde etmek için basit, güvenilir araçlar sağlar.

Protokol

1. Glikojen sentaz aktivitesinin tayini

1. Gerekli reaktiflerin stok çözeltilerini Tablo 1'de belirtildiği gibi hazırlayın (deney gününden önce).

Parça	Yol Tarifleri
50 mM Tris pH 8,0	0.61 g Tris bazını ~ 80 mL suda çözün.  4 °C'ye kadar soğutun.   HCl ile pH'ı 8,0'a ayarlayın ve ses seviyesini suyla 100 mL'ye kadar çıkarın.
20 mM HEPES tampon	0.477 g HEPES'i ~ 80 mL suda çözün.  NaOH ile pH'ı 7,0'a ayarlayın ve ses seviyesini suyla 100 mL'ye kadar yükseltin.
132 mM Tris/32 mM KCl tampon pH 7,8	1.94 g Tris baz ve 0.239 g KCl'yi ~ 90 mL suda çözün.  HCl ile pH'ı 7,8'e ayarlayın ve su ile hacmi 100 mL'ye kadar yükseltin.
İstiridye glikojen ile %0,8	80 mg istiridye glikojen tartın ve suya ekleyin.  Son hacmi suyla 10 mL'ye kadar çıkarın ve glikojeni tamamen çözmek için hafifçe ısıtın / karıştırın.
100 mM UDP-glukoz	0.31 g UDP-glikozu suda çözün ve son hacmi 1 mL'ye kadar yapın.  -20 °C'de dondurulmuş alikotlarda saklayın.   Birkaç ay boyunca kararlı.
50 mM ATP	0.414 g ATP'yi ~ 13 mL suda çözün.  OH ile pH'ı 7,5'e ayarlayın ve hacmi suyla 15 mL'ye kadar ayarlayın.  -20 °C'de dondurulmuş alikotlarda saklayın.   Birkaç ay boyunca kararlı.
100 mM glukoz-6-fosfat pH 7.8	0.282 g glikoz-6-fosfatı ~ 7 ila 8 mL suda çözün.  NaOH ile pH'ı 7,8'e ayarlayın.  Hacmi suyla 10 mL'ye kadar yapın.  -20 °C'de alikotlarda dondurulmuş olarak saklayın.   En az altı ay boyunca kararlı.
40 mM fosfoenolpiruvat	4 mg fosfoenolpiruvat, 0.5 mL'lik 20 mM HEPES tamponu pH 7.0'da çözün.  -20 °C'de saklayın.   En az 1 hafta boyunca stabil.
0,5 milyon MnCl2	9.90 g MnCl2'yi 100 mL'lik son bir su hacminde çözün.
NDP kinaz	Liyofilize tozu 1 U / μl çözeltisi vermek için yeterli su ile yeniden oluşturun.  Alikotlar hazırlayın, sıvı azotta dondurun ve -80 ° C'de saklayın.   En az 1 yıl boyunca kararlı.

Tablo 1: Glikojen sentaz aktivitesinin tahlili için gerekli stok çözeltileri.

2. Tahlil gününde, 4.5 mg NADH'yi 1.5 mM Tris-HCl, pH 8.0'da 1.5 mL'de çözerek 4 mM NADH'lik taze bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Işıktan korunan buz üzerinde saklayın.
3. Buz üzerinde UDP-glukoz, ATP, fosfoenolpiruvat ve NDP kinaz stok çözeltilerini çözün.
4. Bir su banyosunu önceden 30 ° C'ye ısıtın.
5. Tablo 2'de listelenen reaksiyon karışımı reaktiflerini ekleyerek her bir glikojen sentaz testini 1.5 mL'lik bir tüpte ayarlayın.

Parça	Ses seviyesi (μl)
160 mM Tris/32 mM KCl tampon pH 7,8	250
Su	179
100 mM glukoz-6-fosfat, pH 7.8	58
% 0,8 istiridye glikojen ile	67
50 mM ATP	80
4 mM NADH	80
100 mM UDP-glukoz	28
40 mM fosfoenolpiruvat	20
0,5 milyon MnCl2	8
Son cilt	770

Tablo 2: Glikojen sentaz aktivitesinin tahlili için bileşim reaksiyon karışımı.

NOT: Kurulumu kolaylaştırmak için, planlanan tahlil sayısını tamamlamak için yukarıda listelenen reaktiflerin her birinden yeterince içeren bir ana karışım yapılabilir.

6. Yukarıdaki karışımdaki NADH'nin su ile değiştirildiği boş bir reaksiyon hazırlayın. Tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın ve spektrofotometredeki sıfırı 340 nm'ye ayarlamak için bunu kullanın.
7. 1.5 mL'lik bir tüpte reaksiyon karışımının aliquot'undan bir 770 μL alın. 2 μL NDP kinaz ve 2 μL piruvat kinaz / laktat dehidrogenaz karışımı ekleyin, nazikçe karıştırın ve reaksiyon karışımını önceden ısıtmak için 30 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe edin.
8. Glikojen sentaz içeren numunenin 30 μL'sini 20 mM Tris tamponuna, pH 7.8'e ekleyin; karıştırın ve reaksiyon karışımını tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.
9. Küveti spektrofotometreye yerleştirin ve absorbansı 10 ila 20 dakika boyunca zamanlanmış aralıklarla 340 nm'de kaydedin. Zamana karşı elde edilen absorbansları çizin.
   NOT: NADH'nin enzimatik olmayan oksidasyonunu kontrol etmek için glikojen sentaz numunesinin 20 mM Tris tamponu ile değiştirildiği bir reaksiyon yapılmalıdır. Numunenin saflığına bağlı olarak, başka kontrol reaksiyonları gerekebilir. Ayrıntılar için Tartışma bölümüne bakın.
10. Reaksiyon hızını belirleyin (ayrıntılar için Sonuçlar'a bakın).

2. Glikojen fosforilaz aktivitesinin belirlenmesi

1. Stok çözeltilerini Tablo 3'te belirtildiği gibi hazırlayın (deney gününden önce).

Parça	Yol Tarifleri
125 mM BORULAR pH 6.8	3.78 g BORULARI suda çözün.  NaOH ile pH'ı 6,8'e ayarlayın ve ses seviyesini suyla 100 mL'ye kadar ayarlayın.
%8 istiridye glikojen ile	0.8 g istiridye glikojen tartın ve suya ekleyin.  Son hacmi suyla 10 mL'ye kadar yapın ve glikojeni çözmek için hafifçe ısıtın / karıştırın.  -20 °C'de dondurulmuş olarak saklayın.
200 mM Na fosfat pH 6,8	2.63 g Na 2 HPO 4.7H 2 O ve 1.41g NaH2PO4'ü çözün. H2O suda.  Hacmi suyla 100 mL'ye kadar getirin.
1 mM glukoz-1,6-bisfosfat	2 mg glikoz-1,6-bisfosfatı 4 mL suda çözün.  Aliquot ve depo -20 ° C'de dondurulmuş.   En az birkaç ay boyunca kararlı.
10 mM NADP	23 mg NADP'yi 3 mL suda çözün.  Aliquot ve depo -20 ° C'de dondurulmuş.   En az birkaç ay boyunca kararlı.

Tablo 3: Glikojen fosforilaz aktivitesinin tahlili için gerekli stok çözeltileri.

2. Su banyosunu önceden 30 °C'ye ısıtın
3. Aşağıda listelenen reaksiyon karışımı reaktiflerini ekleyerek her bir glikojen fosforilaz testini 1.5 mL'lik bir tüpte ayarlayın (Tablo 4).

Parça	Ses seviyesi (μl)
125 mM BORULAR tampon pH 6.8	160
Su	70
%8 istiridye glikojen ile	100
200 mM Na fosfat 6.8	400
1 mM glukoz-1,6-bisfosfat	20
10 mM NADP	20
Son cilt	770

Tablo 4: Glikojen fosforilaz aktivitesinin tahlili için bileşim reaksiyon karışımı.

NOT: Kurulumu kolaylaştırmak için, planlanan tahlil sayısını tamamlamak için yukarıda listelenen reaktiflerin her birinden yeterince içeren bir ana karışım yapılabilir.

5. Tablo 4'te listelenen bileşenleri içeren boş bir reaksiyon hazırlayın, ancak ilave 30 μL 25 mM PIPES tamponu, pH 6.8 ekleyin (125 mM PIPES tamponunun 1/5'inin su ile seyreltilmesiyle hazırlanır). Tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın ve spektrofotometredeki sıfırı 340 nm'ye ayarlamak için kullanın.
6. 1.5 mL'lik bir tüpte bir adet 770 μL aliquot reaksiyon karışımı alın. 1 μL glikoz-6-fosfat dehidrogenaz ve 1 μL fosfoglukomutaz ekleyin, yavaşça karıştırın ve reaksiyon karışımını önceden ısıtmak için 30 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
7. Glikojen fosforilaz içeren numunenin 30 μL'sini 25 mM PIPES tamponuna, pH 6.8'e ekleyin. Reaksiyon karışımını karıştırın ve tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.
8. Küveti spektrofotometreye yerleştirin ve absorbansı 10 ila 20 dakika boyunca zamanlanmış aralıklarla 340 nm'de kaydedin. Zamana karşı elde edilen absorbansları çizin.
   NOT: Glikojen fosforilazın 25 mM PIPES tamponu ile değiştirildiği bir reaksiyon dahil edilmelidir. Glikojen fosforilaz örneğinin saflığına bağlı olarak, başka kontrollere de ihtiyaç duyulabilir (ayrıntılar için Tartışma'ya bakınız).
9. Reaksiyon hızını belirleyin (ayrıntılar için Temsili Sonuçlar'a bakın).

3. Glikojen dallanma enzim aktivitesinin tayini

1. Stok çözeltilerini Tablo 5'te belirtildiği gibi hazırlayın (deney gününden önce).

Parça	Yol Tarifleri
100 mM maleat tampon	1.61 g maleik asidi ~ 80 mL suda çözün.  NaOH ile pH'ı 6,6'ya ayarlayın ve son hacmi suyla 100 mL'ye kadar yapın.
300 mM trietanolamin hidroklorür/ 3 mM MgSO, 4 pH 7.5	27.85 g trietanolamin hidroklorür ve 0.370 g MgSO4 çözün. 7H2O ~ 400 mL suda.  OH ile pH'ı 7,5'e ayarlayın ve su ile 500 mL'lik bir son hacme kadar yapın.
150 mM ATP/12 mM NADP	1.24 g ATP'yi ~ 10 mL suda çözün.  PH'ı izleyin ve ATP çözülürken ~ 7.5 pH değerini korumak için NaOH ekleyin.  0,138 g NADP ekleyin.  OH ile pH'ı ~ 7.5'e ayarlayın ve su ile 15 mL'lik bir son hacme kadar yapın. Aliquots içinde – 20 ° C'de saklayın. Birkaç ay boyunca kararlı.
50 mM Na fosfat tamponu pH 6,8	32.81 g Na 2 HPO 4.7H 2 O ve 17.61 g NaH2PO4'ü çözün. H2O suda.  Ses seviyesini suyla 5 L'lik son bir hacme getirin.

Tablo 5: Glikojen daldan arındırma enzim aktivitesinin tahlili için gerekli stok çözeltileri.

2. Fosforilaz limit dekstrin hazırlayın
   1. 0.3 g istiridye glikojen 10 mL'lik 50 mM sodyum fosfat tamponunda, pH 6.8'de çözün.
   2. 50 mM fosfat tamponunda, pH 6.8'de 60 U aktivite elde etmek için yeterli liyofilize fosforilaz A tozunu çözün.
      NOT: Satın alınan fosforilaz A'nın miktarına bağlı olarak, ihtiyaç duyulan kütle değişecektir, ancak genellikle 5 ila 10 mg toz arasındadır.
3. Glikojen çözeltisine 60 U fosforilaz A ekleyin ve bir diyaliz torbasına aktarın. Oda sıcaklığında 1 L 50 mM sodyum fosfat tamponuna karşı diyaliz, 8 saat boyunca pH 6.8. Taze diyaliz tamponuna geçin ve inkübasyona gece boyunca devam edin.
4. Başka bir 10 U fosforilaz A ekleyin ve taze diyaliz tamponuna geçin. 8 saat sonra, tekrar taze diyaliz tamponuna geçin ve inkübasyona gece boyunca devam edin.
5. Diyaliz torbasının içeriğini bir santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika kaynatın. Buz üzerinde soğutun ve ardından 15 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj yapın.
6. Süpernatantı bir diyaliz torbasına aktarın ve 2 L damıtılmış suyun üç değişimine karşı 8 saat diyaliz yapın.
7. Diyaliz torbasının içeriğini 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hacmi ölçün ve limit dekstrini çökeltmek için iki hacim buz gibi soğuk mutlak etanol ekleyin. Tüpün 30 dakika boyunca buz üzerinde durmasına izin verin.
   NOT: Beyaz bir çökelti etanol ilavesi üzerine hemen oluşmaya başlamalıdır, ancak eklenmezse, 3 M NaCl'lik bir damla ekleyin.
8. 15 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Limit dekstrinin beyaz peletini% 66 v / v etanol ile iki kez, her durulama için ~ 30 mL kullanarak durulayın.
9. Sınır dekstrini bir harç üzerine aktarın ve havanın tamamen kurumasını bekleyin. Sınır dekstrin kuruduğunda, havaneli bir toza öğütün ve depolama için uygun bir kaba aktarın; 4 °C'de kurutun.
10. Dalsızlaştırıcı enzim substratı olarak kullanım için, suda% 1'lik bir w / v çözeltisi hazırlayın.
11. Bir su banyosunu önceden 30 ° C'ye ısıtın.
12. Bir ısıtma bloğunu veya su banyosunu önceden 95 ° C'ye ısıtın.
13. Her biri 100 μL maleat tamponu, 80 μL fosforilaz limit dekstrin ve 10 μL su içeren dört adet 1,5 mL tüp hazırlayın. Bu tüpler debranching enzim testini yapmak için kullanılacaktır. Tüplerden ikisini Reaksiyon ve diğer iki tüp Kontrolü etiketleyin.
14. Zamanlanmış aralıklarla, dallanma enzimi örneğinin 10 μL'sini Reaksiyon tüplerine ve dallanma enzimi örneğini Kontrol tüplerine hazırlamak için kullanılan 10 μL tampon ekleyin. 30 °C'de inkübe edin.
15. Tanımlanan zaman noktalarında (örneğin, 5-, 10- ve 20-dk inkübasyon), her bir Reaksiyon ve Kontrol tüpünden 50 μL çekin ve hemen 95 ° C'de ısıtma bloğuna veya su banyosuna yerleştirin. 3 dakika ısıtın.
16. Çökelmiş proteini çıkarmak için 2 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj yapın.
    NOT: Bu noktada, gerekirse prosedür durdurulabilir. Isıtılmış numuneler, salınan glikoz ölçümüne geçene kadar -20 ° C'de dondurulmuş olarak saklanabilir (aşağıdaki adım 17).
17. Salınan glikozun ölçümü
    1. Isıtılmış numunelerden 40 μL süpernatantı tek kullanımlık metakrilat küvetlere aktarın ve 833 μL trietanolamin hidroklorür / magnezyum sülfat tamponu, 67 μL NADP / ATP karışımı ve 60 μL su ekleyin. Hava kabarcıkları sokmamaya dikkat ederek yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın.
       NOT: Kurulumu kolaylaştırmak için, planlanan tahlil sayısını tamamlamak için yukarıda listelenen reaktiflerin her birinden yeterince içeren bir ana karışım yapılabilir.
    2. 100 μL maleat tamponu, 80 μL fosforilaz limit dekstrin ve 20 μL suyu birleştirerek boş bir reaksiyon hazırlayın. İyice karıştırın ve 40 μL'yi tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın. Adım 3.17.1'de açıklandığı gibi 833 μL trietanolamin hidroklorür/magnezyum sülfat vb. ekleyin.
    3. Boş reaksiyonu kullanarak spektrofotometredeki sıfırı 340 nm'ye ayarlayın.
    4. Her küvete 0.5 μL glikoz-6-fosfat dehidrogenaz ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından absorbansı 340 nm'de kaydedin.
       NOT: Emilim değerleri düşük olmalıdır, bu da numunelerin glikoz-6-fosfat ile çok az kontaminasyonunu gösterir.
    5. Her küvete 0.5 μL heksokinaz ekleyin. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin ve ardından absorbansı 340 nm'de kaydedin.
    6. Kuluçkaya oda sıcaklığında 5 dakika daha devam edin. Absorbansı bir kez daha 340 nm'de kaydedin. Emilim 15 dakikada kaydedilenden artmışsa, 5 dakika daha inkübasyona devam edin ve emilimini tekrar kontrol edin. Elde edilen 340 nm'de son emilimi kaydedin.
    7. Her numune için, glukoz-6-fosfat dehidrogenaz ilavesinden sonra kaydedilen 340 nm'deki absorbansı, hekzokinaz ilavesinden sonra elde edilen son absorbanstan çıkarın. Elde edilen değerleri, ilgili numunenin dallanma enzimi ile inkübe edildiği sürenin uzunluğuna göre çizin.

4. Glikojen dallanma enzim aktivitesinin tayini

1. Deney gününden önce, önce 10 mL suda 2.6 g KI'yi çözerek iyot / KI çözeltisi hazırlayın. Bir duman davlumbazında, 0.26 g iyot tartın ve KI çözeltisine ekleyin.
   DİKKAT: İyot ciltle temas ettiğinde veya solunduğunda zararlıdır. İyotu eritmek için karıştırın ve ışıktan korunan 4 ° C'de saklayın. Ayrıca 125 mM BORULAR tamponu, pH 6.8 hazırlayın (bakınız Tablo 3).
2. Deneylere başlarken, asitleştirilmiş iyot reaktifinin çalışan bir stoğunu yapın.
   1. 50 mL'lik bir tüpe 45.7 mL su alın ve 150 μL iyot / KI çözeltisi ve ardından 150 μL 1 M HCl ekleyin.
   2. İyice karıştırın ve ışıktan korunan 4 ° C'de saklayın. Çözelti bu koşullar altında en az 3 gün boyunca stabildir.
3. Deney gününde, taze bir 10 mg / mL amiloz çözeltisi yapın.
   1. 50 mg amiloz tartın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
   2. 200 μL mutlak etanol ekleyin ve hafifçe çalkalayın.
   3. 500 μL 2 M KOH ekleyin ve hafifçe çalkalayın.
      DİKKAT: KOH ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
   4. Hafifçe sallarken 0,5 mL su ekleyin. Amiloz tamamen çözünmezse, ilave 0,5 mL su ekleyin.
   5. 1 M HCl ile pH'ı ~6,5 ila 7,0 olarak ayarlayın.
      DİKKAT: HCl göz, cilt ve solunum yolu tahrişine neden olabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
   6. 5 mL'lik son hacme ulaşmak için su ekleyin.
   7. 0,2 μm şırınga uç filtresinden geçerek sterilize edin ve oda sıcaklığında saklayın. Üşütmeyin veya dondurmayın.
4. Bir su banyosunu önceden 30 ° C'ye ısıtın.
5. Her biri 1 mL asitlenmiş iyot reaktifi içeren on iki adet 1,5 mL tüp hazırlayın. Bankta bir kenara koyun. Bunlar dallanma enzim reaksiyonunu durdurmak için kullanılacaktır.
6. Her biri 150 μL amiloz, 150 μL PIPES tamponu ve 45 μL su içeren dört adet 1,5 mL tüp hazırlayın. Bu tüpler dallanma enzim testini yapmak için kullanılacaktır. Tüplerden ikisini Reaksiyon ve diğer iki tüp Kontrolü etiketleyin.
7. Zamanlanmış aralıklarla, Reaksiyon tüplerine 5 μL dallanma enzimi örneği ve dallanma enzimi örneğini Kontrol tüplerine hazırlamak için kullanılan 5 μL tampon ekleyin. 30 °C'de inkübe edin.
8. Tanımlanan zaman noktalarında (örneğin, 5, 10 ve 15 dakikalık inkübasyon), her bir Reaksiyon ve Kontrol tüpünden 10 μL çekin ve 1 mL asitlenmiş iyot reaktifi içeren 1,5 mL tüplere ekleyin. Ek 140 μL su ekleyin ve iyice karıştırın. Tek kullanımlık küvetlere aktarın.
   NOT: Numuneler mavi renkte olmalı ve çözelti herhangi bir çökelti içermemelidir. Oluşan renk, oda sıcaklığında en az 2 saat sabittir.
9. 1 mL asitlenmiş iyot reaktifi ve 150 μL su içeren bir numune hazırlayın. İyice karıştırın ve bir küvete aktarın. Spektrofotometredeki sıfırı 660 nm'ye ayarlamak için bu küveti kullanın.
10. On iki numunenin her birinin emiciliğini 660 nm'de okuyun. Dallanma enzimi varlığında elde edilen absorbansı, her zaman noktasında dallanan enzim bulunmadığında (Kontrol) absorbanstan çıkararak dallanan enzim reaksiyonunun hızını belirleyin. Ayrıntılar için Temsili Sonuçlar'a bakın.

5. Glikojen dallanmasının nitel değerlendirmesi

1. ~ 40 mL suya 74.5 g susuz kalsiyum klorür ekleyerek ve karıştırarak doymuş kalsiyum klorür çözeltisi hazırlayın. Biraz daha su ekleyin ve karıştırmaya devam edin. Hacmi suyla 100 mL'ye kadar çıkarın ve CaCl₂ tamamen çözünene kadar karıştırmaya devam edin.
2. 15 mL'lik bir tüpte 13 mL doymuş CaCl 2 çözeltisi ile 50 μL KI/iyot stok çözeltisini (yukarıdaki adım 4.1'e bakın) karıştırarak çalışan bir iyot/CaCl₂ renk reaktifi stoğu hazırlayın. İyice karıştırın ve ışıktan korunan 4 ° C'de saklayın. Çözelti bu koşullar altında en az 1 hafta boyunca stabildir.
3. Dallanmanın belirlenmesi
   1. 1,5 mL'lik bir tüpte, 650 μL iyot / CaCl₂ renk reaktif stoğunu 100 μL su ile birleştirin ve iyice karıştırın. Çözeltiyi tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.
      NOT: Küvetteki çözelti berrak ve soluk sarı renkte olmalıdır.
   2. Spektrofotometreye yerleştirin ve dalga boyu tarama modunda çalışarak, 330 nm ila 800 nm arasında bir arka plan spektrumu toplayın.
   3. 1,5 mL'lik bir tüpte, 650 μL çalışma iyotu / CaCl₂ renk reaktifini 50 μg istiridye glikojeni ile birleştirin. Son hacmi suyla 750 μL'ye getirin ve iyice karıştırın. Çözeltiyi tek kullanımlık bir metakrilat küvete aktarın.
      NOT: Küvetteki çözelti berrak ve koyu turuncu / kahverengi renkte olmalıdır.
   4. Spektrofotometreye yerleştirin ve 330 nm ila 800 nm arasında bir absorpsiyon spektrumu toplayın.
   5. 4.4.3 ile 4.4.4 arasındaki adımları 50 μg amilopektin ve 30 μg amiloz ile tekrarlayın.
      NOT: Amilopektin örneği sarı/yeşil, amiloz örneği yeşil/mavi olmalıdır. Her iki örnek de net olmalıdır. Oluşan renkli kompleksler, absorpsiyon spektrumunda herhangi bir değişiklik olmadan, oda sıcaklığında en az 1 saat boyunca kararlıdır.
   6. Karakterize edilmemiş bir glikojen numunesinin dallanmış yapısının bir göstergesini elde etmek için, 25 μg ila 50 μg glikojen ile 650 μL çalışma iyotu / CaCl₂ renk reaktifi ile birleştirin. Yukarıdaki gibi devam edin, hacmi suyla 750 μL'ye getirin, iyice karıştırın ve bir metakrilat küvete aktarın.
      NOT: Glikojen numunesi, mevcut glikojen dallanma derecesine (dış zincirlerin uzunluğu) bağlı olarak sarı / turuncu ila turuncu / kahverengi bir renk vermelidir. Yine, örnek açık olmalıdır. Ayrıntılar için Temsili Sonuçlar'a bakın.
   7. Emilim spektrumunu toplayın.

Sonuçlar

Glikojen sentaz aktivitesinin tayini
Şekil 1 , saflaştırılmış enzimler kullanılarak yapılan glikojen sentaz testlerinden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Panel A'da, hafif bir gecikmenin ardından, yaklaşık 12 dakikalık bir süre boyunca zaman içinde 340 nm'de emilimde doğrusal bir azalma oldu. Şekil 1A'daki absorpsiyondaki değişim oranı ~ 0.12 absorbans birimi / dak idi. ~0.010 ila ~0.20 absorbans birimi / da...

Tartışmalar

Genel olarak, sunulan tüm yöntemlerin temel avantajları, düşük maliyetleri, kolaylıkları, hızları ve özel ekipmanlara güvenmemeleridir. Hepsinin paylaştığı en büyük dezavantaj, mevcut diğer yöntemlere kıyasla hassasiyettir. NADH / NADPH üretimini veya tüketimini içeren prosedürlerin hassasiyetini tahmin etmek kolaydır. NADH / NADPH'nin yok olma katsayısının 6.22 M-1 ^cm-1 olduğu göz önüne alındığında, basit aritmetik konsantrasyondaki ~ ^10-20 μM değişikliklerin...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amylopectin (amylose free) from waxy corn	Fisher Scientific	A0456
Amylose	Biosynth Carbosynth	YA10257
ATP, disodium salt	MilliporeSigma	A3377
D-Glucose-1,6-bisphosphate, potassium salt	MilliporeSigma	G6893
D-glucose-6-phosphate, sodium salt	MilliporeSigma	G7879
Glucose-6-phosphate dehydrogenase, Grade I, from yeast	MilliporeSigma	10127655001
Glycogen, Type II from oyster	MilliporeSigma	G8751
Hexokinase	MilliporeSigma	11426362001
Methacrylate cuvettes, 1.5 mL	Fisher Scientific	14-955-128	Methacrylate is required since some procedures are conducted at 340 nm or below
β-Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate sodium salt	MilliporeSigma	N0505
β-Nicotinamide adenine dinucleotide, reduced disodium salt	MilliporeSigma	43420
Nucleoside 5'-diphosphate kinase	MilliporeSigma	N0379
Phosphoenolpyruvate, monopotassium salt	MilliporeSigma	P7127
Phosphoglucomutase from rabbit muscle	MilliporeSigma	P3397
Phosphorylase A from rabbit muscle	MilliporeSigma	P1261
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	MilliporeSigma	P0294
UDP-glucose, disodium salt	MilliporeSigma	U4625