Fare kardiyomiyositlerini sürekli olarak izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Özet

Kardiyolojide hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler için altın standart kardiyomiyositlerdir. Bu makalede, fare kardiyomiyositlerini izole etmek için Langendorff dışı tekniğe yapılan uyarlamalar açıklanmaktadır.

Özet

Yüksek kaliteli kardiyomiyositler veren tekrarlanabilir ancak teknik olarak basit yöntemlere duyulan ihtiyaç, kalp biyolojisindeki araştırmalar için gereklidir. Kardiyomiyositler üzerinde yapılan hücresel ve moleküler fonksiyonel deneyler (örneğin, kasılma, elektrofizyoloji, kalsiyum döngüsü, vb.) hastalığın mekanizmalarını belirlemek için altın standarttır. Fare, fonksiyonel deneyler için tercih edilen türdür ve açıklanan teknik, özellikle fare kardiyomiyositlerinin izolasyonu içindir. Langendorff aparatı gerektiren önceki yöntemler, aort kanülasyonu için yüksek düzeyde eğitim ve hassasiyet gerektirir ve sıklıkla iskemi ile sonuçlanır. Alan, basit, tekrarlanabilir ve fizyolojik veri toplama ve kültür için uygulanabilir miyositler veren Langendorff'suz izolasyon yöntemlerine doğru kaymaktadır. Bu yöntemler aort kanülasyonuna kıyasla iskemi süresini büyük ölçüde azaltır ve güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositlerle sonuçlanır. Langendorff'suz yönteme adaptasyonumuz, buz gibi soğuk temizleme çözeltisi ile ilk perfüzyonu, perfüzyon sırasında sabit bir iğne sağlayan stabilize edici bir platformun kullanımını ve fonksiyonel ölçümlerde ve kültürde kullanılmak üzere güvenilir bir şekilde elde edilen kardiyomiyositleri sağlamak için ek sindirim adımlarını içerir. Bu yöntemin uygulanması basit ve hızlıdır ve çok az teknik beceri gerektirir.

Giriş

On yıllar boyunca, kardiyak biyoloji literatüründe önemli bir fikir, moleküler etki mekanizmasıdır. Güvenilir çalışmaların yayınlanması için etki mekanizması kurulmalıdır. Moleküler mekanizmayı belirlemek için iyi kurulmuş bir strateji, güvenilir verilere ulaşmak için yüksek kaliteli kardiyomiyositler gerektiren izole kardiyomiyosit çalışmalarıdır. Kardiyomiyositler üzerinde etki mekanizmasını belirlemek için yapılan hücresel ve moleküler deneyler kasılma¹, elektrofizyoloji², kalsiyum (Ca²+) döngüsü³, miyofilaman^Ca2+ duyarlılığı⁴, hücre iskeleti⁵, metabolizma⁶, hormonların etkileri⁷, sinyal molekülleri⁸, ilaç çalışmaları⁹ araştırmak için altın standarttır ve saire. Fare, genetik manipülasyonun kolaylığı, küçük boyutu, nispeten kısa ömrü, düşük maliyeti vb.¹⁰ nedeniyle çoğu kardiyak biyoloji deneyi için tercih edilen tür haline gelmiştir. Bununla birlikte, yüksek kaliteli fare kardiyomiyositlerinin güvenilir izolasyonu, mevcut tekniklerle önemsiz değildir.

Laboratuvarlar neredeyse 70 yıldır kardiyomiyositleri izole ediyor¹¹. Kardiyomiyositleri izole etmek için hemen hemen tüm teknikler, kalbin çeşitli enzimler (kollajenaz, proteaz, tripsin vb.) Erken dönemlerde (1950'ler-1960'lar), kalbin çıkarılmasını, çok daha küçük parçalara ayrılmasını ve kollajenaz / proteaz / tripsin¹² ile çözelti içinde inkübe edilmesini içeren yığın yöntemi kullanılmıştır. 1970'lerde laboratuvarlar, koroner arter perfüzyonuna dayalı bir izolasyon tekniği (Langendorff cihazı aracılığıyla enzim ile retrograd perfüzyon) kullanarak kardiyomiyositleri izole eden iyileştirilmiş "Langendorff" yöntemi^13'ü uyguladı; Bu teknik, bugün sahada miyosit izolasyonunun baskın yöntemi olmaya devam etmektedir, ~ 50 yıl sonra^14,15,16. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, hipoksi süresini ve iskemik hasarı sınırlamak için kalbin in vivo olarak kanüle edilmesine kaymıştır ve bu da üstün kardiyomiyosit izolasyonları (daha iyi verim ve daha yüksek kalite) ile ^{sonuçlanmıştır17}. Son zamanlarda, bu in vivo, Langendorff içermeyen kalp perfüzyonları 18,19,20,21,22 performans göstermeye dönüşmüştür. Langendorff-free kardiyomiyosit izolasyon tekniğini Ackers-Johnson ve ^ark.18 tekniğine dayanarak geliştirdik ve önceki birçok izolasyon tekniğinden çeşitli bileşenleri uyarladık. Bu önemli uyarlamalar, buz gibi soğuk bir temizleme tamponunun enjeksiyonunu ve iğneyi stabilize etmek için destekleyici bir platformun dahil edilmesini içerir ve bu da kalbin manipülasyonunun azaltılmasına izin verir. Bu teknikte ayrıca ayrıntılı olarak açıklanan, enjekte edilen tamponların sıcaklık kontrolüdür (37 ° C), bu da daha önce yayınlandığı gibi daha az EDTA perfüzyonu nedeniyle in vivo enjeksiyon ve sindirim arasındaki süreyi azaltmıştır¹⁸. Kalbin manipülasyonunu azaltarak ve dolayısıyla delinme yeri boyutunu en aza indirerek, koroner arterlerin tam ve sürekli perfüzyonu elde edilir. Ayrıca tekniği ikincil bir yığın yöntemi sindirimi, enjekte edilen temizleme tamponundaki EDTA miktarı ile rafine ettik ve pH'ı değiştirdik. Tarif ettiğimiz teknik daha güvenilir, daha verimlidir ve Langendorff aparatının kullanımına kıyasla kapsamlı bir eğitim/uygulama gerektirmez (Tablo 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm prosedürler, Ohio State Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından NIH kurallarına uygun olarak onaylanmıştır.

1. Çözelti hazırlama

NOT: Tampon konsantrasyonları için lütfen Tablo 2'ye bakınız.

1. Ön izolasyon (miyosit izolasyonundan 2 hafta öncesine kadar)
   1. Perfüzyon tampon bazı: 1 L ultra saf 18.2 MΩ · cm H₂O. 0.22 μm steril filtrasyondan önce pH 7.4'e ayarlayın. İzolasyon gününe kadar 4 °C'de saklayınız.
   2. Temizleme tamponu: 1 L ultra saf 18,2 MΩ·cm H2 O'da 1 L temizleme tamponu (NaCl, KCl, NaH₂PO 4, HEPES, Glikoz, EDTA ve BDM) hazırlayın 0,22 μm steril filtrasyondanönce pH_7,4'e ayarlayın. İzolasyon gününe kadar 4 °C'de saklayınız.
   3. 100 mM CaCl 2 stok çözeltisi: 1,11 g CaCl 2'yi tartın ve 100 mL ultra saf 18,2 MΩ · cm_H2O. İzolasyon gününe kadar oda sıcaklığında saklayın.
   4. Liberaz alikotları: 5 mg sindirim enzimini 5 mL steril, RNaz içermeyen suda çözün. 0.8 mL alikot hazırlayın ve izolasyon gününe kadar -20 ° C'de saklayın.
   5. Bulaşıkları lamine edin: Steril, cam tabanlı 30 mL Petri kaplarına 100 μL 40 μg/mL fare laminin uygulayın. 30 dakika bekletin ve fazla laminin çıkarın. Laminini 30 dakika boyunca oda sıcaklığında UV inkübasyonlu bir Petri kabına yerleştirin. İzolasyon gününe kadar 4 ° C'de saklayın (lamine Petri tabakları 2 haftaya kadar kullanılabilir).
   6. DMEM ortamı: Bir biyogüvenlik kabininde, 46 mL DMEM'e 2,5 mL FBS, 0,5 mL Penisilin-Streptomisin (50 U/mL-50 μg) ve 1 mL 500 mM BDM ekleyin. İzolasyon gününe kadar 4 ° C'de saklayın (medya 2 haftaya kadar kullanılabilir).
   7. M199 ortamı: 1 L ultra saf 18,2 MΩ·cm H2 O. Steril filtrasyondan önce pH 7,4'e ayarlayın (0,22 μm filtre). İzolasyon gününe kadar 4 °C'de saklayınız.
   8. 500 mM BDM stoğu: 10 mL ultra saf 18,2 MΩ·cm_H2O'ya 0,5 g BDM ekleyin.
   9. Stabilize edici platform oluşturma: Luer stopcock'a vidalanan iğnenin tabanı etrafındaki kalıp oyun hamuru. Kalbi içerecek ve iğnenin ventrikül enjeksiyonu için uygun yükseklikte olmasını sağlayacak Petri kabına kalıplayın (çanağın tabanının ~ 5 mm üstünde).
2. İzolasyon günü
   1. Perfüzyon tamponu: İzolasyon gününde, 9.5 mg MgCl₂ ila 100 mL perfüzyon tampon tabanı ekleyin. 30 mL tamamlanmış perfüzyon tamponunu çıkarmadan önce tamamen karışmaya bırakın ve vidalı kapak kapağı (sindirim tamponu) olan temiz, geniş ağızlı, 100 mL'lik bir cam şişeye yerleştirin.
      NOT: Bu ilaveler, ilaveleri pH'ı ihmal edilebilir şekilde değiştirdiği için izolasyon gününde ek pH ayarlamaları yapılmadan yapılabilir.
      1. 12 mL perfüzyon tamponunu çıkarın ve yan tarafa koyun (durdurma tamponu). Kalan 58 mL perfüzyon tamponunu, vidalı kapak kapaklı temiz, geniş ağızlı, 100 mL'lik başka bir cam şişeye dökün. Kalan perfüzyon tamponunu izolasyon boyunca 37 °C'de saklayın.
   2. Sindirim tamponu: 25 μM'lik son konsantrasyon için 7,5 μL 100 mM CaCl₂ ila 30 mL perfüzyon tamponu ekleyin. İzolasyondan hemen önce, 26 μg / mL'lik nihai bir konsantrasyon için sindirim tamponuna 770 μL Liberaz ekleyin.
   3. Durdurma tamponu: 240 mg BSA'yı 12 mL perfüzyon tamponunda çözün. İzolasyon boyunca 37 °C'de saklayın.
   4. Temizleme tamponu: 3 mL'lik bir temizleme tamponu şırıngası hazırlayın ve kabarcıkların iğnesini temizleyin. İzolasyona kadar buz üzerinde saklayın.

2. Manifold hazırlığı

1. Sıcaklık kontrollü manifoldu yeni hazırlanmış perfüzyon tamponu ile temizleyin ve kabarcık kalmamasına dikkat edin. Bir Luer kilit konektörü kullanarak, 27 G iğneye vidalayın ve kabarcıkları temizleyin. Başarılı bir izolasyon için temizlenmiş bir manifold gereklidir.

3. Hayvan hazırlama

1. İzolasyondan hemen önce fareye intraperitoneal olarak vücut ağırlığına göre 100 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg ksilazin enjekte edin. Bu prosedürde 4 aylık bir erkek C57Bl/6 fare kullanılmıştır.
2. Gerekirse, sedasyonu teşvik etmek için fareyi ısıtılmış bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin. Farenin kollarını çadırlayın ve kuyruğun uzuvlarını ve tabanını mavi bir laboratuvar bezine bantlayın. Ayak parmağı sıkışma refleksinin çekilmesiyle hayvanın tamamen anestezi altına alındığından emin olun. Ameliyat alanının etrafına steril bir örtü uygulayın.

4. Kardiyomiyosit izolasyon prosedürü

1. Farenin sternumunu açığa çıkarın ve orta hatta yanal olarak, kaburgalardan ve aksilladan proksimal olarak kesin. Diyaframı nazikçe tamamen kesin, kalbi önlemek için sığ kesimler sağlayın. Sternumu bir hemostatla sıkıştırın ve göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları geriye doğru katlayın.
2. Perikadı kalpten yavaşça çıkarın ve hemen kalbe distal olan inferior vena kavadan tamamen kesin. 3 mL buz gibi soğuk temizleme tamponunu 1 dakika boyunca kalbin sağ ventrikülüne hızlı bir şekilde enjekte etmek için 27 G iğneli 3 mL'lik bir şırınga kullanın.
3. Cımbız kullanarak kalbi yavaşça tutun ve aortun mümkün olduğunca çoğunu açığa çıkararak vücuttan çekin. Bir hemostat kullanarak, yükselen aortu kelepçeleyin, atriyumu sıkıştırmamaya dikkat edin ve kalbi göğüsten çıkarın.
4. Kelepçeli kalbi, yaklaşık 10 mL ılık perfüzyon tamponu ile bir polipropilen Petri kabının kapağına hızlı bir şekilde aktarın. Kelepçeli kalbi destek platformuna yerleştirin ve 5 dakika boyunca sol ventriküle 10 mL sıcaklık kontrollü 37 °C perfüzyon tamponu enjekte etmek için manifolda bağlı stabilize edilmiş bir 27 G iğne kullanın.
5. Kelepçeli kalbi ve destek platformunu yaklaşık 5 mL sindirim tamponuna sahip bir Petri kabına aktarın. Giriş şırıngalarını, 25 mL sindirim tamponuna sahip 50 mL'lik bir şırınga için değiştirin.
6. Enjeksiyondan önce herhangi bir kabarcığın manifoldunu ve kalan perfüzyon tamponunu temizleyin. İğneyi dikkatlice sol ventrikül tepesindeki aynı iğne pozisyonuna yerleştirin.
7. Sıcaklık kontrollü 37 °C sindirim tamponunu 50 mL'lik bir şırınga kullanarak 15 dakika boyunca sol ventriküle enjekte etmek için bir perfüzyon pompası kullanın. Çözeltinin sıcaklığını, iğnenin sonunda 37 ° C'lik çözeltiyi çıkarmak için önceden kalibre edilmiş bir su ceketi ile kontrol edin.
8. Ventrikülleri atriyumdan çıkarın ve 10 mL'lik bir behere aktarın. Beherin içine 3 mL sindirim tamponu ekleyin ve keskin makas kullanarak ventrikülleri büyük parçalar halinde kesin. Beheri alüminyum folyo ile örtün ve 5 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtılmış sallanan bir su banyosuna yerleştirin.
9. Süpernatanı atın, herhangi bir doku parçasını çıkarmaktan kaçınmaya dikkat edin. Doku parçalarını 3 mL sindirim tamponunda tekrar askıya alın ve yaklaşık 4 dakika boyunca veya homojen bir karışım elde edilene kadar tritüre edin.
10. Hücreleri 70 μm'lik bir naylon hücre süzgecinden 50 mL'lik bir polipropilen tüpe filtreleyin.
11. Filtreyi 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir polipropilen tüpe geri koyun ve 100 rpm'de 1 dakika boyunca santrifüj. Supernatantı atın ve peleti 3 mL durdurma tamponunda tekrar askıya alın.
12. 1,8 mM'lik nihai bir CaCl 2 konsantrasyonu için askıya alınmış hücrelere 54 μL 100 mM CaCl₂ stoğu ekleyin. Bu adım, hücre verimini artırmak için kademeli olarak da gerçekleştirilebilir.
13. Ölü hücreler içeren süpernatantı çıkarmadan önce canlı hücrelerin 10 dakika boyunca yerçekimi ile yerleşmesine izin verin. Peletin depolama çözeltisinde yeniden askıya alınması (200 μM CaCl₂ ile perfüzyon çözeltisi). Bu hücreler artık fonksiyonel deneyler (yani kalsiyum görüntüleme / kasılma, yama kelepçesi, vb.), Kültür vb. İçin kullanılabilir.
    NOT: Hücreler ayrıca laboratuar veya deneye bağımlı çözeltilerde yeniden askıya alınabilir.

5. Hücre kültürü

1. Hücreleri bir hemositometre kullanarak veya ızgaralı bir kapak fişi kullanarak bir alan görünümü sayımı ile sayın. Miyositler çok büyük olduğundan, hemositometre kullanarak saymak her zaman doğru değildir. Bu, izolasyondan yaklaşık kaç hücre elde edildiğine dair bir fikir edinmek için kullanılır.
2. DMEM ortamı ile hücreleri ~ 25.000 hücre / mL'ye seyreltin. Her bir kuyucuğa 1 mL hücre çözeltisi ekleyin.
3. 2 saat boyunca 37 ° C,% 95_O2,% 5 CO_2'de inkübe edin.
4. DMEM ortamını her bir kuyucuktan nazikçe aspire edin ve 2 mL M199 ortamı ekleyin.
5. 37 ° C'de,% 95 O 2,% 5 CO_2'de 24 saate kadar inkübe edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bir izolasyonun başarısını belirlerken incelenmesi gereken birkaç unsur vardır. İlk olarak, kardiyomiyositler, Şekil 1'de izole edilen hücreler gibi membran lekeleri olmadan çubuk şeklinde olmalıdır. Tipik bir izolasyon, çubuk şeklindeki miyositlerin ~% 80'ini verecektir. İzolasyon% 50'den daha az çubuk şeklindeki hücreler verirse, başarısız bir izolasyon olarak kabul edilir ve kardiyomiyositler kullanılmaz. Son olarak, kardiyomiyositler sessiz olmalıdır. Spontan kon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Langendorff içermeyen kardiyomiyosit izolasyon tekniğimizin temel avantajı, Langendorff cihazına kanülasyon gerektirmeyerek hipoksi ve iskemik zamanı sınırlamasıdır. Kalbin çıkarılması, temizlenmesi ve asılması birkaç dakika süren ve genellikle miyositte iskemik hasara neden olan klasik Langendorff tekniklerine alternatif olarak, yöntemimiz buz gibi soğuk bir temizleme çözeltisi ile kanın in vivo temizlenmesini içerir. Buz gibi soğuk temizleme tamponu, etilendiamintetraasetik as...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cc Bd Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-827-52
10 mL Pyrex Low-Form Beaker	Cole-Palmer	UX-34502-01
100 mL polypropylene cap glass media storage bottle	DWK Life Sciences	UX-34523-00
14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap	Fisher Sci	14-959-11B
2,3-Butanedione Monoxime	Sigma	B0753	>98%
3 cc BD Luer-Lok Syringe	Fisher Sci	14-823-435
35 mm glass bottom dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-20-C
50 mL BD Syringe without Needle	Fisher Sci	13-689-8
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Cole-Palmer	EW-22999-84
95% O2 5% CO2
AIMS Space Gel Heating Pad	Fisher Sci	14-370-223
BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Hypodermic Needles	Becton Dickinson	305109
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3803	Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, >98%
Calcium Chloride dihydrate	Sigma	C7902	>99%
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	Suitable for cell culture, >99.5%
DMEM	Fisher Sci	11965092
EDTA	Fisher Sci	AAA1071336
Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish	Corning	353003
FBS	R&D Systems (Bio-techne)	S11195
Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators	Fisher Sci	13-874-432
Hartman Mosquito Hemostatic Forceps	World Precision Instruments	15921
Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set	Fisher Sci	02-671-11
HEPES	Sigma	H4034	>99.5%
Labeling Tape	Fisher Sci	15-901-10R
Legato 100 Syringe Pump	kdScientific	788100
L-glutathione	Fisher Sci	ICN19467980
Liberase TH Research Grade	Sigma	5401135001	High thermolysin concentration
M199	Fisher Sci	MT10060CV
Magnesium Chloride	Invitrogen	AM9530G
Mouse Laminin	Corning	354232
Pen/Strep	Fisher Sci
Potassium Chloride	Sigma	P5405	>99%
Precision Digital Reciprocating Water Bath	ThermoFisher Scientific	TSCIR19
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Suitable for cell culture
Sodium Chloride	Sigma	S5886	>99%
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S5011	>99%
Sterile Cell Strainer 70 µm	Fisher Sci	22-363-548
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	91460-11
VWR Absorbent Underpads	Fisher Sci	NC9481815