JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Mevcut protokol, orta hızlarda çalışan koşu bandı sırasında üretilen kemirgenlerin kafalarında mekanik ivmelenmeleri yeniden üreten özel olarak tasarlanmış bir "pasif kafa hareketi" sistemini tanımlamaktadır. Mekanik faktörlerin / elementlerin fiziksel egzersizin faydalı etkilerinden diseksiyonuna izin verir.

Özet

Egzersiz, beyin fonksiyon bozukluğu ile ilgili olanlar da dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar ve fiziksel bozukluklar için etkili olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, egzersizin yararlı etkilerinin arkasındaki moleküler mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Birçok fiziksel egzersiz, özellikle koşu ve yürüyüş gibi aerobik egzersizler olarak sınıflandırılanlar, ayakla yere temas ettiğinde dürtüsel kuvvetler üretir. Bu nedenle, mekanik etkinin egzersizin organizmasal homeostaza nasıl katkıda bulunduğuna bağlı olabileceği düşünülmektedir. Bu hipotezi beyinde test etmek için, kontrollü ve tanımlanmış büyüklükler ve modlarla dikey ivmelenmeler üretebilen ve orta hızlarda çalışan koşu bandı sırasında kemirgenlerin kafalarına uygulanabilecek mekanik stimülasyonu yeniden üretebilen, hayvanlarda egzersizin etkilerini test etmek için tipik bir müdahale olan özel olarak tasarlanmış bir "pasif kafa hareketi" (bundan böyle PHM olarak anılacaktır) sistemi geliştirilmiştir. Bu sistem kullanılarak, PHM'nin farelerin prefrontal korteks (PFC) nöronlarındaki serotonin (5-hidroksitriptamin, bundan böyle 5-HT olarak anılacaktır) reseptör alt tipi 2A (5-HT2A) sinyalini özetlediği gösterilmiştir. Bu çalışma, PHM'yi uygulamak ve kemirgenlerin kafalarında ortaya çıkan mekanik ivmelenmeleri ölçmek için ayrıntılı protokoller sunmaktadır.

Giriş

Egzersiz, diabetes mellitus ve esansiyel hipertansiyon gibi yaşam tarzı hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli fiziksel bozuklukları tedavi etmek veya önlemek için faydalıdır1. Bununla ilgili olarak, egzersizin beyin fonksiyonları üzerindeki olumlu etkilerine ilişkin kanıtlar da toplanmıştır2. Bununla birlikte, egzersizin beyin için faydalarının altında yatan moleküler mekanizmalar öncelikle aydınlatılmamıştır. Çoğu fiziksel aktivite ve egzersiz, en azından bir dereceye kadar kafada mekanik hızlanmalar üretir. Çeşitli fizyolojik fenomenler mekanik olarak düzenlenirken, mekanik yüklemenin önemi, çoğu durumda, kas-iskelet sistemi 3,4,5'te belgelenmiştir. Beyin, fiziksel aktiviteler sırasında, özellikle de darbeci egzersizler olarak adlandırılan mekanik kuvvetlere maruz kalmasına rağmen, fizyolojik beyin fonksiyonunun mekanik düzenlemesi nadiren çalışılmıştır. Kafadaki mekanik ivmelenmelerin oluşumu fiziksel egzersizlerde nispeten yaygın olduğu için, mekanik düzenlemenin egzersizin beyin fonksiyonlarına faydalarında rol oynayabileceği düşünülmektedir.

5-HT2A reseptör sinyali, sinir sisteminde işlev gören çeşitli biyokimyasal sinyaller arasındaki duygu ve davranışların düzenlenmesinde esastır. Egzersizin terapötik olarak etkili olduğu kanıtlanmış çoklu psikiyatrik hastalıklarda 6,7,8'de rol oynar. 5-HT2A reseptörü, serotonin ailesine ait 5-HT2 reseptörünün bir alt tipidir ve aynı zamanda sinyalizasyonu ligand-bağımlı veya -bağımsız9 içselleştirilmesi ile modüle edilen G-proteinine bağlı reseptör (GPCR) ailesinin bir üyesidir. Kafa seğirmesi, miktarı (frekansı) prefrontal korteks (PFC) nöronlarında10,11 sinyal veren 5-HT2A reseptör sinyalinin yoğunluğunu açıkça temsil eden kemirgenlerin karakteristik bir davranışıdır. Uygulanan 5-HT'ye (kafa seğirmesi yanıtı, bundan böyle HTR olarak anılacaktır; Ek Film 1'e bakınız) verilen bu halüsinojenik yanıtın katı özgüllüğünden yararlanarak, egzersizin beyin fonksiyonları üzerindeki etkilerindeki mekanik etkiler üzerine yukarıda belirtilen hipotez test edilmiştir. Bu nedenle, zorla egzersiz (koşu bandı koşusu) veya egzersizi taklit eden mekanik müdahaleye (PHM) maruz kalan farelerin HTR'sini analiz ettik ve karşılaştırdık.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Ulusal Engelliler Rehabilitasyon Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. 8-9 haftalık erkek Sprague-Dawley sıçanları, koşu bandı koşusu ve PHM sırasında kafadaki hızlanmaları ölçmek için kullanıldı. Davranış testleri ve PFC'nin histolojik analizleri için 9-10 haftalık erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.

1. Koşu bandı çalışması sırasında x-, y- ve z eksenleri boyunca ivmelenmelerin büyüklüklerinin ölçülmesi

  1. Sıçanı% 1.5 izofluran inhalasyonu ile anestezi yapın.
    NOT: Sıçanlar laboratuvar ortamına en az 1 hafta alıştıktan sonra kullanılmıştır. Sıçanın bir arka bacak ayak parmağı sıkışmasına duyarlı olmadığından emin olun.
  2. İvmeölçeri (bakınız Malzeme Tablosu) cerrahi bant kullanarak sıçanın başının üstüne sabitleyin.
  3. Anesteziden tamamen kurtulduktan sonra, sıçanı koşu bandı makinesine yerleştirin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve koşu bandını orta bir hıza (20 m / dak) ayarlayın12 (Şekil 1A).
    NOT: İzofluran inhalasyonunun sona ermesinden sonra sıçanın anesteziden tamamen iyileştiğini doğrulamak ve koşu bandı deneyine başlamak en az 20 dakika sürdü. Sıçanın bir arka bacak ayak parmağı sıkışmasına duyarlı olduğundan, belirgin bir şaşkınlık olmadan yürüyebildiğinden veya koşabildiğinden emin olun.
  4. Üreticinin talimatlarını izleyerek uygulama yazılımını kullanarak sıçan koşu bandı çalışması sırasında dikey ivmelenmelerin büyüklüğünü ölçün (bkz.
    NOT: 10 seri dalgayı ayıklayın ve 3 boyutlu eksenler boyunca ortalama ivmeleri ayrı ayrı hesaplayın (x-, y- ve z-eksenleri, Şekil 1B). Tepe büyüklükleri, basamaklı senkronize dalgalar (~ 2 Hz frekans) koşu bandı koşu bandı kaynaklı ivmelenmeler olarak tanımlanarak ölçülmüştür (Şekil 1C). Bu çalışma için sıçanlar kullanıldı, çünkü daha büyük vücut boyutları, farelerde mümkün olmayan kafadaki dikey ivmeyi güvenilir bir şekilde ölçmek için uygundu. Bununla birlikte, fareler, kafa seğirme yanıtının nicel analizi ile ilgili kolaylık ve güvenilirlik nedeniyle daha ileri çalışmalar için kullanılmıştır.

2. PHM sisteminin ayarlanması ve PHM'nin farelere uygulanması

  1. Platformun salınımının genliğini ve pervane şeklindeki kamın dönme hızını PHM sisteminde önceden ayarlayın (Şekil 1D), böylece dikey ivmenin büyüklüğü ve frekansı adım 1.4'te elde edilen değerlerle eşleşir.
    NOT: PHM sistemi metal bir çerçeve ve ahşap platformdan oluşur. Motor hızı, dahili sürücüye bağlı kadran ayarlanarak değiştirilebilir ve kontrol edilebilir (bkz. 600 kadran ölçeği 2 Hz'e karşılık geliyor, Şekil 1E. Pervane şeklindeki kam, 5 mm adım yüksekliğinde dört bileğe sahiptir (Şekil 1F).
  2. Fareyi% 1.2 izofluran soluyarak anestezi altına alın.
    NOT: Fareler laboratuvar ortamlarına en az 1 hafta alıştıktan sonra kullanılmıştır. Farenin arka bacak ayak parmağı sıkışmasına yanıt vermediğinden emin olun.
  3. Fareyi, sırasıyla kafa ve vücudun geri kalanı salınımlı ve statik platformlarda olacak şekilde eğilimli bir konuma getirin.
    NOT: Fareyi anestezi altında tutun (%1,2 izofluran).
  4. Platformu dikey olarak salınıma sokmak için motoru açın ve fareye PHM uygulayın.
    NOT: Motor hızı, platformu 2 Hz'de salınım yapacak şekilde ayarlanmıştır (bkz. adım 2.1). Kontrol faresini de aynı şekilde anestezi altına alın ve PHM platformuna yerleştirin, ancak motoru kapalı bırakın.

3. Farenin koşu bandında çalıştırılması

  1. Fareyi koşu bandı makinesinin üzerine getirin ve koşu bandını orta bir hıza (10 m/dak)13 ayarlayın.

4. Fare kafası-seğirme tepkisinin (HTR) ölçülmesi

  1. Video kamerayı (kare hızı: 24 fps) şeffaf plastik kutudaki tüm alanı kaydedecek şekilde ayarlayın.
    NOT: Plastik kafes, fareyi video kaydı alanında tutmak için kullanılmıştır.
  2. İntraperitoneal olarak 5-hidroksitriptofan (5-HTP) (100 mg / kg) (bakınız Malzeme Tablosu), 5-HT'nin öncüsü, bir fareye uygulayın.
  3. Fareyi şeffaf kafese yerleştirin ve 30 dakika boyunca kayda başlayın.
  4. Kaydedilen videoyu (1/2x veya 1/3x hız) gözden geçirin ve kafa seğirmesini manuel olarak sayın.
    NOT: Analistler deneysel prosedüre kör olmadılar. Farenin karakteristik "tik benzeri" hızlı hareketi ( Ek Film 1'e bakınız), normal üreme ortamında nadiren meydana gelen kafa seğirmesi olarak sayılmıştır.

5. Fare PFC'sinin immünohistokimyasal analizi

  1. HTR testleri tamamlandıktan sonra, midazolam (4.0 mg / kg), butorphanol (4.0 mg / kg) ve medetomidin (0.3 mg / kg) karışımını uygulayarak fareyi anestezi altına alın, PBS'de% 4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edin ve daha önce yayınlanan raporlar 14,15'i takiben beyni tüketin.
  2. Beyinleri PBS'de% 4 PFA'da 4 ° C'de 24 saat daha sabitleyin ve% 30 sakkaroz / PBS'de batana kadar saklayın. Sabit optimum kesme sıcaklığı bileşiğini dondurun (OCT bileşiği, bkz.
  3. Fare beyninin kriyo bölümlerini slayt kutusundan alın (bkz. Numuneler tamamen kuruyana kadar slaytları oda sıcaklığında temiz mendiller üzerinde bırakın.
    NOT: Yirmi mikrometre kalınlığında sagital kesitler (Yanal +0,5–1,5 mm), bir kriyostat kullanılarak OCT bileşiğine gömülmüş dondurulmuş numunelerden hazırlanmıştır (bakınız Malzeme Tablosu).
  4. Çözeltinin yayılma alanını sınırlamak üzere slayttaki kriyokesitli dokunun etrafına bir daire çizmek için sıvı bloker kalem kullanın (Tris tamponlu salinde (TBS-T) % 0.1 Ara-20).
  5. Nemli bir ortam yaratmak için sönümlenmiş mendilleri slaytları tutan bir tepsinin altına yerleştirin.
  6. TBS-T ile geçirgenlikten sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 4 eşek serumu (Malzeme Tablosuna bakınız) ile bloke edin.
  7. Slaytları TBS-T'ye 5 dakika daldırarak bir kez durulayın.
  8. Her slayta 100 μL uygun şekilde seyreltilmiş birincil antikor ve DAPI ( bakınız Malzeme Tablosu) karışımı uygulayın, numunenin kurumasını önlemek için tepsiyi örtün ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  9. TBS-T ile üç kez durulayın (her biri 5 dakikalık inkübasyon).
  10. Her slayta 100 μL uygun şekilde seyreltilmiş türlerle eşleşen floresan sekonder antikoru (Alexa Fluor 488, 568 veya 645 ile konjuge edilmiş) uygulayın (bkz. Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin.
  11. TBS-T ile üç kez durulayın (her biri 5 dakikalık inkübasyon).
  12. Kızakları montaj ortamıyla monte edin (bkz. Slaytları kapak fişleriyle örtün.
  13. Örneği bir floresan mikroskobu altında görüntüleyin.

Sonuçlar

Koşu bandı sırasında sıçanların kafalarındaki dikey ivmelenmelerin orta hızda (20 m / dak) çalışması sırasında tepe büyüklüğü yaklaşık 1.0 × g idi (Şekil 1C). PHM sistemi (Şekil 1D), kemirgenlerin kafalarında 1.0 × g'lık dikey ivme zirveleri üretmek için kurulmuştur.

Farelere PHM uygulaması (2 Hz, 7 gün boyunca 30 dakika / gün), kontrol farelerine kıyasla HTR'lerini önemli ölçüd...

Tartışmalar

Geliştirilen PHM uygulama sistemini kullanarak, PFC nöronlarındaki 5-HT sinyallemesinin mekanik olarak düzenlendiğini gösterdik. Egzersiz etkilerinin karmaşıklığı nedeniyle, egzersizin sonucunu sağlığın teşviki bağlamında tam olarak incelemek zor olmuştur. Odak noktası, enerji tüketimi gibi egzersiz aktiviteleriyle veya daha sonra egzersiz aktiviteleriyle ortaya çıkabilecek metabolik olayların katılımını veya katkısını önlemek için mekanik yönlerdir. Burada açıklanan yöntemin, egzersi...

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalede açıklanan çalışma ile ilgili rakip bir çıkar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen Japon Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'ndan Intramural Araştırma Fonu tarafından desteklenmiştir; Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden Bilimsel Araştırma için Hibeler (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); Özel Üniversitelerde Stratejik Araştırmalar Vakfı için MEXT-Destekli Program, Japonya Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan 2015-2019 (S1511017); Naito Bilim ve Mühendislik Vakfı. Bu araştırma aynı zamanda Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NICHD), Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NINDS) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü (NIBIB) tarafından P2CHD086843 Ödül Numarası altında desteklenen Rejeneratif Rehabilitasyon Araştırma ve Eğitim İttifakı'ndan (AR3T) fon aldı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
5-hydroxytryptophan (5-HTP)Sigma-AldrichH9772Serotonin (5-HT) precursor
Brushless motor driverOriental motorBMUD30-A2Speed changer build-in motor driver
C57BL/6 miceOriental yeast companyC57BL/6JMice used in this study
CryostatLeicaCM33050SMicrotome to cut frozen samples
DC MotorOriental motorBLM230-GFV2Motor
Donkey anti-goat Alexa Fluor 568InvitrogenA-11057Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647InvitrogenA-31571Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA-21206Secondary antibody used for immunohistochemical staining
Donkey serumSigma-AldrichS30-100MLBlocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining
Fluorescence microscopeKeyenceBZ-9000Fluorescence microscope
Goat polyclonal anti-5-HT2A receptorSanta Cruz Biotechnologysc-15073Primary antibody used for immunohistochemical staining
IsofluranePfizerv002139Inhalation anesthetic
KimWipeNIPPON PAPER CRECIAS-200Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory
Liquid BlockerDaido SangyoPAP-SMarker used to make the slide surface water-repellent
Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60)EMD Millipore (Merck)MAB377Primary antibody used for immunohistochemical staining
NinjaScan-LightSwitchscienceSSCI-023641Accelerometer to measure accelerations
OCT compoundSakura Finetek45833Embedding agent for preparing frozen tissue sections
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36934Mounting medium to prevent flourscence fading
Rabbit polyclonal anti-c-FosSanta Cruz Biotechnologysc-52Primary antibody used for immunohistochemical staining
Slide boxAS ONE03-448-1Opaque box to store slides
Spike2Cambridge electronic design limited (CED)N/AApplication software used to analyze acceleration
Sprague-Dawley ratsJapan SLCSlc:SDRats used in this study
Treadmill machineMuromachiMK-680System used in experiments of forced running of rats and mice

Referanslar

  1. Lackland, D. T., Voeks, J. H. Metabolic syndrome and hypertension: regular exercise as part of lifestyle management. Current Hypertension Reports. 16 (11), 1-7 (2014).
  2. Heyn, P., Abreu, B. C., Ottenbacher, K. J. The effects of exercise training on elderly persons with cognitive impairment and dementia: a meta-analysis. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 85 (10), 1694-1704 (2004).
  3. Saitou, K., et al. Local cyclical compression modulates macrophage function in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Clinical Science. 132 (19), 2147-2161 (2018).
  4. Sakitani, N., et al. Application of consistent massage-like perturbations on mouse calves and monitoring the resulting intramuscular pressure changes. Journal of Visualized Experiments. (151), e59475 (2019).
  5. Miyazaki, T., et al. Mechanical regulation of bone homeostasis through p130Cas-mediated alleviation of NF-κB activity. Scientific Advances. 5 (9), (2019).
  6. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annual Review of Medicine. 60 (1), 355-366 (2009).
  7. Canli, T., Lesch, K. -. P. Long story short: the serotonin transporter in emotion regulation and social cognition. Nature Neuroscience. 10 (9), 1103-1109 (2007).
  8. Roth, B., Hanizavareh, S. M., Blum, A. Serotonin receptors represent highly favorable molecular targets for cognitive enhancement in schizophrenia and other disorders. Psychopharmacology. 174 (1), 17-24 (2003).
  9. Bhattacharyya, S., Puri, S., Miledi, R., Panicker, M. M. Internalization and recycling of 5-HT2A receptors activated by serotonin and protein kinase C-mediated mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (22), 14470-14475 (2002).
  10. Canal, C. E., Morgan, D. Head-twitch response in rodents induced by the hallucinogen 2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine: a comprehensive history, a re-evaluation of mechanisms, and its utility as a model. Drug Testing and Analysis. 4 (7-8), 556-576 (2012).
  11. Halberstadt, A. L., Geyer, M. A. Characterization of the head-twitch response induced by hallucinogens in mice: detection of the behavior based on the dynamics of head movement. Psychopharmacology (Berl). 227 (4), 727-739 (2013).
  12. Kim, S. -. E., et al. Treadmill exercise prevents aging-induced failure of memory through an increase in neurogenesis and suppression of apoptosis in rat hippocampus. Experimental Gerontology. 45 (5), 357-365 (2010).
  13. Li, H., et al. Regular treadmill running improves spatial learning and memory performance in young mice through increased hippocampal neurogenesis and decreased stress. Brain Research. 1531, 1-8 (2013).
  14. González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT2A receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
  15. Ryu, Y., et al. Mechanical regulation underlies effects of exercise on serotonin-induced signaling in the prefrontal cortex neurons. iScience. 23 (2), 100874 (2020).
  16. Shefer, G., Rauner, G., Stuelsatz, P., Benayahu, D., Yablonka-Reuveni, Z. Moderate-intensity treadmill running promotes expansion of the satellite cell pool in young and old mice. FEBS Journal. 280 (17), 4063-4073 (2013).
  17. Wang, J., et al. Moderate exercise has beneficial effects on mouse ischemic stroke by enhancing the functions of circulating endothelial progenitor cell-derived exosomes. Experimental Neurology. 330, 113325 (2020).
  18. Pacák, K. Stressor-specific activation of the hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Physiological Research. 49, 11-17 (2000).
  19. Okamoto, M., Soya, H. Mild exercise model for enhancement of hippocampal neurogenesis: A possible candidate for promotion of neurogenesis. The Journal of Physical Fitness and Sports Medicine. 1 (4), 585-594 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 185Pasif kafa hareketiinterstisyel s v aks v kayma stresi5 HT2A resept rprefrontal korteksfiziksel egzersiz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır