Primer Hastaya Özgü Aort Düz Kas Hücrelerinin İzolasyonu ve Yarı Kantitatif Gerçek Zamanlı Kasılma Ölçümleri In Vitro

Özet

Bu yazıda birincil, hastaya özgü insan aort düz kas hücrelerinin ve dermal fibroblastların izolasyonu ve kültürlenmesi için eksplant kültürüne dayalı bir yöntem anlatılmaktadır. Ayrıca, hücre kasılmasını ölçmek ve daha sonra bu hücrelerdeki hastaya özgü farklılıkları incelemek için kullanılabilecek yeni bir yöntem sunulmaktadır.

Özet

Düz kas hücreleri (SMC'ler) aort ortamındaki baskın hücre tipidir. Kasılma mekanizmaları aorttaki kuvvetin iletimi için önemlidir ve vazokonstriksiyon ve vazodilatasyonu düzenler. SMC kontraktil aparat proteinlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar, torasik aort anevrizmaları gibi aort hastalıkları ile ilişkilidir. SMC kasılmasını in vitro olarak ölçmek, özellikle hasta materyalini taramak için gerekli olan yüksek verimli bir şekilde zordur. Şu anda mevcut yöntemler bu amaç için uygun değildir. Bu yazıda elektrik hücre-substrat empedans algılamasına (ECIS) dayanan yeni bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak, aort anevrizmalarının incelenmesi için hastaya özgü insan primer SMC'lerini aort biyopsilerinden ve hastaya özgü insan primer dermal fibroblastlarından izole etmek için bir eksplant protokolü tanımlanmıştır. Daha sonra, bu hücrelerin kasılma tepkisini ölçmek için, farklı grupları karşılaştırmak için sonraki analiz ve öneri de dahil olmak üzere yeni bir kasılma yönteminin ayrıntılı bir açıklaması verilir. Bu yöntem, translasyonel (kardiyovasküler) çalışmalar ve hasta ve ilaç tarama çalışmaları bağlamında yapışkan hücrelerin kasılmasını incelemek için kullanılabilir.

Giriş

Düz kas hücreleri (SMC'ler), aortun en kalın tabakası olan aort medial tabakasında baskın hücre tipidir. Duvar içinde, radyal olarak yönlendirilirler ve diğer fonksiyonların yanı sıra vazokonstriksiyon ve vazodilatasyon^1'de rol oynarlar. SMC kontraktil makinesi, aorttaki kuvvetin hücre dışı matris² ile fonksiyonel bağlantı yoluyla iletilmesinde rol oynar. Düz kas miyozin ağır zinciri (MYH11) ve düz kas aktini (ACTA2) gibi SMC kontraktil aparatının proteinlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar, ailesel torasik aort anevrizması vakalarıyla ilişkilendirilmiş ve SMC kasılmasının aortun yapısal ve fonksiyonel bütünlüğünün korunmasındaki önemini vurgulamıştır ^1,2 . Ayrıca, TGFβ sinyal yolundaki mutasyonlar da aort anevrizmaları ile ilişkilidir ve bunların aort anevrizması patofizyolojisindeki etkileri deri fibroblastlarında da incelenebilir³.

SMC kasılmasının in vitro yüksek verimli ölçümü zordur. SMC kontraktilitesi insanlarda in vivo olarak ölçülemediğinden, insan hücreleri üzerindeki in vitro testler uygulanabilir bir alternatif sunar. Ayrıca, hayvan modellerinde abdominal aort anevrizması (AAA) gelişimi, örneğin elastaz perfüzyonu tarafından kimyasal olarak indüklenir veya spesifik bir mutasyondan kaynaklanır. Bu nedenle, hayvan verileri, çoğunlukla sigara, yaş ve / veya ateroskleroz gibi çok faktörlü bir nedene sahip olan insanlarda AAA gelişimi ile karşılaştırılamaz. İn vitro SMC kontraktilitesi şimdiye kadar esas olarak traksiyon kuvveti mikroskobu^4,5, Fura-2 floresan hücre içi kalsiyum akılarının nicelleştirilmesi⁶ ve kollajen buruşma tahlilleri⁷ ile ölçülmüştür. Çekiş kuvveti mikroskobu, tek bir hücre tarafından üretilen kuvvetler hakkında paha biçilmez sayısal bilgiler sağlarken, karmaşık matematiksel veri işleme ve bir seferde bir hücrenin analizi nedeniyle yüksek verimli tarama için uygun değildir, bu da donör başına temsili bir hücre sayısını ölçmenin çok zaman alıcı olduğu anlamına gelir. Fura-2 boya ve kollajen kırışma testleri, kasılmanın yüzeysel olarak belirlenmesine izin verir ve kesin bir sayısal çıktı vermez, bu da onları hastaya özgü farklılıkları ayırt etmek için daha az uygun hale getirir. Abdominal aort anevrizması hastalarının aortundan türetilen hücrelerde bozulmuş SMC kontraksiyonu, SMC kontraksiyonunu in vitro⁸ ölçmek için yeni bir yöntemin optimize edilmesiyle ilk kez gösterilmiştir. Bu, elektrik hücre-substrat empedans algılama (ECIS) yönteminin yeniden kullanılmasıyla yapıldı. ECIS, SMC büyümesi ve yara iyileşmesi ve göç tahlillerinde davranış 12,13,14 gibi yapışkan hücre davranışı ^{ve kasılmasının 9,10,11} miktarının ölçülmesi için gerçek zamanlı, orta verimli bir testtir. Tam yöntem protokol bölümünde açıklanmıştır. Bu optimize edilmiş şekilde, ECIS, benzer boyut ve morfolojileri nedeniyle fibroblast kasılmasını incelemek için de kullanılabilir.

Bu makalenin amacı, ECIS⁸ kullanarak SMC kontraksiyonunu in vitro olarak ölçme yönteminin aşamalı bir tanımını sağlamak ve kontrol ile hasta SMC'leri arasındaki kontraksiyonu karşılaştırmaktır. İlk olarak, primer SMC'lerin kontrol ve hasta aort biyopsilerinden izole edilmesi ve kültürlenmesi, kasılma ölçümü için kullanılabilecek şekilde açıklanmaktadır. İkincisi, SMC belirteç ifadesinin doğrulanmasının yanı sıra kasılma ölçümleri ve analizi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu yazıda aynı metodoloji kullanılarak kontraksiyonu ölçülebilen hastaya özgü dermal fibroblastların izolasyon yöntemi açıklanmaktadır. Bu hücreler, aort anevrizması veya diğer kardiyovasküler patolojilere odaklanan hastaya özgü çalışmalar^{için kullanılabilir 15} veya anevrizma cerrahisinden önce kasılma ölçümüne izin veren bir transdiferansiyasyon protokolü kullanan prognostik çalışmalar¹⁶.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Aort biyopsileri Amsterdam Üniversitesi Tıp Merkezleri, VU Üniversitesi Tıp Merkezi, Amsterdam, Zaans Medisch Centrum, Zaandam ve Dijklander Hastanesi, Hoorn, Hollanda'da açık anevrizma onarımı sırasında elde edildi. Kontrol aort dokusu, böbrek nakli için toplanan renal artere bağlı aort parçasından elde edildi. Sadece 18 yaşın üzerindeki hastalar dahil edildi ve tüm hastalar çalışmaya katılmak için bilgilendirilmiş onamlarını verdiler. Tüm materyaller, WMA Helsinki Deklarasyonu'nun düzenlemelerine ve VU Tıp Merkezi Tıbbi Etik Komitesi'nin kurumsal kılavuzlarına uygun olarak toplanmıştır. Tüm deneyler ve deneysel protokoller kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiş ve VU Tıp Merkezi Tıbbi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. Kullanılan kontrol ve hasta hücre hatları hakkında tam bilgi için, ^8'e bakınız.

1. Birincil insan SMC'lerinin aort biyopsilerinden izole edilmesi

NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altında aşağıdaki adımları uygulayın. Eldiven giyin ve insan kanı ve insan dokusu örneklerini kullanırken standart aseptik teknikler kullanın. SMC'ler, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin ve SMC ortamı olarak adlandırılan Düz Kas Büyüme Takviyesi ile desteklenmiş 231 İnsan Vasküler Düz Kas Hücresi Bazal Ortamında kültürlenir.

1. İki çift cerrahi forseps ve bir neşteri% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra kurutarak sterilize edin.
2. Doku diseksiyonunun yapılacağı bir Petri kabında 2 mL SMC ortamından pipet.
3. İki T25 şişeye 2,5 mL SMC ortamı pipetin. Şişeleri etrafta döndürün, böylece küçük hacimli ortam tüm yüzeyi kaplar.
4. Hasat edilen insan aort duvarı biyopsisini ameliyathaneden laboratuvara buz üzerinde, soğuk, steril doku transfer çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya% 0.9 NaCl ile steril bir plastik tüp içinde taşıyın.
5. Tüpü, doku kültürü başlığının içindeki doku ile açın. Sterilize forsepsleri kullanarak biyopsiyi tüpten çıkarın ve Petri kabına yerleştirin (Şekil 1A).
6. Üç aort tabakasını, tunika intima'yı (iç), medyayı (orta) ve adventitia'yı (dış tabaka) tanımlamak için biyopsiyi görsel olarak inceleyin. Katmanları ayırt etmek için intima tarafında aterosklerotik plakların ve adventitial tarafta sümüksü bağ dokusunun varlığını araştırın (Şekil 1B).
7. SMC'leri medyadan yalıtmak için diğer iki katmanı kaldırın. Dokuyu önce intima plağı tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 1B). Katı plağı, forseps ile dokudan uzaklaştırarak çıkarın ve dokuyu diğer forseps çiftiyle aşağı doğru itin. Pembe, düzgün medial tabaka görünene kadar sonraki plak katmanlarını çıkarın.
8. Dokuyu çevirin (Şekil 1C). Adım 1.7'de olduğu gibi, adventitial tabakayı çekerek aynı prosedürü tekrarlayın (Şekil 1D). Görünür tüm parçaları gerektiği kadar denemede çıkardığınızdan emin olun, çünkü bu katman ortamdan kolayca ayrılmaz.
   NOT: Mümkün olduğunca temiz bir SMC popülasyonu elde etmek için intimal ve adventitial katmanların uygun şekilde çıkarılması esastır.
9. Medial tabaka izole edildikten sonra, dokuyu yaklaşık 1 mm x 1 mm x 1 mm'lik küpler halinde kesin. Medyayı forseps ile bastırın ve neşteri kullanarak dokuyu bir yönde kesin. İleri geri kesmeyin; hasarı en aza indirmek için temiz, tek yönlü kesimler yapın. Biyopsinin büyüklüğü göz önüne alındığında mümkün olduğunca çok küp yapmaya çalışın (Şekil 1E).
10. Forsepsleri kullanarak doku parçalarını T25 şişesinin üst çeyreğine yerleştirin. Malzeme miktarı izin veriyorsa şişe başına 10-20 küp yerleştirin (Şekil 1F).
    NOT: Dokunun forseps kaburgalarına yapışmasını en aza indirmek ve dokuyu şişeye kolayca ayırmak için pürüzsüz forseps kullanın.
11. T25 şişelerindeki doku küplerini bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO_2'de yaklaşık 10 gün boyunca inkübe edin.
    NOT: İlk hücre büyümesi bu süre zarfında bekleniyor. Başlangıçta göç eden hücreler normal SMC'lerden daha küçük görünebilir.
12. Hücre büyümesi gözlendikten sonra, şişeye 2,5 mL orta madde ekleyin ve ayrılmalarını önlemek için doku parçalarına pipet yapmadığınızdan emin olun.
13. Yaklaşık 5 gün sonra, doku parçalarının etrafında hücre kümeleri gözlendiğinde, kültür ortamını değiştirin. Doku parçaları ayrılırsa, tekrar takılmayacakları için bunları çıkarın.
14. Hücreler% 80-90 birleştiğinde, onları bir T75 şişesine aktarın ve bu formatta kültürlemeye devam edin.
    NOT: 1:2 veya 1:3 bölme oranı önerilir. Hücrelerin yedeğini erken bir geçişte dondurun. Hücreler genellikle 10. geçide kadar özelliklerini korurlar; Daha sonraki pasajlar deneyler için kullanılmamalıdır.

2. Primer dermal fibroblastların cilt biyopsilerinden izole edilmesi

NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altında aşağıdaki adımları uygulayın. Eldiven giyin ve insan kanı ve insan dokusu örneklerini kullanırken standart aseptik teknikler kullanın. Fibroblastlar, %10 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisilin ve fibroblast besiyanı olarak adlandırılan 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş Bazal Medium'da kültürlenir.

1. İki çift cerrahi forseps ve bir neşteri% 70 etanol içine batırarak ve daha sonra kurutarak sterilize edin.
2. Doku diseksiyonunun yapılacağı bir Petri kabında 2 mL fibroblast ortamı pipeti.
3. İki T25 şişeye 2,5 mL fibroblast ortamı pipetin. Şişeleri etrafta döndürün, böylece küçük hacimli ortam tüm yüzeyi kaplar.
4. Hasat edilen cilt biyopsisini ameliyathaneden laboratuvara soğuk, steril doku transfer solüsyonunda buz üzerinde ( Malzeme Tablosuna bakınız) veya% 0.9 NaCl'yi steril bir plastik tüp içinde taşıyın.
5. Tüpü, doku kültürü başlığının içindeki doku ile açın. Sterilize forsepsleri kullanarak biyopsiyi tüpten çıkarın ve Petri kabına yerleştirin (Şekil 2A).
6. Üç cilt tabakasını, epidermis, dermis ve deri altı yağını tanımlamak için biyopsiyi görsel olarak inceleyin. Epidermisi tanımlamak için bazen görünür saçlarla tanınabilir bir cilt yüzeyi arayın. Karşı tarafta, genellikle sarı ve sümüksü olan deri altı yağını arayın. Epidermis ve deri altı yağ arasındaki tabakayı, canlı fibroblastların kaynağı olan dermis olarak tanımlayın (Şekil 2B).
7. Fibroblastları dermisten izole etmek için, diğer iki katmanı çıkarın ve dokuyu üç katmanın da görülebilmesi için yan tarafına yerleştirin.
   NOT: Aort dokusunun aksine, cilt katmanları birbirinden ayrılamaz; bu nedenle, kesilmeleri gerekir. Doku ayrıca daha kauçuktur, bu da kesilmesini zorlaştırır. Keskin bir neşter kullanın.
8. Dokuyu forseps ile aşağı doğru tutun. Epidermis ve dermis arasındaki sınıra paralel olarak kesin. Tüm epidermisi kesin. Temiz bir çizgide kesmeye çalışın ve doku hasarını önlemek için ileri geri hareket etmeyin.
9. Dokuyu çevirin. Adım 2.8'deki yordamın aynısını yineleyin; bu kez, deri altı yağ ile sınıra paralel olarak dermis içinde kesin.
10. Dermis izole edildikten sonra, dokuyu yaklaşık 1 x 1 x 1^mm3 küpler halinde kesin. Dokuyu forseps ile bastırın ve neşteri kullanarak dokuyu bir yönde kesin. İleri geri kesmeyin; hasarı en aza indirmek için temiz, tek yönlü kesimler yapın. Biyopsinin büyüklüğü göz önüne alındığında mümkün olduğunca çok küp yapmaya çalışın (Şekil 2C).
11. Forsepsleri kullanarak doku parçalarını T25 şişesinin üst çeyreğine yerleştirin. Malzeme miktarı izin veriyorsa şişe başına 10-20 küp yerleştirin (Şekil 2D).
    NOT: Dokunun forseps kaburgalarına yapışmasını en aza indirmek ve dokuyu şişeye kolayca ayırmak için pürüzsüz forseps kullanın.
12. T25 şişelerindeki doku küplerini bir inkübatörde 37 ° C'de% 5 CO_2'de yaklaşık 10 gün boyunca inkübe edin.
    NOT: İlk hücre büyümesi o zaman civarında bekleniyor. Başlangıçta göç eden hücreler normal fibroblastlardan daha küçük görünebilir.
13. Hücre büyümesi gözlendikten sonra, şişeye 2,5 mL orta madde ekleyin ve ayrılmalarını önlemek için doku parçalarına pipet yapmadığınızdan emin olun.
14. Yaklaşık 5 gün sonra, doku parçalarının etrafında hücre kümeleri gözlenebildiğinde, kültür ortamını değiştirin. Doku parçaları ayrılırsa, tekrar takılmayacakları için bunları çıkarın.
15. Hücreler% 80-90 birleştiğinde, onları bir T75 şişesine aktarın ve bu formatta kültürlemeye devam edin.
    NOT: 1:2 veya 1:3 bölme oranı önerilir. Hücrelerin yedeğini erken bir geçişte dondurun. Hücreler genellikle 10. geçide kadar özelliklerini korurlar; Daha sonraki pasajlar deneyler için kullanılmamalıdır.

3. Kasılmanın ölçülmesi (örnek SMC'ler)

1. Bir 96w10e ECIS dizisi hazırlayın (büyütülmüş elektrotlar ve elektrotlar üzerine tohumlanmış hücreler içeren dizinin temsili bir görüntüsü için Şekil 3A'ya bakın).
   NOT: Steril doku kültürü laminer akış başlığı altında aşağıdaki adımları uygulayın.
   1. Steril bir 96w10e dizisini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kuyucuk başına 200 μL 10 mM L-sistein ile kaplayın.
   2. Tabağı iki kez steril suyla yıkayın. Plakayı, kapağı hafifçe açıkken doku kültürü davlumbazında gece boyunca kurumaya bırakın.
      NOT: Plakanın L-sistein ile kaplanması sadece plakayı ilk kez kullanırken gereklidir.
   3. Ertesi gün, 30 dakika boyunca plaka ve kapağı UV sterilize edin. Kapağı yukarı doğru çevirin, böylece iç kısım sterilize edilir. Plaka sterilize edildikten sonra, plakayı akış davlumbazının dışında açmayın.
2. ECIS dizisindeki tohumlama hücreleri
   1. Su banyosunda 30 dakika boyunca% 1 steril jelatin çözeltisini önceden ısıtın.
      NOT: Çözelti buzdolabında saklanır ve katılaşarak pipet takılmasını zorlaştırabilir.
   2. Daha sonra, kuyucukları kuyu başına% 1 jelatin çözeltisinden 100 μL ile kaplayın ve plakayı en az 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   3. Jelatini kuyucuklardan aspire edin.
   4. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve SMC'leri 200 μL SMC ortamında 30.000 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğunda üçlü olarak tohumlayın.
   5. SMC'lerle birlikte plakayı, hücre kültürü inkübatöründeki ECIS 96 kuyucuğuna yerleştirin. Programı açmak için ECIS Applied Biophysics yazılımına çift tıklayın ve Setup (Kurulum ) düğmesine basın.
   6. Tüm elektrotların Kuyu Yapılandırması etiketli sol alt paneldeki tutucuyla (yeşil; bağlantı yoksa kırmızı) temas edip etmediğini kontrol edin. Elektrotlar düzgün bir şekilde bağlanmazsa, ölçüme başlamadan önce tutucudaki plakayı ayarlayın.
   7. Dizi türü'nü tıklatarak aynı panelde plaka türünü (96 delikli dizi) seçin.
   8. Sağ üst paneldeki Veri Toplama Kurulumu'nda, tek frekansa tıklayın ve empedans değerini 4000 Hz'e ve aralığı 8 s'ye değiştirin.
   9. Ölçümleri başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın. ECIS dosyasının kaydedilebileceği yeni bir panelin açılmasını bekleyin.
   10. Hücrelerin 48 saat boyunca bir monolayer tutturmasına ve oluşturmasına izin verin.
       NOT: Hücrelerin elektrotlar üzerine bağlanması ve yayılması bir temel direnç değeri oluşturur (Şekil 3B).
3. Kasılmayı indüklemek için hücrelerin uyarılması
   1. Hücreleri 10 μg / mL kalsiyum iyonofor, iyonomisin ile uyararak SMC kasılmasını indükleyin.
      NOT: İyonomisin, hücre dışı Ca^{2 +} 'nın akışını indükleyecek ve kontraktil kaskatı aktive edecektir; uyarılmamış ve uyarılmış sözleşmeli hücrelerin temsili görüntüleri için Şekil 4A'ya bakınız.
   2. 10 mg / mL'lik bir stok çözeltisi yapmak için 1 mg iyonomisin tozunu 100 μL dimetilsülfoksit içinde seyreltin ve -20 ° C'de 10 μL alikot saklayın. Kullanmadan önce, hücrelere eklenecek çalışma çözeltisini hazırlamak için iyonomisin çözeltisi 1:10'u SMC ortamında seyreltin.
   3. Dizi hala hücre kültürü inkübatörünün içindeki dizi tutucusundayken hücre stimülasyonunu gerçekleştirin ve elektrotlar sisteme bağlanır.
      1. Hücreleri uyarmak için kapağı çıkarın ve inkübatörün içindeki steril bir yüzeye yerleştirin. 2 μL ve 150 μL'ye ayarlanmış iki pipet hazırlayın.
      2. Stimülasyona başlamadan önce, yazılımda İşaretle tuşuna basın ve bir yorum yerleştirin.
         NOT: Bu, verileri analiz ederken stimülasyonun tam zamanlamasını bulmayı kolaylaştıracaktır.
      3. Pipet, iyonomisin çalışma çözeltisinin 2 μL'sini mümkün olduğunca çabuk her bir kuyucuğun içine yerleştirin. Tüm hücreler uyarıldıktan sonra, ikinci pipeti kullanarak ortamı kuyucuklarda karıştırın.
         NOT: Hızlı etkiler nedeniyle, uçları farklı hücre hatları ve koşulları arasında değiştirmek gerekli değildir. Uyarırken ve karıştırırken hızlı çalışın, çünkü iyonomisin akut bir etkiye sahiptir. Tam bir plakayı uyarırken, bir kerede en fazla 3 sütunu uyarın. Her stimülasyondan sonra, hücrelerin inkübatör kapısının açılmasından kaynaklanan sıcaklıktan ve CO₂ değişiminden kurtulmasına izin vermek için bir sonraki stimülasyona kadar en az 30 dakika bekleyin.
      4. Stimülasyon yapıldıktan hemen sonra, stimülasyonun yapıldığına dair bir yorum eklemek için tekrar İşaretle'ye basın.
   4. Stimülasyon deneyini bitirmek
      1. İyonomisin stimülasyonundan sonra empedans değerlerini yaklaşık 5 dakika boyunca kaydedin. Son'a basarak kaydı bitirin.
      2. ECIS dizilerini üç defaya kadar tekrar kullanın: kuyucukları iki kez steril suyla yıkayın ve plakayı tripsin veya benzeri bir reaktif ile 2-3 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 3.1.2 ve 3.1.3 numaralı adımları yineleyin.
4. Verileri dışa aktarma
   1. Verileri vermek için, Dosya |'ni tıklatın Veri | dışa aktarma Excel'e (Seçili). Dosyayı kaydetmek için bir klasör seçin.
   2. Program sayfaları birleştirmek veya ayırmak istediğinde Ayır'ı tıklatın.
5. Kasılma çıktısının analizi
   1. Kasılma yanıtını hesaplamak için, aşağıdaki denklemi (1) kullanın, burada C kasılmayı gösterir (taban çizgisine kıyasla değişimin % 'si ile ifade edilir), ön uyarım (PrS), iyonomisin stimülasyonundan hemen önce direnç değerini (Ω olarak ifade edilir) ve post-stimülasyon (PoS), stimülasyonu bitirdikten 2 dakika sonra direnci (Ω cinsinden ifade edilir) gösterir.
      (1)
      NOT: Denklem (1)'de gösterildiği gibi, herhangi bir bağlı hücre olmadan kültür ortamıyla doldurulmuş bir kuyunun empedans değeri (290 Ω değeri), son hesaplamadaki tüm sonuçlardan çıkarılır. Her deneyde kontraktil tepkilerin üçlü olarak ölçülmesi ve deneyler arası ve deneyler arası varyasyonları hesaba katmak için aynı hücre hattıyla üç bağımsız deney yapılması önerilir.
   2. Üç bağımsız deney gerçekleştirildikten sonra, standart sapma (SD) dahil olmak üzere üç ölçümün ortalamasını hesaplayarak verileri bir araya getirin.
6. Farklı grupları karşılaştırma
   1. Normal kasılma aralığını tanımlamak ve sonraki spesifik araştırma sorularını araştırmak için, "normal kasılma" yı tanımlamak ve bunu hastaların veya tedavi gruplarının kasılma yanıtıyla karşılaştırmak için kontrol grubunu kullanın.
   2. Adım 3.5.2'de açıklandığı gibi, tüm kontrol grubunun, yani tüm hücre satırlarının uç değerlerinin ortalamasını ve SD'sini hesaplayın.
   3. Bu aralığın dışında kalan diğer gruptaki hücreleri tanımlamak için ortalama ± 2SD aralığını kullanın ve bu da değişmiş bir kontraktil yanıta sahip olduklarını gösterir.
      NOT: Değiştirilmiş kontraktil yanıtın arkasındaki mekanizma belirli araştırma sorularına tabidir ve hücre ve duruma bağlıdır ve bu protokolde tartışılmayacaktır.

4. SMC'ye özgü belirteçlerin varlığının tespiti

1. RNA izolasyonu
   1. Kasılma ölçümleri için kullanılan hastaya özgü hücre hatlarını, hücre hattı başına bir kuyucuk olan 6 delikli plakalarda tohumlayın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücreleri SMC ortamında 200.000 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğunda tohumlayın ve gece boyunca bağlanmalarına izin verin.
   2. Hücreleri steril PBS ile bir kez yıkayın.
   3. Hücreleri lize edin ve hücreleri üreticinin talimatlarına göre izole edin.
2. cDNA sentezi
   1. Bir ters transkripsiyon reaksiyon karışımının 20 μL'sinde cDNA sentezi gerçekleştirin. Toplam izole RNA konsantrasyonlarını, üretici tarafından sağlanan talimatlara göre seyreltin.
3. qPCR
   1. İzole hücrelerin gerçekten SMC olduğunu doğrulamak ve SMC belirteçlerini tespit etmek için SMC belirteci genlerinin , örneğin ACTA2, CNN1, SMTN ve TAGLN'nin gen ekspresyonunu ölçün. Sonuçların kontraktil çıktı ile korelasyonunu kontrol edin.
   2. Verileri normalleştirmek için en az iki temizlik geni kullanın, örneğin, YWHAZ ve TBP.
      NOT: qPCR çalıştırma ve analizi, laboratuvarda mevcut ve optimize edilmiş olana bağlı olarak farklı PCR makineleri ve uyumlu yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Astar dizileri için Ek Tablo S1'e bakınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu yöntemin tekrarlanabilirliğini test etmek için, yöntem önce yalnızca kontrol SMC'leri kullanılarak doğrulanmıştır. Deneyler arası ölçüm tekrarlanabilirliğini belirlemek için, dahil edilen tüm kontrol ve hasta hücre hatlarının iki bağımsız ölçümü bir Bland-Altman grafiği olarak çizilmiştir (Şekil 3B). Grafik, bu yöntemin bir aykırı değer hücre çizgisi dışında, güven aralığının dışında değişkenlik göstermediğini göstermiştir. Ayrıca, b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yazıda, SMC kasılmasını in vitro olarak ölçmek için, empedans ve yüzey işgalindeki değişikliklere dayanarak bir yöntem sunulmaktadır. İlk olarak, hastaya özgü primer insan SMC'lerinin ve cilt fibroblastlarının izolasyonu, kültürlenmesi ve genişlemesi, ardından bunların kasılma ölçümleri için nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

Çalışmanın bir sınırlaması, hücrelerin bir eksplant protokolü yoluyla elde edilmesiyle ilgilidir. Biyopsiden ç...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well Array	Applied Biophysics	96W10idf PET	Array used to measure contraction in the ECIS setup
Custodiol	Dr. Franz Höhler Chemie GmbH	RVG 12801	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	Solution used to dilute ionomycin
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140079	Addition to cell culture medium
Ham's F-10 Nutrient Mix	Gibco	11550043	Medium used to culture skin fibroblasts
Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'')	Gibco	M231500	Medium used to culture smooth muscle cells
Invitrogen countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus	Sigma-Aldrich	I0634-1MG	Compound used for contraction stimulation
NaCl 0.9%	Fresenius Kabi	B230561	Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Antibiotics used for cell culture medium
Phospathe buffered saline	Gibco	10010023	Used to wash cells
Quick-RNA Miniprep Kit	Zymo Research	R1055	Kit used for RNA isolation
Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS)	Gibco	S00725	Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Thermo Fisher Scientific	11754250	Kit used for cDNA synthesis
SYBR Green PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4309155	Reagent for qPCR
Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054	Used to trypsinize cells
ZTheta	Applied Biophysics	ZTheta	ECIS instrument used for contraction measurements