Ultrason Eşliğinde Enjeksiyon ile Pankreas Kanseri Hücrelerinin Ortotopik Ksenograftının Oluşturulması

Özet

İnsan pankreas kanseri hücrelerinin ultrason eşliğinde enjeksiyonu ve ardından ultrason görüntüleme ile tümör büyümesinin in vivo olarak izlenmesi ile minimal invaziv bir ortopik pankreas kanseri modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Pankreas kanseri (PCa) dünya çapında en ölümcül kanser türlerinden birini temsil eder. PCa malignitesinin nedenleri esas olarak içsel malign davranışına ve terapötik tedavilere karşı yüksek direncine dayanır. Gerçekten de, birçok çabaya rağmen, hem standart kemoterapi hem de yenilikçi hedef tedaviler, klinik öncesi değerlendirmeden klinik ortama geçtiğinde önemli ölçüde başarısız olmuştur. Bu senaryoda, yeni geliştirilen ilaçları test etmek için PCa'nın in vivo özelliklerini daha iyi taklit eden preklinik fare modellerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, insan pankreas tümör hücrelerinin ultrason rehberliğinde enjeksiyonu ile elde edilen ortotopik bir ksenogreft ile temsil edilen bir fare PCa modeli oluşturma yöntemini açıklamaktadır. Böyle güvenilir ve minimal invaziv bir protokol kullanarak, ultrason (US) görüntüleme ile izlenebilen in vivo engraftment ve tümör kitlelerinin gelişiminin kanıtlarını da sunuyoruz. Burada tarif edilen PCa modelinin dikkat çekici bir yönü, tümör kitlelerinin zaman içinde yavaş gelişmesidir, bu da farmakolojik tedaviler için başlangıç noktasının kesin olarak belirlenmesini ve terapötik müdahalelerin etkilerinin daha iyi izlenmesini sağlar. Dahası, burada açıklanan teknik, 3R ilkelerinin uygulanmasına bir örnektir, çünkü acı ve ıstırabı en aza indirir ve araştırmadaki hayvanların refahını doğrudan artırır.

Giriş

PCa ve en yaygın formu olan Pankreatik Duktal Adeno Karsinom (PDAC^{), evre 1,2'den} bağımsız olarak, 1 yıllık sağkalım oranı% ^20'nin altında ve 5 yıllık sağkalım oranı% 8 olan kansere bağlı ölümlerin en yaygın nedenlerinden biridir. Hastalık neredeyse her zaman ölümcüldür ve insidansı³ azalan diğer kanser türlerinin aksine, önümüzdeki yıllarda insidansının sürekli olarak artacağı tahmin edilmektedir. Geç kanser tespiti, hızlı progresyon eğilimi ve spesifik tedavilerin eksikliği gibi faktörler PCa^4'ün kötü prognozuna yol açmaktadır. Daha doğru preklinik fare modellerinin geliştirilmesi sayesinde kanser araştırmalarında büyük ilerlemeler kaydedilmiştir. Modeller, kanserin altında yatan moleküler mekanizmanın anlaşılması ve yeni tedavilerin geliştirilmesi için uygun bilgiler sağlamıştır⁵. Bu ilerlemeler, son zamanlardaki büyük çabalara rağmen, mevcut kemoterapötik tedavilere dirençli kalan PCa için zayıf bir şekilde geçerlidir¹. Bu nedenlerden dolayı, hastaların beklentilerini iyileştirmek için yeni yaklaşımların geliştirilmesi zorunludur.

Yıllar geçtikçe, günümüzde en yaygın kullanılan modeller olan ksenogreftler de dahil olmak üzere birçok PCa fare modeli geliştirilmiştir⁵. Ksenograft modelleri, implante edilen tümör hücrelerinin konumuna bağlı olarak subkutan heterotopik ve ortotopik olarak sınıflandırılır. Subkutan heterotopik ksenogreftlerin gerçekleştirilmesi daha kolay ve ucuzdur, ancak PCa'nın bazı karakteristik özelliklerini (yani, fibrotik doku, hipoksi, asitlik ve anjiyogenez birikimi ile karakterize edilen kendine özgü tümör mikroçevresi⁾ kaçırırlar6,7. Bu, deri altı ksenogreftlerin neden klinik ayar^8'e çevrildiğinde başarısızlıklara yol açan terapötik tedaviler için sağlam veriler sağlayamadığını açıklar. Öte yandan, ortotopik ksenogreftler tümör mikroçevresine daha yakından benzemekte ve hastalığın doğal gelişiminin daha iyi taklit edilmesine yol açmaktadır. Ek olarak, ortotopik ksenogreftler, metastatik süreci ve PCa'nın invaziv özelliklerini incelemek için daha uygundur, bu da deri altı modellerde neredeyse hiç görülmez⁹. Genel olarak, ortotopik ksenograft fare modelleri günümüzde preklinik ilaç testi yapmak için tercih edilmektedir ^9,10. Ortotopik ksenogreftler genellikle hücreleri veya çok küçük tümör dokusu parçalarını pankreasa implante etmek için cerrahi prosedürlere dayanır. Gerçekten de, PCa'nın cerrahi modellerine dayanan birkaç makale son birkaç on yılda yayınlanmıştır¹¹. Bununla birlikte, ortotopik tümör modelinin oluşturulması için cerrahi prosedürün kalitesi ve sonucu, operatörün teknik becerisine büyük ölçüde bağlıdır. Translasyonel klinik yaklaşım için başarılı bir ortotopik PCa ksenogreft için bir diğer önemli nokta, öngörülebilir büyüme kinetik ile lokalize hastalık oluşturma olasılığıdır.

Bu sorunları ele almak için, burada, immün yetmezlikli farelerde pankreasın kuyruğuna insan PCa hücrelerinin ultrason (US) rehberliğinde enjeksiyonundan yararlanan ortopik bir PCa ksenogreft üretmek için yenilikçi bir prosedürü açıklıyoruz. Bu yordam güvenilir bir PCa fare modeli oluşturur. Tümör büyümesi in vivo olarak US görüntülemesi ile takip edilir.

Protokol

Bu protokol, İtalya Sağlık Bakanlığı'ndan 843/2020-PR yetki numarası ile onay almıştır. Aseptik koşulları sağlamak için, hayvanlar Floransa Üniversitesi'nin araştırma hayvanı vivaryumunun (Ce.S.A.L.) bariyer odasında tutuldu. Tüm prosedürler, farelerin Floransa Üniversitesi'nin (İtalya) LIGeMA tesisinde bulunduğu aynı alanda gerçekleştirildi.

1. Hücre hazırlığı

1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren 100 mm'lik bir Petri kabındaki PCa hücre hattından Kültür PCa hücreleri% 2 L-glutamin ve% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile desteklenir.
2. Normoxi'deki hücreleri 37 ° C'de% 5 CO_{2 ile inkübe edin}.
3. Hücreleri tripsin ile ayırın. Aşılamadan 1 saat önce, 20 μL PBS'de 1 x 10⁶ hücreyi sayın ve yeniden askıya alın.

2. Ultrason rehberliğinde enjeksiyon için fare hazırlığı (US-GI)

NOT: Aşağıdaki adımlar steril koşullar altında gerçekleştirilmiştir. Anestezinin başlangıcından farenin hayvan platformundan çıkarılmasına kadar ABD rehberliğinde enjeksiyon prosedürünün tamamı, farenin tamamen iyileşmesi için yaklaşık 10-12 dakika artı 5 dakika sürer.

1. Müdahaleden hemen önce, karprofen (NSAID) deri altından (SC) 5 mg / kg'lık son dozda veya tramadol 27 G iğneli bir tüberkülin şırıngası kullanarak 5 mg / kg'lık son dozda uygulayın.
   NOT: Mevcut protokol için 20 adet Amimik Çıplak-Foxn^1nu dişi fare kullanılmıştır. Fareler 8 haftalıktı ve 20-22 g ağırlığındaydı.
2. Görüntüleyiciyi açın ve dönüştürücü panelinden uygulama menüsünde Fare (Küçük) Karın öğesini seçin. B-Modu (Parlaklık Modu) görüntüleme penceresinin göründüğünden ve sistemin B-Modu verilerini almaya hazır olduğundan emin olun.
   NOT: B Modu, sistemin varsayılan görüntüleme modudur. Sistem, yankı sinyali genliğine göre bir parlaklık düzeyi atayarak yankıları iki boyutlu (2B) bir görünümde görüntüler. B-Modu, anatomik yapıları bulmak için en etkili moddur.
   1. Çalışma Tarayıcısına gidin.
   2. Yeni Etüt'ü seçin ve çalışma adını ve bilgilerini, yani çalışmanın tarihini vb. yazın.
   3. Seri Adı'ndaki gerekli tüm bilgileri, yani hayvan suşlarını, kimliğini, doğum tarihini vb. Doldurun.
   4. Bitti'ye dokunun; program B modu görüntüleme için hazırdır.
3. Anestezi indüksiyon odasındaki fareyi, 2 L / dak O2 gaz akışı ile% 4 izofluran kullanarak anestezi_yapın.
   NOT: Uygun anestezi için yaklaşık 4 dakika yeterlidir (dakikada yaklaşık 50-60 nefes almak).
4. Fare anestezi uygulandıktan sonra, izofluranı fare taşıma masasına doğru yönlendirmek için anestezik makinenin bağlantısını değiştirin.
5. Anestezi uygulanan fareyi sağ kanadındaki tutma masasına (37 °C'de ısıtılır) yerleştirin ve farenin 0,8 L/_{dk O2} gaz akışına sahip %2 izofluran kullanılarak anestezi altına alındığından emin olun (Şekil 1A).
6. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için farenin gözlerine bir damla yapay gözyaşı uygulayın.
7. Sağ eli, sağ ayağı ve kuyruğu yapışkan gazlı bezle hayvan platformundaki elektrot pedlerine sıkıca bantlayın.
   NOT: Farenin solunum hızı ve elektrokardiyogramı (EKG) elektrot pedleri aracılığıyla kaydedilir.

3. US-GI yöntemi ile pankreasta PANC1 hücrelerinin enjeksiyonu

1. Fare derisini% 70 etanol ile sterilize edin ve yapışkan gazlı bez kullanarak sol kanadın cildini gerilmiş halde tutun.
   NOT: Cildin gerilmiş halde tutulması, iğnenin yerleştirilmesine karşı direnci azaltmak ve iğne deformasyonlarını önlemek için önemlidir.
2. 20 mL'lik bir şırınga kullanarak (iğne olmadan) farenin karnına ve sol kanadına ultrason jeli uygulayın.
3. ABD dönüştürücüsünün yükseklik kontrol düğmesini kullanarak, farenin sol kanadına dokunmak için dönüştürücüyü indirin ve hayvanın vücuduna enine olarak yerleştirin.
4. B-Mode görüntülemeyi kullanarak transdüser ekranındaki pankreası görselleştirmek için dönüştürücüyü hareket ettirin (Şekil 1B).
5. 20 μL PBS'de asılı 1 x 10⁶ PANC1 hücresi içeren 50 μL Hamilton şırıngasını 30 mm 28 G iğne ile hazırlayın ve şırıngayı uygun tutucuya yerleştirin (Şekil 1C).
   NOT: Kullanmadan önce, şırınga iğnesini 5-10 dakikalık bir süre boyunca% 70 etanol ile sterilize edin.
6. Tutucu mikromanipülatörü kullanarak, şırıngayı fare derisine, iğne eğimi yukarı bakacak şekilde ve ultrason dönüştürücü ile aynı düzlemde, dönüştürücü ile 45 ° 'lik bir açı oluşturarak indirin (Şekil 1D).
   NOT: Bu adımdan itibaren, ekrandaki ABD görüntüsünü izleyerek devam edin.
7. Mikromanipülatörü kullanarak, cildi delin ve şırınga iğnesini pankreasın içine yerleştirin ve yörüngesini takip etmek için ekrandaki ABD görüntüsünü gözlemleyin (Şekil 1E).
   NOT: Enjeksiyondan önce, pankreasın kuyruğunu dalağın arkasında ve sol böbreğe yakın bir yerde bulunan bir referans olarak alın.
8. İğne pankreas içine yerleştirildikten sonra, şırınga pistonuna sabit basınç uygulayarak hücreleri içeren 20 μL'lik bir bolusu doğrudan pankreasın içine enjekte edin (Şekil 1F).
   NOT: Doğru enjeksiyon prosedürü, pankreasta küçük bir kabarcığın varlığı ve iğne ucundan zar zor görülebilen hipoekojenik sıvının akışı ile kontrol edilir.
9. Tüm bolus enjekte edildikten sonra iğneyi 5-10 s yerinde bırakın ve ardından yavaşça geri çekin.
10. ABD dönüştürücüsünü çıkarın, jeli yandan temizleyin ve fareyi tek başına yeni bir kafese yerleştirin. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözlemleyin.

4.3D Farelerde pankreas tümörlerini izlemek için ABD görüntüleme

NOT: Tümör gelişiminin değerlendirilmesi, hücre enjeksiyonundan 8 gün sonra, ABD rehberliğinde enjeksiyon için kullanılan aynı alet kullanılarak ( Malzeme Tablosunda listelenmiştir) gerçekleştirilmiştir. Bu nedenle, sistem ateşlemesi (adım 2.2.), anestezi (adım 2.3. - 2.6.) ve hayvan platformuna fare yerleştirme (adım 2.7.) gibi bazı prosedürler, protokolde yukarıda açıklananlarla tam olarak eşleşir.

1. ABD görüntülemeye başlamadan önce, iş istasyonunu Şekil 2A'da gösterildiği gibi ayarlayın.
2. Transdüseri 3D motor sistemine sabitleyin (Şekil 2A).
3. Görüntüleyiciyi açın ve Etüt Tarayıcısında Yeni Etüt'ü seçin.
4. Fareyi anestezi indüksiyon odasına yerleştirin (% 4 izofluran).
5. Anestezi uygulanan fareyi sağ kanadında, burnu anestezik tüpün içinde olacak şekilde 37 °C'de ısıtılmış taşıma masasına yerleştirin ve izofluranı %2'ye düşürün (Şekil 2B).
   NOT: Aynı anatomik referansları korumak için farenin ABD rehberliğindeki enjeksiyonla aynı konuma yerleştirilmesi önemlidir.
6. Farenin gözlerine bir damla veteriner merhem uygulayın.
7. Farenin karnına ve sol kanadına bir ultrason jeli tabakası uygulayın.
8. 55 MHz dönüştürücüyü, pankreas yaklaşık olarak ortalanmış olacak şekilde sol yan cilde dokunmak için enine yönde konumlandırın (Şekil 2C).
9. Tüm pankreasın enine yönde görüntülerini elde etmek için 3D motoru kullanın, ideal olarak edinme başına 90-100 kare toplayın (çerçeve sayısı kişisel seçime bağlı olarak değişebilir).
   1. Görüntüleyici dokunmatik yüzeyindeki 3B Motor Konumu'nu seçin.
   2. Her iki ekstremiteden tüm pankreasın görüntülerini elde etmek için imleci hareket ettirerek tarama mesafesini belirtin.
   3. Çerçeveleri Tara'yı seçin ve 3B almaya başlayın.
10. 3D görüntüleme yapıldıktan sonra, dönüştürücüyü çıkarın, jeli ciltten temizleyin ve fareyi iyileşme için tek başına yeni bir kafese yerleştirin. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözlemleyin.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolü takiben, fareler ilk önce bir izofluran odasında anestezi altına alındı ve hayvan platformuna yerleştirildi (Şekil 1A). Pankreas ultrasonografi ile görüntülendi (Şekil 1B). 50 μL'lik bir Hamilton şırıngası, 20 μL PBS'de asılı olan ve iğne tutucuya yerleştirilen 1 x 10⁶ PANC1 hücresi ile yüklendi (Şekil 1C). Şırınga ve US transdüseri arasındaki optimum açı 45?...

Tartışmalar

Klinikte US görüntüleme kullanımı yaygın olmasına rağmen, birçok preklinik fare modelinde tümör gelişimi genellikle biyolüminesan görüntüleme kullanılarak tanımlanmaktadır¹¹. İkincisi, tümör engraftmanını ve genişlemesini değerlendirmenin dolaylı bir yoludur ve ayrıca güvenilir bir tümör büyüme kinetik sağlamaz. Bu çalışmada, hücre enjeksiyonu yapmak ve tümör gelişimini izlemek için US görüntülemeyi uyguladık. Tanımladığımız protokol ve sağladı?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Petri dish	Sarstedt, Germany	P5856
3D-Mode package	Visualsonics Fujifilm, Italy		Includes the 3D Motor; necessary for volumetric imaging
Aquasonic 100, Sonypack 5 lt Ultrasound Transmission Gel	PARKER LABORATORIES, INC.	150	Gel for ultrasound
Athymic Mice (Nude-Foxn1nu)	ENVIGO, Italy	69	20 females, 8 weeks old, Athymic Nude-Foxn1nu, 20-22 g body weight
CO2 Incubator Function Line	Heraeus Instruments, Germany	BB16-ICN2
Display of ECG, Respiration Waveform and body temperature	Visualsonics Fujifilm, Italy	11426
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)	Euroclone Spa, Italy	ECM0101L
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline)	Euroclone Spa, Italy	ECB4004L
Eppendorf (1.5mL)	Sarstedt, Germany	72.690.001
FBS (Fetal Bovine Serum)	Euroclone Spa, Italy	ECS0170L
Hamilton Needle Pointstyle 4, lenght 30 mm, 28 Gauge	Permax S.r.l., Italy	7803-02
Hamilton Syringe 705RM 50 µL	Permax S.r.l., Italy	7637-01
Isoflo (250 mL)	Ecuphar	7081219
L-glutamine 100X	Euroclone Spa, Italy	ECB3000D
Mouse Handling table II	Visualsonics Fujifilm, Italy	50249
MX550D: 55 MHz MX Series Transducer	Visualsonics Fujifilm, Italy	51069	Ultrasound Transducers
Oxygen/isofluorane mixer	Angelo Franceschini S.r.l.	LFY-I-5A
PANC1 cell line	American Type Culture Collection (ATCC), USA	CRL-1469
Rimadyl (carprofen)	Pfizer	11319	20 mL, injection solution
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Euroclone Spa, Italy	ECB3052D
Vet ointment for eyes, Systane nighttime	Alcon	509/28555-1
Vevo Compact Dual Anesthesia System (Tabletop Version)	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-12055	complete with gas chamber
Vevo Imaging Station 2	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-11983	Imaging WorkStation 1 plus Imaging Station Extension with injection mount
Vevo Lab	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20034	Data Analysis Software
Vevo LAZR-X Photoacoustic Imaging System	Visualsonics Fujifilm, Italy	VS-20054	Includes analytic software package for B-mode
Vevo Photoacoustic Enclosure	Visualsonics Fujifilm, Italy	53157