JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını in vivo olarak incelemek için gereken ikincil yaklaşımların ihtiyacının üstesinden gelmek için K18 hACE2 transgenik farelerde lusiferaz ve floresan eksprese eden rekombinant (r) SARS-CoV-2 ve bir in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) kullanarak viral enfeksiyonların dinamiklerini açıklamaktadır.

Özet

Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisine şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2) neden olmuştur. SARS-CoV-2, bugüne kadar dünya çapında 242 milyondan fazla enfeksiyondan ve 4,9 milyondan fazla ölümden sorumlu olmuştur. Diğer virüslere benzer şekilde, SARS-CoV-2'yi incelemek, enfekte olmuş hücrelerde ve / veya hayvan modellerinde virüs varlığını tespit etmek için deneysel yöntemlerin kullanılmasını gerektirir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, biyolüminesan (nanoluferaz, Nluc) veya floresan (Venüs) proteinlerini eksprese eden replikasyon yetkin rekombinant (r) SARS-CoV-2 ürettik. Bu muhabir eksprese eden rSARS-CoV-2, Nluc ve Venüs muhabir genlerinin ekspresyonuna dayanarak in vitro ve in vivo viral enfeksiyonların izlenmesine izin verir. Burada çalışma, daha önce tarif edilen K18 insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2 (hACE2) transgenik fare enfeksiyon modelinde in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) kullanarak SARS-CoV-2 enfeksiyonunu tespit etmek ve izlemek için rSARS-CoV-2 / Nluc ve rSARS-CoV-2 / Venüs'ün kullanımını açıklamaktadır. Bu rSARS-CoV-2/Nluc ve rSARS-CoV-2/Venüs, rSARS-CoV-2/WT benzeri patojeniteyi ve viral replikasyonu in vivo olarak göstermektedir. Önemli olarak, Nluc ve Venüs ekspresyonu, enfekte farelerde viral enfeksiyonları in vivo ve ex vivo olarak doğrudan izlememize izin verir. Bu rSARS-CoV-2/Nluc ve rSARS-CoV-2/Venüs, SARS-CoV-2'nin biyolojisini in vivo olarak incelemek, viral enfeksiyonu ve ilişkili COVID-19 hastalığını anlamak ve SARS-CoV-2 enfeksiyonuyla mücadele etmek için etkili profilaktik ve/veya terapötik tedavileri tanımlamak için mükemmel bir seçeneği temsil etmektedir.

Giriş

Şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), Coronaviridae ailesindeki Betacoronavirus soyuna ait zarflı, pozitif anlamlı, tek sarmallı bir RNA virüsüdür1. Bu viral aile Alfa, Beta, Gama ve Delta-koronavirüs1'e ayrılmıştır. Alfa ve Betakoronavirüsler esas olarak memelileri enfekte ederken, Gama ve Deltakoronavirüs neredeyse sadece kuşları enfekte eder2. Bugüne kadar, yedi koronavirüs (CoV) tür bariyerlerini aştı ve insan koronavirüsleri (HCoV) olarak ortaya çıktı: iki alfa-CoVs (HCoV-229E ve HCoV-NL63) ve beş beta-CoVs (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Orta Doğu solunum sendromu koronavirüs [MERS-CoV] ve SARS-CoV-2) 3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV ve SARS-CoV-2 oldukça patojeniktir ve ciddi alt solunum yolu enfeksiyonuna neden olur7. SARS-CoV-2'nin ortaya çıkmasından önce, CoV'lerin neden olduğu iki salgın salgın vardı: 2002-2003 yılları arasında Çin'in Guangdong Providence kentinde SARS-CoV, vaka ölüm oranı (CFR) yaklaşık% 9.7; ve 2012'den günümüze kadar Orta Doğu'da MERS-CoV, yaklaşık% 34'lük bir CFR ile 7,8. SARS-CoV-2, genel CFR'nin% 3.4 ila% 49 arasında bir CFR'ye sahiptir ve altta yatan koşullar daha yüksek bir CFR 8,9'a katkıda bulunur. SARS-CoV-2, Aralık 2019'da Çin'in Wuhan kentinde keşfinden bu yana, dünya çapında 242 milyondan fazla insan enfeksiyonundan ve4,9 milyondan fazla insan ölümünden 7,10,11,12 sorumludur. Özellikle, 2020'nin sonlarından bu yana, yeni SARS-CoV-2 endişe varyantları (VoC) ve ilgi çekici varyantlar (VoI), bulaşma ve antijenite 9,13 ve COVID-19 pandemisinin genel yönü dahil olmak üzere virüs özelliklerini etkilemiştir. SARS-CoV-2 enfeksiyonlarının tedavisi için şu anda sadece bir Amerika Birleşik Devletleri (ABD) bulunmaktadır. Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) terapötik antiviral (remdesivir) ve bir Acil Kullanım İzni (EUA) ilacı (baricitinib, remdesivir ile kombinasyon halinde uygulanacak)14. Ayrıca 6 onaylı EUA monoklonal antikoru vardır: REGEN-COV (birlikte uygulanan casirivimab ve imdevimab), sotrovimab, tocilizumab ve bamlanivimab ve etesevimab birlikte uygulanır 15,16,17,18,19. Şu anda sadece bir FDA onaylı profilaktik aşı olan Pfizer-BioNTech ve diğer iki profilaktik aşı (Moderna ve Janssen) EUA onaylı 20,21,22,23,24 olmuştur. Bununla birlikte, kontrolsüz enfeksiyon oranı ve VoC ve VoI'nin ortaya çıkmasıyla SARS-CoV-2 hala insan sağlığı için bir tehdit oluşturmaktadır. Bu nedenle, SARS-CoV-2 enfeksiyonunu ve halen devam eden COVID-19 pandemisini kontrol etmek için etkili profilaktik ve terapötikleri tanımlamak için acilen yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır.

SARS-CoV-2'yi incelemek, enfekte hücrelerde ve / veya doğrulanmış hayvan enfeksiyon modellerinde virüsün varlığını tanımlamak için zahmetli teknikler ve ikincil yaklaşımlar gerektirir. Ters genetiğin kullanımı, viral enfeksiyonların biyolojisindeki önemli soruları cevaplamak için rekombinant virüslerin üretilmesine izin vermiştir. Örneğin, ters genetik teknikler viral enfeksiyon, patogenez ve hastalık mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve anlamak için araçlar sağlamıştır. Benzer şekilde, ters genetik yaklaşımlar, viral patogenezdeki katkılarını anlamak için viral proteinlerden yoksun rekombinant virüslerin mühendisliğinin yolunu açmıştır. Ek olarak, viral enfeksiyonların tedavisi için profilaktik ve / veya terapötik yaklaşımların belirlenmesi de dahil olmak üzere, in vitro ve in vivo uygulamalar için muhabir genlerini eksprese eden rekombinant virüsler üretmek için ters genetik teknikleri kullanılmıştır. Floresan ve biyolüminesan proteinler, hassasiyetleri, stabiliteleri ve yeni teknolojilerin geliştirilmesine dayanan kolay tespitleri nedeniyle en sık kullanılan muhabir genleridir25,26. In vitro, floresan proteinlerin enfekte hücrelerde virüslerin lokalizasyonu için daha iyi bir seçenek olarak hizmet ettiği gösterilmiştir, lusiferazlar ise niceleme çalışmaları için daha uygundur27,28,29. İn vivo, lusiferazlar tüm hayvan görüntülemede floresan proteinlere göre tercih edilirken, enfekte hücrelerin tanımlanmasında veya ex vivo görüntülemede floresan proteinler tercih edilir30,31,32. Muhabir tarafından ifade edilen rekombinant virüslerin kullanımı, flavivirüsler, enterovirüsler, alfavirüsler, lentivirüsler, arenavirüsler ve influenza virüsleri 28,33,34,35,36 dahil olmak üzere birçok ailedeki virüslerin incelenmesi için güçlü bir araç olarak hizmet etmiştir.

SARS-CoV-2'yi incelemek ve gerçek zamanlı SARS-CoV-2 enfeksiyonunu in vivo olarak karakterize etmek için ikincil yaklaşımlara duyulan ihtiyacın üstesinden gelmek için, E. coli'de tek bir kopya olarak tutulan daha önce tanımlanmış bakteriyel yapay kromozomlarımızı (BAC) tabanlı ters genetiğimizi kullanarak biyolüminesan (nanolusiferaz, Nluc) veya floresan (Venüs) proteinlerini eksprese eden replikasyon yetkin rekombinant (r) SARS-CoV-2 ürettik. bakterilerde yayılması sırasında virüs dizilerinin toksisitesini en aza indirmek için37,38. Özellikle, rSARS-CoV-2 / Nluc ve rSARS-CoV-2 / Venüs, rSARS-CoV-2 / WT benzeri patojeniteyi in vivo olarak göstermiştir. rSARS-CoV-2 / Venüs'ten gelen yüksek Venüs ekspresyonu seviyesi, enfekte K18 hACE2 transgenik farelerin akciğerlerinde viral enfeksiyonun in vivo görüntüleme sistemi (IVIS) 39 kullanılarak tespit edilmesine izin verdi. Venüs ekspresyon seviyeleri, akciğerlerde tespit edilen viral titrelerle iyi korelasyon gösterdi ve Venüs ekspresyonunun SARS-CoV-2 enfeksiyonunun geçerli bir vekili olarak kullanılmasının fizibilitesini gösterdi. rSARS-CoV-2 / Nluc kullanarak, viral enfeksiyonun dinamiklerini gerçek zamanlı olarak izleyebildik ve K18 hACE2 transgenik farelerde aynı IVIS yaklaşımını kullanarak SARS-CoV-2 enfeksiyonunu in vivo olarak uzunlamasına değerlendirebildik.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

K18 hACE2 transgenik fareleri içeren protokoller, Teksas Biyomedikal Araştırma Enstitüsü (TBRI) Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi40'ın Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'ndaki önerileri takip eder. Farelerle çalışırken uygun Kişisel Koruma Ekipmanı (KKD) gereklidir.

1. K18 hACE2 transgenik farelerin kullanımı

  1. 4-6 haftalık dişi B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn / J fareleri (K18 hACE2 transgenik fareler) biyogüvenlik düzeyinde (BSL)-2 hayvan bakım tesisinde belirli patojensiz koşullar altında satın alın ve bakımını yapın.
    1. BSL2 tesislerine vardıktan sonra, hayvanların 7 gün boyunca alışmalarına izin verin ve enfeksiyonlar ve diğer deneysel prosedürler için BSL-3 hayvan tesisine aktarın.
    2. IACUC protokollerini takiben, kafes başına 4 fare yerleştirin. Hayvanın öldüğünden emin olmak için, rSARS-CoV-2 ile fareler enfeksiyonundan ve in vivo görüntülemeden sonra, ölümcül bir Fatal-Plus dozu (>100 mg / kg) ile hayvanları ötenazi yapın.

2. Biyogüvenlik

NOT: Bu makalede, rSARS-CoV-2, daha önce açıklandığı gibi SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 suşu için BAC tabanlı ters genetik sistemler kullanılarak üretilmiştir37. rSARS-CoV-2/Nluc veya rSARS-CoV-2/Venüs enfeksiyonlarını içeren tüm in vivo prosedürler, BSL-3 koşulları altında biyolojik bir güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir.

  1. Bu makalede açıklanan tüm deneysel prosedürleri uygulamadan önce ve uyguladıktan sonra biyogüvenlik kabinini% 2 Wexicide ve% 70 Etanol dezenfektanı ile sırayla temizleyin.
  2. Her kullanımdan önce ve sonra tüm diseksiyon malzemelerini (makas, disseksiyon forsepsleri vb.) ve homojenizatörü sterilize edin.
  3. İzolasyon odasını temizleyin ve üreticinin talimatına göre her kullanımdan önce ve sonra MB10 tabletleri kullanarak dezenfekte edin.
  4. IBC ve IACUC yönergelerini takip eden prosedürler sırasında üretilen tüm biyolojik materyalleri atın.

3. rSARS-CoV-2'nin in vivo karakterizasyonu

  1. Fare enfeksiyonları
    1. Dişi 4-6 haftalık K18 hACE2 transgenik fareleri etiketli kafeslere yerleştirin, bir kulak punch kodu kullanarak her kafesteki fareleri tanımlayın ve kafes başına 4 fare yerleştirin. Vücut ağırlığı ve hayatta kalma için bir grup fareyi ve viral titrasyon ve görüntüleme için başka bir grup hayvanı kullanın.
    2. Enfeksiyondan önce, biyolüminesans sinyalini kolaylaştırmak için göğüs kafesini pektoral meme ucundan kasık meme başı bölgesine ventral tarafta tıraş edin.
    3. rSARS-CoV-2 inokulunu, steril 1x fosfat tampon salin (PBS) kullanarak steril koşullar altında toplam 50 μL hacimde 105 plak oluşturan birim (PFU)/fare ile hazırlayın.
      NOT: Viral seyreltmede kullanılacak rSARS-CoV-2 miktarını şu formülle hesaplayın: virüs gerekli = (fare başına 105 PFU / 50 μL) x son hacim) / stok viral titre.
    4. Virüs inokulumunu buz üzerinde soğutulmuş halde tutun.
    5. Alaycı virüslü (1x PBS) ve rSARS-CoV-2/WT ile enfekte olmuş fareleri dahili kontrol olarak kullanın. Alaycı enfekte fareleri rSARS-CoV-2 ile enfekte olmuş farelerden ayrı bir kafese yerleştirin.
    6. Bir anestezi odasında% 5 izofluran gazlı sedasyon kullanarak fareleri anestezi altına alın ve% 3 izofluran ile koruyun.
    7. Postüral reaksiyon ve sağ refleks onaylandıktan sonra, fareyi dorsal yassı pozisyona getirin.
    8. Farenin boynunu işaret parmağı ve başparmak arasında sürün ve hayvanı sırt pozisyonunda tutmak için kuyruğu pembemsi parmağınızla elin avucuna doğru tutun.
    9. 50 μL virüs inokülumu içeren pipet ucunu burun deliğine yerleştirin ve çözeltiyi yavaşça çıkarın. İnokulum damlasının kaybolduğunu gözlemleyerek virüs inokulumunun solunduğundan ve reflü olmadığından emin olun.
  2. rSARS-CoV-2/Nluc ile enfekte olmuş biyolüminesans izleme K18 hACE2 transgenik fareler (Şekil 1 ve Şekil 2)
    NOT: Bu deney şematik gösterimi izler ve Şekil 1'de görüntülenen virüsleri kullanır. İn vivo görüntüleme sistemi (IVIS) için izofluran anestezi bağlantısı gereklidir. Gerekli enstrümanlar ve sistemler için Malzeme Tablosu'na bakınız.
    1. Görüntüleme yazılımını başlatın ve parametreleri ayarlayın, görüntü modunu Biyolüminesans olarak tıklatın, filtreyi açın ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın.
    2. IVIS makinesini başlattıktan sonra, fareleri hala biyogüvenlik kabininin içindeyken izolasyon odasına yerleştirin. İzofluran içeren fareleri% 5'lik bir konsantrasyonda indükleyin. Postüral reaksiyon kaybı ve sağa doğru refleks doğrulandıktan sonra,% 3 izofluran ile devam edin.
    3. Fareler anestezi uygulandıktan sonra, onları izolasyon odasından çıkarın ve retro-orbital olarak 1x PBS'de (son hacim 100 μL / fare) 1:10 seyreltilmiş lusiferaz substratını 25 G iğne ile uygulayın.
    4. Lusiferaz substrat uygulamasından sonra, görüntüleme prosedürü sırasında hayvanı anestezi altında tutmak için fareleri göğüsleri yukarı bakacak şekilde ve burun boşluğuna manifold konisinin içine yerleştirin.
    5. İzolasyon odacığını IVIS makinesine aktarın ve IVIS görüntüleyici kapağını kapattıktan hemen sonra, başlatılacak yazılım programında Al'ı seçin (Şekil 2A).
    6. Elde edilen biyolüminesans görüntülerini analiz etmek için, hassas sinyali belirlemek ve akıyı ölçmek için yazılımdaki ROI (ilgi bölgesi) aracını kullanın (Şekil 2B).
    7. Ölçüm'e tıklayın ve sistemin çeşitli parametreler tarafından sağlanan çıktı ölçümleriyle karşılaştırılabilir mutlak foton emisyonunu sağlamak için fotonlardaki biyolüminesansı değerlendirmeye başlamasına izin verin.
    8. Enfeksiyondan 1, 2, 4 ve 6 gün sonra görüntü fareleri.
    9. Görüntülemeden sonra fareleri tekrar kafese yerleştirin.
  3. rSARS-CoV-2/Venüs ile enfekte olmuş K18 hACE2 transgenik farelerde floresan analizi (Şekil 3 ve Şekil 4)
    NOT: Bu deney, Şekil 3'te gösterilen şematik gösterimi ve rSARS-CoV-2'yi izler. Gerekli enstrümanlar ve sistemler için Malzeme Tablosu'na bakınız.
    1. Görüntüleme yazılımını başlatın ve parametreleri ayarlayın, uyarma (500 nm) ve emisyon filtrelerini (530 nm) ayarlayın, görüntü modunu Floresan olarak tıklayın ve pozlama süresini otomatik olarak ayarlayın.
    2. İntraperaton olarak, ölümcül bir Fatal-Plus dozu (>100 mg / kg) kullanarak fareleri ötenazi yapın. Ötanazi sonrasında, kesi yerini% 70 etanol ile dezenfekte edin.
    3. Cımbız kullanarak cildi çekin, sternumdan karnına bir kesi yapın ve kesiyi yanlardan makasla kesin. Akciğerlerdeki kan miktarını en aza indirmek ve görüntüleme sırasında yüksek arka plan sinyallerinden kaçınmak için hepatik damarı kesin.
    4. Makas kullanarak sternumu kesin ve göğüs kafesini açın. Daha sonra, trakeanın ucunu makasla kesin ve akciğerleri cımbızla çıkarın.
    5. Eksize edilen akciğerleri 2 mL 1x PBS içeren 6 delikli bir plakaya yerleştirin ve fazla kanı çıkarmak için durulayın. %70 etanol kullanarak numuneler arasındaki cerrahi aletleri dezenfekte ederek ve temizleyerek numuneler arasında kontaminasyon olasılığını en aza indirin.
    6. IVIS makinesini başlattıktan sonra, akciğerleri siyah bir tepsiye yerleştirin ve dokuları birbirinden ayırın.
    7. Tepsiyi biyogüvenlik kabininin içindeki izolasyon odasının içine yerleştirin ve ardından izolasyon odasını IVIS'e aktarın. Kapıyı kapatın ve görüntüleme sistemini başlatmak için Edin'e tıklayın (Şekil 4A).
    8. Floresanı analiz etmek için, ROI aracını kullanın ve her bir ciğerin etrafına yatırım getirisi çekin. Her bir yatırım getirisini manuel olarak ölçün ve ardından verilen ortalama radyant verimlilik değerlerini kullanın ve alay virüslü farelerinkilerden çıkarın (Şekil 4B).
    9. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, dokuları aynı gün analiz için buzun üzerine veya daha sonra işlenmek üzere -80 ° C'de saklamak üzere kuru buz dondurma için bir kriyotüp içine yerleştirin.
  4. rSARS-CoV-2/Nluc (Şekil 2A-C) ve rSARS-CoV-2/Venüs ile enfekte olmuş K18 hACE2 transgenik farelerin akciğer parlak alan görüntülemesi ve patoloji skorlaması (Şekil 4A-C)
    1. rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT ile enfekte olmuş ve alaycı enfekte olmuş farelerin biyolüminesansını görüntüledikten sonra, fareleri kafeslerine geri döndürün. Ötanazi ve fare akciğerlerinin ex vivo parlak alan görüntülemesi ile devam edin (Şekil 2A).
    2. Enfekte farelerin akciğerlerinin ex vivo floresansını görüntüledikten sonra, akciğerlerin parlak alan görüntülerini alın (Şekil 4A).
    3. ImageJ kullanarak akciğer yüzeyindeki brüt lezyonları analiz edin (Şekil 2C ve 4C).
    4. ImageJ'de analiz edilecek akciğer görüntüsünü açın.
    5. Pikselin cm'ye oranını hesaplayın, Düz aracını kullanın ve görüntünün gerçek uzunluğunu ölçün.
    6. Seçtikten sonra, uzunluk için piksellerin uzunluğunu hesaplamak üzere Analiz > Ölçü'ye tıklayın.
    7. Analiz > Set Scale'e tıklayın ve önceki adımdan hesaplanan sayıları girin.
    8. Freehand Selections aracını kullanın ve tüm akciğer yüzeyini seçin. Toplam akciğer alanını ölçmek için Analiz > Ölç'e tıklayın.
    9. Akciğer bölgesinin geri kalanını seçmek için > Seçimini Düzenle > Ters Yap'a tıklayın, ardından arka planı kaldırmak için Delete veya back space tuşuna basın.
    10. Seçilen alanı kaldırın, ardından Görüntü > > Renk Eşiğini Ayarla'ya tıklayın.
    11. Patolojik lezyon alanını seçmek için, mevcut tıkanıklık ve kanama seviyelerine bağlı olarak Parlaklık'ı minimum (1 ila 50 arasında) ve maksimum (50 ila 200 arasında) olarak ayarlayın.
    12. Patolojik lezyonlar seçildikten sonra, eşik renk panelinin altındaki Seç'e tıklayın, ardından patolojik alanları ölçmek için Analiz > Ölçüm'e tıklayın.
    13. Brüt lezyonların yüzdesini şu formülle hesaplayın: patolojik alanın % 'si = (patolojik alanın / toplam akciğer yüzeyinin ölçümü) x 100.
  5. Viral titrasyonlar (Şekil 2D ve Şekil 4D)
    1. Görüntüleme üzerine, farelerin ötenazisini tamamlayın ve akciğerleri, beyni ve burun mukozasını toplayın.
    2. Akciğerleri, beyni ve burun mukozasını ayrı steril doku homojenizatörlerine yerleştirin ve 1 mL soğuk 1x PBS ekleyin.
    3. Pelet hücresi kalıntılarına 10 dakika boyunca 21.500 x g'de santrifüj yaparak numuneleri homojenize edin. Süpernatantları toplayın ve yeni bir steril tüpe aktarın ve peleti atın.
    4. Viral titrasyonlar aynı gün gerçekleştiriliyorsa, süpernatantları 4 °C'de saklayın. Alternatif olarak, homojenize numunelerin süpernatantını daha sonra değerlendirilene kadar -80 °C'de dondurun.
    5. Doku homojenatlarından elde edilen süpernatantların kullanılması, 10 kat seri seyreltmeler yapar ve süpernatantın her bir seyreltmesinin 1 mL'si ile Vero E6 hücrelerinin akan tek katmanlarını enfekte eder (6 kuyucuklu plaka formatı, 1.2 × 106 hücre / kuyu, üçlü).
    6. Virüsün nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 1 saat boyunca adsorbe olmasına izin verin.
    7. Viral adsorpsiyondan sonra, hücreleri 1 mL 1x PBS ile yıkayın ve nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatöründe nemlendirilmiş% 5 CO 2 inkübatöründe72 saat boyunca% 1 Agar içeren 2 mL enfeksiyon sonrası ortamda inkübe edin.
    8. Kuluçkadan sonra, plakaları 4 ° C'de 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin içinde etkisiz hale getirin, tüm plakanın suya batırıldığından emin olun.
    9. Plakaları BSL3'ten çıkarın ve hücreleri 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 1 mL% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.
    10. Hücreleri, 37 ° C'de 1 saat boyunca 1 x PBS'de 1 mL% 2.5 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin, ardından SARS-CoV nükleokapsid (N) proteini çapraz reaktif monoklonal antikorun (1C7C7) 1 mL'lik 1 mL'lik inkübasyonu, 37 ° C'de 1 saat boyunca% 2.5 BSA'da seyreltilir.
    11. Hücreleri 1 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve üreticilerin talimatlarına göre ABC kitini ve DAB Peroksidaz Substrat kitini kullanarak plakları geliştirin.
    12. Viral titreleri PFU / mL olarak hesaplayın.
      NOT: PFU/mL = seyreltme faktörü x plak sayısı x (1 mL/inokulum hacmi) formülü ile hesaplayın.
  6. rSARS-CoV-2/Nluc ile enfekte olmuş K18 hACE2 transgenik farelerin dokularında Nluc aktivitesi (Şekil 2E)
    1. Üreticilerin talimatlarını izleyerek bir luferaz testi kullanarak mock, rSARS-CoV-2 / WT ve rSARS-CoV-2 / Nluc ile enfekte K18 hACE2 transgenik farelerden organ homojenatlarında Nluc varlığını ölçün.
  7. Morbidite ve mortalitenin değerlendirilmesi (Şekil 2F, G ve Şekil 4E, F)
    1. 4-6 haftalık dişi K18 hACE2 transgenik farelere intranazal olarak 10adet 5 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venüs, rSARS-CoV-2/Nluc veya bölüm 3.1'de açıklandığı gibi alay ile enfekte olun.
    2. Gıda alımından kaynaklanan ağırlık değişimini en aza indirmek için fareleri 12 gün boyunca aynı anda izleyin ve tartın. İnsancıl bir son noktaya ulaştıklarından beri başlangıçtaki vücut ağırlıklarının% 25'ini kaybeden fareleri ötenazi yapın ve bu fareleri viral enfeksiyona yenik düştüklerini not edin.
    3. 12 gün sonra, viral enfeksiyondan kurtulan fareleri ötenazi yapın ve vücut ağırlığı değişimi ve hayatta kalma yüzdesini hesaplayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

K18 hACE2 transgenik farelerde rSARS-CoV-2/Nluc enfeksiyonu (Şekil 1 ve 2)
Şekil 1A, in vivo enfeksiyonları değerlendirmek için kullanılan rSARS-CoV-2/WT (üstte) ve rSARS-CoV-2/Nluc (altta) modellerinin şematik bir temsilini göstermektedir. Şekil 1B, K18 hACE2 transgenik farelerde rSARS-CoV-2 / Nluc enfeksiyon dinamiklerini değerlendirmek için uygulanan şematik akış şemas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu protokol, viral enfeksiyonları in vivo izlemek için muhabir genlerini eksprese eden bu rSARS-CoV-2'yi kullanmanın fizibilitesini göstermektedir. Her iki muhabir eksprese eden rekombinant virüs, SARS-CoV-2 enfeksiyonlarını in vivo olarak incelemek için mükemmel bir araç sağlar. Tanımlanan ex vivo (rSARS-CoV-2/Venüs) ve in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) görüntüleme sistemleri, SARS-CoV-2 enfeksiyonunun dinamiklerini, viral patogenezi anlamak ve viral enfeksiyondan sonra farkl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın açıklanan çalışma ile ilgili olarak herhangi bir ticari, finansal ve finansal olmayan veya kişisel çıkar çatışması olmaksızın yürütüldüğünü beyan eder.

Teşekkürler

COVID-19 salgını sırasında tesislerimizi tamamen çalışır durumda ve güvenli tutma çabaları için enstitümüzdeki (Texas Biomedical Research Institute) üyelere teşekkür ederiz. Ayrıca, protokollerimizi zaman açısından verimli bir şekilde gözden geçirdikleri için Kurumsal Biyogüvenlik Komitemize (IBC) ve spell'e (IACUC) teşekkür ederiz. Sina Dağı'ndaki Icahn Tıp Fakültesi'nden Dr. Thomas Moran'a SARS-CoV çapraz reaktif 1C7C7 nükleokapsid (N) protein monoklonal antikorunu sağladığı için teşekkür ederiz. Martinez-Sobrido'nun laboratuvarındaki SARS-CoV-2 araştırması şu anda NIAID / NIH hibeleri RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 ve R43AI165089-01 tarafından desteklenmektedir; Savunma Bakanlığı (DoD) W81XWH2110095 ve W81XWH2110103'ü verir; Precision Therapeutic için San Antonio Ortaklığı; Teksas Biyomedikal Araştırma Enstitüsü Forumu; San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi; San Antonio Tıp Vakfı; ve NIAID tarafından finanse edilen İnfluenza Araştırma ve Müdahale Mükemmeliyet Merkezi (CEIRR, sözleşme # 75N93021C00014) tarafından finanse edilen İnfluenza Patogenezi ve İletimi Araştırma Merkezi (CRIPT) tarafından.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5% Triton X-100J.T.BakerX198-07Store at room temperature (RT)
1% DEAE-DextranMP Biomedicals195133
10% Formalin solution, neutral bufferedSigma-AldrichHT501128
AgarOxoidLP0028
24-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one662160
5% Sodium bicarbonateSigma AldrichS-5761
6-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one657160
96-well Cell Culture PlateGreiner Bio-one655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6)ATCCCRL-1586
Ami HTSpectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0Spectral Instruments ImagingImage analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35%Sigma-AldrichA9647Store at 4 °C
Cell culture grade waterCorning25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Corning Cellgro15-013-CVStore at 4 °C
Anesthesia gas machineVeterinary Anesthesia Systems, Inc.VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS)Seradigm1500-050Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic miceThe Jackson Laboratory34860
Graphpad Prism Version 9.1.0GraphPad
IsofluraneBaxter1001936040Store at RT
MARS Data Analysis SoftwareBMG LABTECH
MB10 tabletsQUIP LaboratoriesMBTAB1.5Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay ReagentPromegaN1110This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermoFisher Scientific269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100xCorning30-009-CIStore at -20 °C
PHERAstar FSXBMG LABTECHPHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizerBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mLBertin InstrumentsP000940-LYSK0-A
T75 EasYFlaskThermoFisher Scientific156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, PeroxidaseVector LaboratoriesPK-4002ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

Referanslar

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423(2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847(2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309(2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947(2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611(2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280(2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210(2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032(2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12(2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168(2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537(2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 177SARS CoV 2koronavir sfloresanbiyol minesansreplikasyon yetkin vir slermuhabir vir sNanoLuclusiferazven sfloresan proteinviral enfeksiyonin vivo g r nt lemeIVISAmi HTK18 hACE2 transgenik fareler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır