Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Özet

Bakteriler, biyoaktif biyolojik moleküller taşıyan nanometre boyutunda hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılarlar. EV araştırması, biyogenezlerini, mikrop-mikrop ve konakçı-mikrop etkileşimlerindeki rollerini ve bunların potansiyel terapötik uygulamalarını anlamaya odaklanmaktadır. EV araştırmalarının standardizasyonunu kolaylaştırmak için EV'lerin çeşitli bakterilerden ölçeklenebilir izolasyonu için bir iş akışı sunulmaktadır.

Özet

Çeşitli bakteri türleri, lipitler, proteinler, nükleik asitler, glikanlar ve ebeveyn hücrelerden türetilen diğer moleküllerden oluşan ~ 20-300 nm hücre dışı veziküller (EV'ler) salgılar. EV'ler, türler arası ve türler arası iletişim vektörleri olarak işlev görürken, aynı zamanda enfeksiyon ve kolonizasyon bağlamında bakteri ve konakçı organizmalar arasındaki etkileşime katkıda bulunur. Sağlık ve hastalıkta EV'lere atfedilen çok sayıda fonksiyon göz önüne alındığında, EV'leri in vitro ve in vivo çalışmalar için izole etmeye yönelik artan bir ilgi vardır. EV'lerin fiziksel özelliklere, yani boyuta göre ayrılmasının, veziküllerin çeşitli bakteri kültürlerinden izolasyonunu kolaylaştıracağı varsayılmıştır.

İzolasyon iş akışı, EV'lerin bakteri kültürlerinden izolasyonu için santrifüjleme, filtreleme, ultrafiltrasyon ve boyut dışlama kromatografisinden (SEC) oluşur. Ölçeklenebilirliği artırmak için pompa tahrikli teğetsel akış filtrasyonu (TFF) adımı dahil edildi ve malzemenin litre başlangıç hücresi kültüründen izole edilmesini sağladı. Escherichia coli , EV ile ilişkili nanolusiferaz ve EV ile ilişkili olmayan mCherry'yi muhabir proteinler olarak ifade eden bir model sistem olarak kullanılmıştır. Nanolusiferaz, N-terminusunu sitolisin A ile kaynaştırarak EV'lere hedeflendi. İlişkili sitolisin A - nanoLuc ile ilişkili 20-100 nm EV'ler içeren erken kromatografi fraksiyonları, serbest proteinleri içeren daha sonraki fraksiyonlardan farklıydı. EV ile ilişkili nanolusiferazın varlığı, immünogold etiketleme ve transmisyon elektron mikroskobu ile doğrulandı. Bu EV izolasyon iş akışı, diğer insan bağırsağı ile ilişkili gram-negatif ve gram-pozitif bakteri türlerine uygulanabilir. Sonuç olarak, santrifüjleme, filtrasyon, ultrafiltrasyon / TFF ve SEC'nin birleştirilmesi, EV'lerin çeşitli bakteri türlerinden ölçeklenebilir izolasyonunu sağlar. Standartlaştırılmış bir izolasyon iş akışının kullanılması, türler arasında mikrobiyal EV'lerin karşılaştırmalı çalışmalarını kolaylaştıracaktır.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hem prokaryotik hem de ökaryotik hücreler tarafından salgılanan lipitler, proteinler, glikanlar ve nükleik asitlerden oluşan nanometre boyutunda, lipozom benzeri yapılardır¹. EV'lerin gram-negatif bakterilerden salınımını görselleştiren ilk çalışmalardan bu yana, bakteriyel EV'lere (çapı 20-300 nm) atfedilen biyolojik fonksiyonların sayısı son yıllarda sürekli artmaktadır. İşlevleri arasında antibiyotik direncinin aktarılması³, biyofilm oluşumu⁴, çekirdek algılama⁵ ve toksin dağıtımı^{6 bulunur}. Bakteriyel EV'lerin terapötik olarak kullanılmasına, özellikle aşı^{bilimi 7} ve kanser tedavisi^8'de artan bir ilgi vardır.

EV araştırmalarına artan ilgiye rağmen, izolasyon yöntemleriyle ilgili hala teknik zorluklar var. Spesifik olarak, tekrarlanabilir, ölçeklenebilir ve çeşitli EV üreten organizmalarla uyumlu izolasyon yöntemlerine ihtiyaç vardır. EV izolasyonu ve araştırma yöntemlerini planlamak ve raporlamak için birleşik bir ilkeler kümesi oluşturmak için, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği, MISEV pozisyon makalesi^9'u yayınlar ve günceller. Ayrıca, EV-TRACK konsorsiyumu, şeffaflığı artırmak için yayınlanan makalelerde kullanılan EV izolasyonu için ayrıntılı metodolojileri raporlamak için açık bir platform sağlar¹⁰.

Bu protokolde, EV'lerin memeli hücre kültüründen izolasyonu için kullanılan önceki metodolojiler, EV'lerin bakteriyel hücre kültüründen izole edilmesini sağlamak için ^11,12 uyarlanmıştır. Ölçeklenebilir olabilen çeşitli mikroplardan EV izolasyonunu sağlayan ve EV saflığını ve verimini dengeleyen yöntemler kullanmaya çalıştık (MISEV pozisyon kağıdı^9'da tartışıldığı gibi). Santrifüjleme ve filtreleme yoluyla bakteri hücrelerini ve kalıntıları temizledikten sonra, kültür ortamı ya santrifüj cihazı ultrafiltrasyonu (~ 100 mL'ye kadar bir hacim için) veya pompa tahrikli TFF (daha büyük hacimler için) ile konsantre edilir. EV'ler daha sonra küçük EV'lerin saflaştırılması için optimize edilmiş sütunlar kullanılarak SEC tarafından izole edilir.

Şekil 1: Bakteriyel EV izolasyonu iş akışı şemasına genel bakış. Kısaltmalar: EV = hücre dışı vezikül; TFF = teğetsel akış filtrasyonu; SEC = boyut dışlama kromatografisi; MWCO = moleküler ağırlık kesme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Escherichiacoli'nin bir fare-kommensal suşu (yani, E. coli MP1¹³) model bir organizma olarak kullanılmış ve daha önce bildirildiği gibi sitolisin A'ya füzyon yoluyla EV-ilişkili nanolusiferazı eksprese etmek için modifiye edilmiştir¹⁴. Burada kullanılan yöntemler, en az birkaç litreye kadar bakteri kültürünü işleyebilir ve EV ile ilişkili olmayan proteinleri etkili bir şekilde ayırabilir. Son olarak, bu yöntem diğer gram-pozitif ve gram-negatif bakteri türleri için de kullanılabilir. Bildirilen deneylerin ilgili tüm verileri EV-TRACK bilgi tabanına (EV-TRACK ID: EV210211)¹⁰ sunulmuştur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bakteri ve rekombinant DNA içeren tüm çalışmaların, her suşun biyogüvenlik tehlike seviyesine uygun biyogüvenlik muhafazası için en iyi uygulamaları takip ettiğinden emin olun. Çalışmalar yerel, ulusal ve uluslararası biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak yapılmalıdır.

1. Bakteri suşları ve kültürleme koşulları

NOT: Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları Escherichia coli MP1¹³, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve ve Bifidobacterium dentium idi.

1. E. coli için, tek kolonileri 250 ila 1.000 mL Luria-Bertani (LB) suyuna aşılamak için steril bir döngü kullanın ve kültürü işlemeden önce 48 saat boyunca 300 rpm ve 37 ° C'de sallanan bir inkübatörde aerobik olarak inkübe edin. P114-mCherry-Clyluc (Ek Yöntem ve Ek Şekil S1) barındıran rekombinant E. coli MP1 suşu için, LB agarına kloramfenikol ve et suyuna 17 μg / mL'lik son konsantrasyonda ekleyin.
2. A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve ve B. dentium için, Beyin kalp infüzyonu (BHI) agar plakalarına çizgi çizin ve vinil anaerobik bir odanın içinde anaerobik olarak inkübe edin. Tek kolonileri 100 mL önceden indirgenmiş BHI suyuna aşılayın ve anaerobik olarak 48 saat boyunca inkübe edin.

2. EV izolasyonu

1. Santrifüjleme ve filtrasyon ile bakteri kültürü ortamının berraklaştırılması
   1. 250 mL veya 500 mL polipropilen santrifüj şişelerini dökerek temizlemek için adım 1'de aşılanan bakteri hücre kültürlerini aktarın. Şişeleri 4 °C'de ve 5.000 × g'da 15 dakika boyunca büyük kapasiteli, sabit açılı bir rotorda santrifüj edin. Süpernatantı dikkatli bir şekilde dökerek temiz santrifüj şişelerine aktarın ve 15 dakika boyunca 10.000 × g'da tekrar santrifüj yapın.
      NOT: Biyogüvenliğe uygun temizlik ve dekontaminasyondan sonra şişeleri tekrar kullanın.
      1. İkinci santrifüjlemeden sonra büyük bakteri hücresi peletleri varsa, hücreleri daha fazla çıkarmak için santrifüjlemeyi temiz bir şişede tekrarlayın.
   2. Süpernatantı dökerek uygun boyutta 0,22 μm polietersülfon vakumla çalışan filtre cihazına aktarın. Filtreleme cihazını bir vakum duvarı beslemesine bağlayarak filtreleyin. Filtreleme hızı önemli ölçüde düşerse, filtrelenmemiş herhangi bir malzemeyi yeni bir cihaza taşımanız yeterlidir. Filtrelenmiş ortamı gece boyunca 4 ° C'de saklayın ve istenirse ertesi gün protokole devam edin.
      NOT: Yukarıdaki santrifüjlemeler tipik olarak her bir cihazdan belirtilen hücre kültürü hacminin ~2 katının işlenmesine izin verir. Örneğin, tek bir 500 mL filtre cihazı, ~ 1.000 mL önceden santrifüj edilmiş kültürü filtreleyebilir. Bu aygıtlar genellikle yeniden kullanılmaz. Bu adımda şırınga filtrelerinin kullanılması, test edilen modellerde önemli kayıplar kaydedildiğinden, optimizasyon olmadan önerilmez. Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
   3. Bu noktada, filtrelenmiş süpernatantın bir alikotunu uygun agar plakalarına yayarak canlı hücrelerin tamamen çıkarılmasını kontrol edin ve bakteri suşu için optimum koşullarda inkübasyondan sonra herhangi bir koloninin bulunmadığından emin olun. Bakteri tespit edilirse, ek santrifüjlemeler ve / veya filtrelemeler yaparak yukarıdaki prosedürü daha da optimize edin.
2. Filtrelenmiş ortamın konsantrasyonu
   1. Önemli ölçüde >100 mL hacimlerle çalışıyorsanız, adım 2.2.2'ye geçin. ~100 mL'lik hacimlerle çalışıyorsanız, serolojik pipetler kullanarak ilgili kapasiteli 100 kDa moleküler ağırlıklı kesme (MWCO) santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazının rezervuarına 90 mL filtrelenmiş kültür ortamı yükleyin. Her zaman eşleşen bir ultrafiltrasyon cihazı ile dengeleyin ve üst rezervuardaki ortamın hacmi 0,5 mL'ye konsantre olana kadar 15-30 dakikalık aralıklarla 4 °C ve 2.000 <× g'de sallanan kova rotorunda santrifüj yapın.
      1. Rezervuarı kalan filtrelenmiş kültür ortamıyla doldurun. "Yükleniyorsa", cihazın altındaki akışı kaldırın ve tüm cihazları yeniden dengeleyin.
         NOT: Bu cihazlar kullanılarak konsantre edilebilen filtrelenmiş kültür ortamının maksimum hacminin, önerilen hacmin <2 katı olduğu gözlenmiştir.
      2. Rezervuardaki konsantre ortamın viskozitesi gözle görülür şekilde artarsa (koyu, viskoz malzeme), fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyreltin ve 100 kDa'lık MWCO'dan daha küçük EV olmayan proteinleri seyreltmek için santrifüjleme ile yeniden konsantre edin.
         NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
      3. Konsantre ortamı düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın, gece boyunca 4 ° C'de saklayın ve istenirse ertesi gün protokole devam edin.
   2. Önemli ölçüde 100 mL'> hacimlerle çalışıyorsanız, işlenecek hacme uyum sağlamak için uygun boyutta bir TFF cihazı (100 kDa MWCO) seçin.
      NOT: 100 mL ila >1.000 mL işleme için filtreleme cihazları piyasada mevcuttur. Yerel kullanılabilirlik, maliyet ve pompa ve boru/bağlantılarla uyumluluk, hangi modellerin en kullanışlı olacağını belirleyecektir. Filtrenin temizlenmesi gerekmeden önce Malzeme Tablosunda belirtilen cihazla 2 L'ye kadar kültür ortamı işlenmiştir (temizleme protokolü için aşağıdaki adım 2.3'e bakın).
      1. Ek Şekil S2'de belirtildiği gibi, #16 düşük bağlayıcı/düşük liç borusu, Luer adaptörlerine, TFF cihazına ve peristaltik pompaya 1/8 inç hortum dikenli bir filtreleme devresi monte edin.
         NOT: EV preparatının çevresel bakterilerle kirlenme riskini en aza indirmek için TFF'yi bir biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirin.
      2. Oda sıcaklığında, filtrelenmiş, şartlandırılmış ortamı yaklaşık 200 mL / dak'da (minimum 100 mL / dak) dolaştırmaya başlayın. Dereceli bir kaba 200 mL PBS pompalayarak istenen akış hızına karşılık gelen uygun RPM'yi belirleyin. Filtrelenmiş, şartlandırılmış ortamı dolaştırırken, ultrafiltrasyon membranını geçen <100 kDa molekülleri ayrı bir kapta atık olarak toplayın.
         NOT: Aşağıdaki örnekte 2 L'lik bir kültür başlangıç hacmi varsayılmıştır.
      3. Hacmi ~ 100-200 mL'ye düşene kadar şartlandırılmış ortamı dolaştırmaya devam edin. Gerektiğinde daha küçük gemilere geçin. PBS ile 2 kat seyreltin ve 75-100 mL'ye kadar konsantre olarak pompa ile dolaşmaya devam edin. PBS ile 2 kat seyreltin ve 25 mL'lik son bir hacme kadar dolaşmaya devam edin. PBS ile 2 kat seyreltin ve <10 mL'ye kadar dolaşmaya devam edin.
      4. Besleme borusunu numune haznesinden kaldırın ve filtreyi boşaltmak ve maksimum numune miktarını geri kazanmak için pompalamaya devam edin.
         NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
      5. Konsantre numuneyi konik bir tüpe aktarın ve istenirse gece boyunca 4 ° C'de saklayın. Alternatif olarak, protokolle devam edin.
      6. Konsantre numuneyi 15 mL kapasiteli 100 kDa MWCO santrifüjlü ultrafiltrasyon cihazına taşıyın. Üst rezervuardaki ortamın hacmi ×2 mL'ye konsantre olana kadar 15-30 dakikalık aralıklarla 4 °C ve 2.000 < g'da sallanan bir kova rotorunda santrifüj.
         NOT: Bu potansiyel bir durma noktasıdır.
      7. Konsantre ortamı düşük protein bağlayıcı bir tüpe aktarın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın, istenirse ertesi gün protokole devam edin.
3. TFF cihazının temizlenmesi (opsiyonel)
   NOT: TFF cihazı işlem sırasında "tıkanmaya" başladığında filtrasyon hızı azalır (kirlenme). Gerekirse, aynı saflaştırma çalışmasında ek numunelerin filtrelenmesini kolaylaştırmak için filtre cihazı temizlenebilir. Teorik olarak mümkün olmasına rağmen, çapraz kontaminasyonu önlemek için farklı bir arıtma işlemi için temizlenmiş bir TFF filtresi kullanılmamıştır.
   1. Temizlemek için, TFF cihazındaki tüm boruları ve kapakları çıkarın ve kalan sıvıyı boşaltın.
   2. TFF cihazının hem iç hem de dış bölmelerini (yani, Malzeme Tablosunda listelenen modeldeki paralel ve dik portlar aracılığıyla) ~ 100 mL damıtılmış su ile doldurmak için peristaltik pompayı ve boruyu kullanın. Tüm boruları/kapakları çıkarın ve TFF cihazını boşaltın.
   3. Dış (dik, filtrat) portları kapatın ve 250 mL'lik %20 etanolün damıtılmış suda >200 mL/dak'da iç bölmeden 10 dakika boyunca dolaştırın. Boşaltın, damıtılmış suyla su basın ve yukarıdaki gibi tekrar boşaltın.
   4. 250 mL 0,5 N taze NaOH çözeltisini iç bölmeden 30 dakika boyunca dolaştırın ve tekrar boşaltın.
   5. Ek Şekil S2'de olduğu gibi tüm boru ve kapakları giriş, çıkış ve filtreleme portlarına yeniden bağlayın ve 1 mL/cm2^{filtre yüzey} alanı hacmindeki bir hacim filtre membranına nüfuz edene ve filtrat / atık olarak toplanana kadar 0,5 N NaOH çözeltisini tekrar >.
   6. TFF cihazını yukarıdaki gibi damıtılmış su ile durulayın. TFF cihazını hemen kullanın veya cihazı ~ 100 mL% 20 etanol ile doldurun ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
      NOT: Etanolde depolanmışsa, >1 mL/cm2 hacimli bir filtre yüzey alanı filtre membranına nüfuz edene ve numune işlemeden önce artık etanolün giderilmesi için filtrat/atık olarak toplanana kadar²⁵⁰ mL PBS'yi boşalttığınızdan, suyla duruladığınızdan, boşalttığınızdan ve cihazdan sirküle ettiğinizden emin olun.
4. Boyut hariç tutma kromatografisi (SEC)
   NOT: SEC, EV'lerin saflığını arttırmak ve veziküler olmayan proteini uzaklaştırmak için kullanılır.
   1. EV'lerin <100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için küçük bir SEC sütunu (10 mL yatak hacmi) ve EV'lerin >100 mL başlangıç malzemesinden izolasyonu için daha büyük bir sütun (47 mL yatak hacmi) kullanın.
      NOT: Aşağıdaki örnekte, daha büyük sütunun hacimleri, küçük sütunun hacimleri parantez içinde listelenecektir.
   2. SEC sütununu ve PBS'yi birkaç saat içinde oda sıcaklığına getirin. Standart bir laboratuvar standı ve tutucu kullanarak SEC kolonunu dikey konumda stabilize edin. Alternatif olarak, ticari kromatografi sütun standları kullanın.
   3. SEC sütununa bağlanmadan önce, 5 mL PBS'nin fritten ve bir atık kabına akmasına izin vererek numune haznesini nemlendirin. SEC sütununun giriş kapağını sökün, numune haznesine 2 mL PBS ekleyin ve PBS fritten damlarken rezervuarı dikkatlice kolona bağlayın (küçük SEC sütunları için geçerli değildir).
      NOT: Bu önceki adım, hava kabarcıklarının SEC sütununun üst kısmında sıkışmasını önler. Hava sıkışırsa, rezervuarı çıkarın, hava kabarcığını çıkarmak için sütuna dokunun ve bağlantı prosedürünü tekrarlayın. Daha küçük sütun için, SEC sütununun üst kısmındaki kapağı açmanız ve numune haznesini takmanız yeterlidir.
   4. Numune deposuna 47 mL (10 mL) PBS ekleyin ve SEC sütununun alt kapağını açın. Denge için yüklenen tüm numune arabelleğinin kolondan akmasına izin verin. Akış akışını atın.
   5. Numune haznesine en fazla 2 mL (0,5 mL) numune yükleyin, akışı atın ve numunenin kolona tamamen girmesine izin verin.
   6. PBS'yi derhal numune haznesine veya haznesine numune hacmi eksi 14,25 mL'lik bir hacimde ekleyin (küçük sütun için numune hacmi eksi 3 mL). Çözümün sütundan akmasına izin verin ve sütun boşluk hacmine eşit olan bu miktarı atın.
      NOT: Tipik bir 2 mL numune için, numune haznesine veya haznesine eklenecek PBS miktarı 12,25 mL olacaktır.
   7. SEC sütununun hemen altına 2 mL'lik düşük bağlayıcı bir mikrotüp yerleştirin. Hemen numune haznesine 2 mL (0,5 mL) PBS ekleyin ve sütuna girmesine izin verin. Bu ilk 2 mL (0,5 mL) akış geçişini Fraksiyon 1 olarak etiketleyin. Sonraki her fraksiyonu toplamak için numune rezervuarına bir seferde 2 mL (0,5 mL) eklemeye devam edin.
      NOT: Çoğu bakteriyel EV, ilk 5 fraksiyonda ortaya çıkar. Optimizasyon sırasında, ilk 12 kesir toplandı.
   8. Kısa süreli depolama için fraksiyonları 4 ° C'de (gün) veya uzun süreli depolama için -80 ° C'de saklayın.
   9. Yeniden kullanılabilir SEC sütunlarının temizlenmesi ve depolanması
      NOT: Bu protokolde açıklanan SEC sütunları, üreticiye göre en fazla 5 kez yeniden kullanılabilir. SEC sütunlarının akış hızı <5 kullanımdan sonra azalırsa, üretici, SEC'den önceki agregaları temizlemek için konsantre numunelerin 10.000 x g'de 10 dakika boyunca santrifüj edilmesini önerir. Ardından, EV izolasyonu için bu santrifüjlemenin süpernatantını SEC sütununa yükleyin.
      1. Her kullanımdan sonra SEC sütununu temizlemek ve saklamak için, 0,5 M NaOH'nin 2 mL'sini (0,5 mL) ekleyin ve sütuna tamamen girmesine izin verin. Kolondan 100 mL (20 mL) %20 etanol geçirin ve bir sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Bir sonraki kullanımdan önce, etanolün yukarıdaki gibi oda sıcaklığına dengelenmesini sağlayın ve sütundan başka bir 150 mL (30 mL) PBS çalıştırarak PBS tamponu ile değiştirin.
      2. Her kullanımdan sonra SEC sütununu temizlemek ve hemen yeniden kullanmak için, 0,5 M NaOH'nin 2 mL'sini (0,5 mL) ekleyin ve sütuna tamamen girmesine izin verin. NaOH'yi temizlemek için yaklaşık 150 mL (30 mL) PBS tamponu çalıştırın. Elüatın pH'ı PBS'ye (~7) eşit olduğunda, yeni bir numune yüklenebilir.

3. EV hazırlama kalite kontrol

1. Sterilite testi
   NOT: Bu EV'ler bakteri kültürlerinden geldiğinden, aşağı akış kullanımından önce sterilitenin sağlanması kritik öneme sahiptir.
   1. Tahlillerde kullanılacak fraksiyonların 100 μL'sini (20 μL) elde edin ve kaynak bakterileri büyütmek için kullanılan ortamın 3 mL'sini aşılayın. En az 3 gün boyunca ilgili optimal koşullar altında kültür ve bulanıklık için gözlemleyin. Alternatif olarak, fraksiyon örneklerini, üreten bakterileri büyütmek ve koloni oluşumunu aramak için kullanılan ortamı içeren agar plakalarına uygulayın.
      NOT: Bakteriyel kontaminasyon tespit edilirse, deney için EV preparatının kullanılması önerilmez. Bunun yerine, (a) şartlandırılmış bakteriyel hücre kültürü ortamının yeterli santrifüjleme/filtrasyonunu gerçekleştirerek, (b) temiz şişeler, tüpler, filtreler ve kromatografi sütunları kullanarak ve (c) uygun aseptik teknikler kullanarak bakteriyel kontaminasyon riskini en aza indirmeye özen göstererek izolasyonu tekrarlayın.
2. Protein niceliği
   NOT: Yüksek hassasiyetli, floresan bazlı bir protein niceleme kiti kullanılmıştır ( bkz. Kit, 485/590 nm uyarma/emisyon dalga boylarında eşleşen tescilli bir florimetre ile çalışır.
   1. Tüm reaktifleri, standartları ve numuneleri oda sıcaklığına getirin.
   2. Her numune ve test edilecek standart için 199 μL tampona 1 μL reaktif ekleyerek bir ana protein reaktifi ve tampon karışımı hazırlayın. İnce duvarlı 0,5 mL PCR tüpleri kullanarak, her standart tüpe 10 μL standart + 190 μL ana karışım ekleyin.
      NOT: Tahlil aralığında olmak için, her numune tüpüne eklenecek her fraksiyonun miktarı, saflaştırmanın beklenen protein verimine bağlıdır. Tipik olarak, her fraksiyonun 5 μL'si + 195 μL ana karışım kullanılmıştır. Numune + ana karışımın son hacmi 200 μL olmalıdır.
   3. Tahlil tüplerini vorteks edin ve karanlıkta oda sıcaklığında en az 15 dakika kuluçkaya yatırın.
   4. Ok düğmelerini kullanarak Protein testi seçeneğini belirleyerek ve onaylamak için GO düğmesine basarak uygun tescilli florimetredeki standartları ölçün (Malzeme Tablosuna bakın). Ekrandaki talimatları izleyin, her standart tüpü takın ve GO tuşuna basın.
   5. Deneysel numune tüpünü yerleştirin; okumak için GO tuşuna basın; ve tahlil tamponu/numune karışımındaki gerçek protein konsantrasyonu olan görüntülenen sonucu not edin. Numunedeki protein konsantrasyonunu elde etmek için, Numune konsantrasyonunu hesapla seçeneğini belirlemek üzere ok tuşlarını kullanın, GO tuşuna basın ve verilen numune için tahlil tamponuna eklenen numune hacmini seçmek üzere ok tuşlarını kullanın. GO tuşuna basın ve örnek protein konsantrasyonunu kaydedin. Analiz edilecek her örnek için bu adımı yineleyin.
3. Partikül sayımı ve boyut dağılımı
   NOT: EV konsantrasyonunu ve boyut dağılımını ölçmek için mikroakışkanlar dirençli darbe algılama (MRPS) kullanılmıştır.
   1. PBS'deki numuneleri, 0.02 μm'lik bir şırınga filtresinden yaklaşık 0.1 μg / mL'lik bir protein konsantrasyonuna filtrelenmiş% 1 Tween-20 ile desteklenmiş olarak seyreltin.
      NOT: Seyreltmenin amacı, EV içeren fraksiyonlarda 10¹⁰ parçacık/mL aralığında beklenen parçacık konsantrasyonuna ulaşmaktır. Optimal seyreltmenin ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir. Daha sonraki fraksiyonlar için az sayıda EV beklenmektedir (Fraksiyon 6'nın ötesinde). Bu nedenle, partikül konsantrasyonu, düşük seyreltmelerde analiz edilmesine rağmen, muhtemelen <10¹⁰ partikül / mL olacaktır.
   2. Her numuneden 3 μL'sini mikropipetle tek kullanımlık mikroakışkanlar kartuşuna yükleyin, kartuşu MRPS cihazına takın ve mavi aydınlatmalı jantlı metal düğmeye basın.
   3. Edinme yazılımında Go! 'ya tıklayın ve numunenin cihaz tarafından analiz edilmesini bekleyin. Analizin teknik istatistiksel hatasını en aza indirmek için 1.000 ila 10.000 parçacık olayı elde edin. Bu noktada, örnek alımını tamamlamak için Çalıştırmayı Durdur ve Sonlandır'ı tıklatın.
      NOT: Ham veri dosyalarıyla birlikte cihaz, numunedeki partikül konsantrasyonunu listeleyen bir özet elektronik tablo çıkarır. Bu değeri, yapılan numune seyreltmesine göre düzeltin.
   4. Analiz yazılımını kullanarak, ham verileri yükleyin ve boyut dağılımının özelleştirilmiş grafiklerini oluşturun.

4. EV depolama

1. Aliquot bireysel veya havuzlanmış fraksiyonları, düşük protein bağlayıcı tüplerde bireysel fraksiyon boyutunun% 25-50'sine (kullanılan sütunun boyutuna bağlı olarak) ve donma-çözülme döngülerini önlemek için -80 ° C'de saklayın.
   NOT: Farklı uygulamalar, her deneyde kullanılan beklenen miktara bağlı olarak daha küçük veya daha büyük alikotlar gerektirebilir. Bunun ampirik olarak belirlenmesi gerekecektir. EV içermeyen fraksiyonlar, araştırma hedeflerine uygulanamazsa atılabilir.

5. İletim elektron mikroskobu

1. Negatif boyama
   1. Karbon kaplı bakır 400 örgü ızgaraya 5 μL EV numunesi ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Numune tarafını 5 damla 5 mM Tris tamponu (pH 7.1) ve ardından 5 damla damıtılmış su ile yıkayın.
   2. 5 damla% 2 uranil asetat ile leke örneği tarafı. Filtre kağıdı ile fazladan miktarda lekeyi temizleyin ve ızgaranın birkaç saat veya gece boyunca tamamen kurumasını bekleyin. Örnekleri 80 kV'ta çalışan bir elektron mikroskobu ile görselleştirin.
2. İmmünogold etiketleme
   1. Bir formvar/karbon 400 örgü ızgaraya 10 μL EV süspansiyonu uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edin. Izgarayı PBS'de üç kez yıkayın ve ardından numuneyi sabitlemek için 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit uygulayın. PBS ile ızgaraları beş kez yıkayın.
   2. Izgarayı,% 0.1 sığır serum albümini (BSA) içeren üç PBS yıkamasıyla bloke edin. Daha sonra, oda sıcaklığında 40 dakika boyunca 10 μL birincil antikor uygulayın (burada, 1 μg / mL nluc antikoru). % 0.1 BSA içeren PBS ile üç kez daha yıkayın.
   3. Izgaraya 10 μL ikincil altın etiketli antikor ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika boyunca inkübe edin. Izgaraları PBS ile üç kez yıkayın.
      NOT: Burada, 10 nm altın nanopartiküllerle konjuge edilmiş bir keçi anti-fare antikoru, tamponu bloke etmede 1:10 seyreltildikten sonra kullanılmıştır. Altın etiketleme EV görselleştirmesini gizliyorsa, bunun yerine daha küçük altın nanopartiküllere (örneğin 5 nm) sahip ikincil antikorlar kullanılabilir.
   4. Izgarayı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 μL% 2.5 glutaraldehit ile sabitleyin. PBS'de üç kez yıkayın. 15 dakika boyunca% 2 uranil asetat (10 μL) ile negatif boyama yapın. Numuneleri 10 dakika boyunca 10 μL% 0.5 uranil asetat ve% 0.13 metil selüloz çözeltisine yerleştirin.
   5. Elektron mikroskobunda görüntülemeden önce numune ızgaralarının oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin.
   6. Mikroskop toplama yazılımında, görüntünün optimum kalitesini elde etmek için pozlamayı ampirik olarak belirleyin (örneğin, bu özel kurulumda 0.80851 s) ve bu değeri pozlama süresi seçenek kutusuna yazarak ayarlayın. 80 kV seçeneğini belirleyin ve görüntüyü yakalamak için Almayı Başlat'ı tıklatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

EV'ler için hangi SEC kromatografi fraksiyonlarının zenginleştirildiğini değerlendirmek için, SEC kolonuna TFF tarafından 1.000 kat konsantre edilmiş 2 mL E. coli MP1 şartlandırılmış kültür ortamı yüklendi ve sıralı fraksiyonlar toplandı. MRPS kullanılarak, Fraksiyonlar 1-6'nın en fazla EV'yi içerdiği bulunmuştur (Şekil 2A). Sonraki fraksiyonlar, EV-içermeyen proteinler yerine çok az sayıda EV içeriyordu (Şekil 2B). EV'le...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yukarıdaki protokolde, ölçeklenebilir ve EV'leri çeşitli gram-negatif / pozitif ve aerobik / anaerobik bakterilerden güvenilir bir şekilde izole eden bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür boyunca birkaç potansiyel durma noktasına sahiptir, ancak EV'leri şartlandırılmış bakteri kültürü ortamından izole etmek için 48 saatten daha uzun sürmekten kaçınmak daha iyidir.

İlk olarak, şartlandırılmış bakteri kültürü ortamı oluşturmak için bakteri kültürlemesinden...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	3430	it is important to use thin-walled PCR tubes to obtain accurate readings with Qubit
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution	Electron microscopy sciences	15700
250 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite polypropylene centrifuge bottles	ThermoFisher	010-1493
65 mm Polypropylene Round-Bottom/Conical Bottle Adapter	Beckman Coulter	392077	Allows Vivacell to fit in rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge	Beckman Coulter		No longer sold by Beckman. Avanti J-26XP is closest contemporary model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Brain Heart infusion (BHI) broth	Himedia	M2101	After autoclaving, Both BHI broth and agar were introduced into the anaerobic chamber, supplemented with Menadione (1 µg/L), hematin (1.2 µg/L), and L-Cysteine Hydrochloride (0.05%). They were then incubated for at least 24 h under anaerobic conditions before inoculation with the anaerobic bacterial strains.
C-300 microfluidics cartridge	Spectradyne
Chloramphenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Electron microscope	FEI company	Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competent cells)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (gift)		commensal bacteria derived from mouse gut
Fiberlite 500 mL to 250 mL adapter	ThermoFisher	010-0151-05	used with Fiberlite rotor to enable 250 mL bottles to be used for smaller size of starting bacterial culture
Fiberlite fixed-angle centrifuge rotor	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	fits 6 x 500 mL bottles
Formvar Carbon Film 400 Mesh, Copper	Electron microscopy sciences	FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-grade, 10% aqeous solution)	Electron microscopy sciences	16100
Hematin	ChemCruz	207729B	Stock solution was made in 0.2 M L-histidine solution as  1.2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader	Tecan		This equibment was used to measure the mCherry fluorescence
In-Fusion  HD Cloning Plus	Takara	638909	For cloning of the PCR fragements into the PCR-lineraized vectors
JS-5.3 AllSpin Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) broth, Miller	Difco	244620
L-Cysteine Hydrochloride	J.T. Baker	2071-05	It should be weighed and added directly to the autoclaved BHI media inside the anaerobic chamber
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-08	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer to Hose Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - special	HV-30800-24	connection adapters for filtration tubing circuit
Masterflex L/S Analog Variable-Speed Console Drive, 20 to 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, PharmaPure, L/S 16; 25 ft	Cole Palmer	EW-06435-16	low-binding/low-leaching tubing
Menadione (Vitamin K3)	MP	102259	Stock solution was made in ethanol as 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF device we have used to filter up to 2 L of E. coli culture supernatant
Nano-Glo Luciferase Assay System	Promega	N1110	This assay kit was used to measure the luminescence of the nluc reporter protein
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antibody, clone 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidics resistive pulse sensing instrument	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		Analysis software for particle size distribution
OneTaq 2x Master Mix with Standard Buffer	NEB	M0482	DNA polymerase master mix used to perform the routine PCR reactions for colony checking
Protein LoBind, 2.0 mL, PCR clean tubes	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerase master mix used to perform the PCR reactions needed for cloning
qEV original, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 0.5 mL
qEV rack	Izon		for use with the qEV-original SEC columns
qEV-2, 35 nm	Izon		maximal loading volume of 2 mL
Qubit fluorometer	ThermoFisher		Item no longer available. Closest available product is Qubit 4.0 Fluorometer (cat. No. Q33238)
Qubit protein assay kit	ThermoFisher	Q33211	Store kit at room temperature. Standards are stored at 4 °C.
Sorvall Lynx 4000 centrifuge	ThermoFisher	75006580
SpectraMax i3x Microplate reader	Molecular Devices		This equipment was used to measure the nanoluciferase bioluminescence
Stericup Quick-release-GP Sterile Vacuum Filtration system (150, 250, or 500 mL)	MilliporeSigma	S2GPU01RE S2GPU02RE S2GPU05RE	One or multiple filters can be used to accommodate working volumes. In our experience, you can filter twice the volume listed on the product size.
Uranyl acetate	Electron microscopy sciences	22400
Vinyl anaerobic chamber	Coy Lab
Vivacell 100, 100,000 MWCO PES	Sartorius	VC1042
Whatman Anotop 10 Plus syringe filters (0.02 micron)	MilliporeSigma	WHA68093002	to filter MRPS diluent