Zonular Liflerin Viskoelastik Özelliklerinin Belirlenmesinde Biyolojik Hazırlık ve Mekanik Teknik

Özet

Protokol, hücre dışı matris viskoelastisitesinin incelenmesi ve protein bileşimine veya çevresel faktörlere bağımlılığı için bir yöntem tanımlamaktadır. Hedeflenen matris sistemi fare zonule'sidir. Yöntemin performansı, vahşi tip zonular liflerin viskoelastik davranışı ile mikrofibril ilişkili glikoprotein-1'den yoksun olanlar karşılaştırılarak gösterilmiştir.

Özet

Elastikiyet kan damarları, kaslar ve akciğerler gibi dokuların işlevi için gereklidir. Bu özellik çoğunlukla hücre ve dokuları birbirine bağlayan protein meshwork olan hücre dışı matristen (ECM) türetilmiştir. Bir ECM ağının elastik özelliklerinin bileşimiyle nasıl ilişkili olduğu ve ECM'nin gevşeme özelliklerinin fizyolojik bir rol oynayıp oynamadığı, henüz tam olarak ele alınmamış sorulardır. Zorluğun bir kısmı, çoğu ECM sisteminin karmaşık mimarisinde ve ECM bileşenlerinin yapılarından ödün vermeden izole edilmesindeki zorlukta yatmaktadır. Bunun bir istisnası, omurgalıların gözünde bulunan bir ECM sistemi olan zonule'dir. Zonule, lens ve göz duvarı arasındaki hücresiz boşluğu kapsayan yüzlerce ila binlerce mikrometre uzunluğunda liflerden oluşur. Bu raporda, viskoelastik özelliklerini ölçmek ve bireysel protein bileşenlerinin katkısını belirlemek için zonulün son derece organize yapısından yararlanan mekanik bir tekniği açıklıyoruz. Yöntem, lensi ve zonuleyi açığa çıkarmak için sabit bir gözün diseksiyonu içerir ve gerginlikleri izlenirken zonular lifleri eşit olarak uzatan bir barfiks tekniği kullanır. Teknik nispeten ucuzdur, ancak belirli zonular proteinlerden yoksun veya yaşlanmaya sahip farelerde zonular liflerin viskoelastik özelliklerindeki değişiklikleri tespit edecek kadar hassastır. Burada sunulan yöntem öncelikle oküler gelişim ve hastalığı incelemek için tasarlanmış olsa da, elastik ECM'lerin viskoelastik özellikleri ve iyonik konsantrasyon, sıcaklık ve sinyal molekülleriyle etkileşimler gibi dış faktörlerin rolü ile ilgili daha geniş soruları keşfetmek için deneysel bir model olarak da hizmet edebilir.

Giriş

Bir omurgalının gözü, görüntüleri retinaya odaklamaya yardımcı olan canlı bir optik lens ^içerir1. Lens, Şekil 1A'da gösterildiği gibi hassas, radyal yönelimli fiberlerden oluşan bir sistem tarafından optik eksende askıya alınmıştır. Bir uçta, lifler lens ekvatoru ve diğer ucunda siliary gövdenin yüzeyine bağlanır. Uzunlukları farelerde 150 μm ile insanlarda 1 mm arasında değişen mesafelere yayılır. Toplu olarak, bu lifler Zinn2 zonule, siliary zonule veya sadece zonule olarak bilinir. Oküler travma, hastalık ve bazı genetik bozukluklar zonular liflerin bütünlüğünü ^{etkileyeb....}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Washington Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylandı ve OFTALMIK ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'ne bağlı kalındı.

1. Özel parçaların imalatı ve aparatların yapımı

1. Özel parçaların imalatı
   1. Sonda imalatı. Şekil 2A'nın sol panelinde gösterildiği gibi bir açıyla cam kılcal damar tutun. Bir ucundan yaklaşık 2 cm uzaklıktaki bir çakmağın alevini yerleştirin ve Şekil 2A'nın sağ panelinde gösterildiği gibi, uç 90 ° bükülene kadar orada tutun.
   2. Örnek platform imalatı. 3....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada açıklanan barfiks tekniği, farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini belirlemek için basit bir yaklaşım sağlar. Kısacası, fare gözü ilk olarak fizyolojik göz içi basıncında bir fiksatif enjeksiyonu ile korunur. Bu yaklaşım gözün doğal enflasyonuni korur ve lifleri düzgün bir şekilde önceden gergin tutar (ön deneyler liflerin elastikiyetini veya gücünü önemli ölçüde değiştirmediğini gösterdikten sonra fiksasyon kabul edilebilir görülmüştür). Fare gözünün ar.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Zonule, liflerin simetrik olarak düzenlendiği ve optik eksen boyunca göz merceği yerinden edilerek aynı şekilde manipüle edilebilen alışılmadık bir ECM sistemidir. Alan ayrıca hücresel bozulma olmadan kolayca erişilebilir ve liflerin kendi yerel durumlarına yakın bir ortamda incelenmesini sağlar. Barfiks tekniği, genetik olarak çekişli bir sistem olan farelerden gelen hassas lifleri manipüle etmek ve mekanik özelliklerini doğru bir şekilde ölçmek için bu ECM sunumundan yararlanır. Bu, anahtar .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/4-20 hex screws 3/4 inch long	Thorlabs	SH25S075
1/4-20 nut	Hardware store
3D SLA printer	Anycubic	Photon
4-40 screws 3/8 inch long, 2	Hardware store
Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament	WPI	1B120-3
Cyanoacrylate (super) glue	Loctite
Digital Scale accurate to 0.01 g	Vernier	OHAUS Scout 220
Excel	Microsoft		Spreadsheet
Gas cigarette lighter
Inspection/dissection microscope	Amscope	SKU: SM-4NTP	Working distance ~ 15 cm
Micromanipulator, Economy 4-axis	WPI	Kite-L
Motorized micrometer	Thorlabs	Z812B
Negative cylindrical lens	Thorlabs	LK1431L1	-75 mm focal length
Petri dishes, 50 mm
Post holder, 3 inches	Thorlabs	PH3
Post, 4 inches	Thorlabs	TR4
Scale logging software	Vernier	LoggePro
Servo motor controller	Thorlabs	KDC101
Servo motor controller software	Thorlabs	APT
Slotted base, 1	Thorlabs	BA1S
Slotted bases, 2	Thorlabs	BA2
Stand for micromanipular	WPI	M-10
USB-camera for microscope	Amscope	SKU: MD500
UV activated glue with UV source	Amazon