JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.

Özet

Prokaryotlarda glikozilasyon çalışması hızla büyüyen bir alandır. Bakteriler, yüzeylerinde glikanları suşa özgü bir barkod oluşturan farklı glikozile yapılar barındırır. İlişkili glikanlar, şeker bileşiminde ve yapısında ökaryotlarınkinden daha yüksek çeşitlilik gösterir ve bakteriyel-konakçı tanıma süreçlerinde ve çevre ile etkileşimde önemlidir. Patojenik bakterilerde, glikoproteinler enfeksiyöz sürecin farklı aşamalarında yer almıştır ve glikan modifikasyonları glikoproteinlerin spesifik fonksiyonlarına müdahale edebilir. Bununla birlikte, glikan bileşiminin, yapısının ve biyosentez yolaklarının anlaşılmasında kaydedilen ilerlemelere rağmen, glikoproteinlerin patojenite veya çevre ile etkileşimdeki rolünün anlaşılması çok sınırlı kalmaktadır. Ayrıca, bazı bakterilerde, protein glikozilasyonu için gerekli enzimler, lipopolisakkarit ve kapsül biyosentetik yollar gibi diğer polisakkarit biyosentetik yollarla paylaşılır. Glikozilasyonun fonksiyonel önemi, glikozilasyon sürecine dahil olduğu düşünülen spesifik genlerin mutasyonu ve hedef glikoprotein ve modifiye edici glikan'ın ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi yoluyla birçok bakteride açıklığa kavuşturulmuştur. Mezofilik Aeromonas tek ve O-glikozile polar flagelluma sahiptir. Flagellar glikanlar, karbonhidrat bileşiminde ve Aeromonas suşları arasındaki zincir uzunluğunda çeşitlilik gösterir. Bununla birlikte, bugüne kadar analiz edilen tüm suşlar, serin veya treonin kalıntılarını değiştiren bağlantı şekeri olarak bir pseudaminik asit türevi göstermektedir. Pseudaminik asit türevi polar flagella montajı için gereklidir ve kaybının yapışma, biyofilm oluşumu ve kolonizasyon üzerinde etkisi vardır. Bu makalede ayrıntılı olarak açıklanan protokol, null mutantların yapımının, bir flagellar glikan'ın biyosentezinde varsayılan glikoziltransferazlar içeren genlerin veya genom bölgelerinin katılımını anlamak için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Bu, ilgili glikoziltransferazların işlevini ve glikan'ın rolünü anlama potansiyelini içerir. Bu, glikan eksikliği olan mutantı vahşi tip suşla karşılaştırarak elde edilecektir.

Giriş

Protein glikozilasyonu hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde tanımlanmıştır ve bir glikan'ın bir amino asit yan zincirine kovalent bağlanmasından oluşur 1,2. Prokaryotlarda, bu süreç genellikle iki ana enzimatik mekanizma ile gerçekleşir: O- ve N-glikozilasyon 3. O-glikozilasyonda, glikan bir serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntısının hidroksil grubuna bağlanır. N-glikozilasyonda, glikan, X'in prolin hariç herhangi bir amino asit olabileceği Tripeptit dizileri Asn-X-Ser / Thr içindeki bir asparagin (Asn) kalıntısının yan zincir amid azotuna bağlanır.

Glikanlar doğrusal veya dallanmış yapıları benimseyebilir ve glikosidik bağlarla kovalent olarak bağlanmış monosakkaritlerden veya polisakkaritlerden oluşur. Prokaryotlarda, glikanlar genellikle ökaryotik glikanlara kıyasla şeker bileşiminde ve yapısında çeşitlilik gösterir4. Ayrıca, glikanın nasıl monte edildiği ve alıcı proteine nasıl aktarıldığı konusunda farklılık gösteren iki farklı bakteriyel glikozilasyon yolu tanımlanmıştır: sıralı ve en blok glikozilasyon 5,6. Sıralı glikozilasyon için, kompleks glikan, monosakaritlerin art arda eklenmesiyle doğrudan protein üzerinde oluşturulur. En blok glikozilasyonda, önceden monte edilmiş bir glikan, özel bir oligosakkariltransferaz (OTaz) tarafından lipite bağlı bir oligosakkaritten proteine aktarılır. Her iki yolun da N- ve O-glikozilasyon işlemlerinde rol oynadığı gösterilmiştir7.

Protein glikozilasyonu, proteinlerin fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin modüle edilmesinde rol oynar. Bir glikanın varlığı, proteinin biyolojik aktivitesini etkileyen proteinin ligandı ile nasıl etkileşime girdiğini etkileyebilir, ancak protein stabilitesini, çözünürlüğünü, proteolize duyarlılığını, immünojenitesini ve mikrop-konakçı etkileşimlerini de etkileyebilir 8,9. Bununla birlikte, glikan sayısı, glikan bileşimi, pozisyon ve bağlanma mekanizması gibi çeşitli glikozilasyon parametreleri de protein fonksiyonunu ve yapısını etkileyebilir.

Glikoziltransferazlar (GT'ler), kompleks glikanların ve glikokonjugatların biyosentezinde anahtar enzimlerdir. Bu enzimler, aktive edilmiş bir donör molekülünden gelen bir şeker parçası ile spesifik bir substrat alıcısı arasındaki glikosidik bağ oluşumunu katalize eder. GT'ler hem nükleotitleri hem de nükleotit olmayanları donör moleküller olarak kullanabilir ve proteinler, sakaritler, nükleik asitler ve lipitler gibi farklı substrat alıcılarını hedefleyebilir10. Bu nedenle, GT'leri moleküler düzeyde anlamak, etki mekanizmalarını ve özgüllüklerini tanımlamak için önemlidir ve ayrıca ilgili molekülleri değiştiren glikanların şeker bileşiminin patojenite ile nasıl ilişkili olduğunu anlamayı sağlar. Karbonhidrat Aktif enzim veritabanı (CAZy)11, GT'leri dizi homolojilerine göre sınıflandırır, bu da GT ailelerinin çoğunda yapısal kıvrım ve etki mekanizmaları değişmez olduğu için öngörücü bir araç sağlar. Bununla birlikte, dört neden birçok GT'nin substrat özgüllüğünü tahmin etmeyi zorlaştırmaktadır: 1) prokaryotlarda substrat özgüllüğünü belirleyen net bir dizi motifi belirlenmemiştir 12, 2) birçok GT ve OTaz, substrat karışıklığı göstermektedir13,14, 3) fonksiyonel GT'lerin rekombinant formda yüksek verimde üretilmesi zordur ve 4) hem donör hem de alıcı substratların tanımlanması karmaşıktır. Buna rağmen, son mutagenez çalışmaları, katalitik mekanizmaların anlaşılmasında ve GT'lerin bağlanmasının çıkarılmasında önemli ilerlemeler elde etmeyi mümkün kılmıştır.

Bakterilerde, O-glikozilasyon, N-glikozilasyondan daha yaygın görünmektedir. O-glikozilasyon bölgeleri bir konsensüs dizisi göstermez ve O-glikozile proteinlerin çoğu salgılanır veya flagellinler, pili veya ototransporterler gibi hücre yüzeyi proteinleri1. Flagellin glikozilasyonu, alıcı bölgelerin sayısında, glikan bileşiminde ve yapısında değişkenlik gösterir. Örneğin, Burkholderia spp flagellin'lerin yalnızca bir alıcı bölgesi varken, Campylobacter jejuni'de flagellinlerin 19 alıcı bölgesi15,16'ya kadar vardır. Ayrıca, bazı bakteriler için glikan tek bir monosakarittir, diğer bakteriler ise oligosakaritler oluşturmak için farklı monosakaritlerden ödün veren heterojen glikanlara sahiptir. Bu heterojenlik, aynı türün suşları arasında bile meydana gelir. Helicobacter flagellinleri sadece pseudaminic asit (PseAc)17 tarafından modifiye edilir ve Campylobacter flagellinler, pseudaminic asidin (PseAm) veya lejyonaminik asidin (LegAm) asetamidin formu olan PseAc ve asetil, N-asetilglukozamin veya propiyonik ikameler18,19 ile bu şekerlerden türetilen glikanlar tarafından modifiye edilebilir. Aeromonas'ta, flagellinler, bileşimi tek bir PseAc asit türevinden heteropolisakkarit20'ye kadar değişen glikanlar tarafından modifiye edilir ve glikanların flagellin monomerlerine bağlanması her zaman bir PseAc türevi aracılığıyladır.

Genel olarak, flagellinlerin glikozilasyonu, flagellar filament montajı, motilite, virülans ve konakçı özgüllüğü için gereklidir. Bununla birlikte, C. jejuni16, H. pylori17 ve Aeromonas sp. 21, protein monomerleri glikozile edilmedikçe, Pseudomonas spp. ve Burkholderia spp. olmadıkça filament halinde birleşemez. 15 flagella montajı için glikozilasyon gerektirmez. Ayrıca, bazı C. jejuni suşlarında, flagella glikanının şeker bileşimindeki değişiklikler bakteriyel-konakçı etkileşimini etkiler ve bazı bağışıklık tepkilerinden kaçınmada rol oynayabilir16. Otoaglütinasyon, flagellinlerle ilişkili glikanların bileşimindeki modifikasyonlardan etkilenen başka bir fenotipik özelliktir. Daha düşük bir otoaglütinasyon, mikrokoloniler ve biyofilm22 oluşturma yeteneğinde bir azalmaya yol açar. Bazı bakterilerde, flagella'nın pro-inflamatuar bir yanıtı tetikleme yeteneği, flagellin glikozilasyonu ile bağlantılıydı. Bu nedenle, P. aeruginosa'da, glikozile flagellin, glikozillenmiş olmayan23'ten daha yüksek bir pro-inflamatuar yanıtı indükler.

Aeromonas, çevrede her yerde bulunan Gram-negatif bakterilerdir, bu da tüm One Health bileşenlerinin arayüzünde olmalarını sağlar24. Mezofilik Aeromonas, yapısal olarak üretilen tek bir polar flagellum'a sahiptir. Klinik izolatların yarısından fazlası, yüksek viskoziteli ortamlarda veya plakalarda indüklenebilen lateral flagellin eksprese eder. Farklı çalışmalar her iki flagella tipini de bakteriyel patogenezin erken evreleri ile ilişkilendirmiştir25. Bugüne kadar bildirilen polar flagellinler, merkezi immünojenik alanlarının 5-8 Ser veya Thr kalıntılarında O-glikozile edilirken, lateral flagellinler tüm suşlarda O-glikozile edilmemiştir. Farklı suşlardan polar flagella glikanları, karbonhidrat bileşimlerinde ve zincir uzunluklarında20 çeşitlilik göstermesine rağmen, bağlantı şekerinin bir pseudaminik asit türevi olduğu gösterilmiştir.

Bu makalenin amacı, ilgili polisakkaritlerin biyosentezine ve bakteriyel patojeniteye katılımlarını ve glikan'ın kendisinin rolünü analiz etmek için belirli GT'lerde veya GT'leri içeren kromozomal bölgelerde boş mutantlar elde etmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Örnek olarak, polar flagellin glikozilasyonuna katılımını belirlemek ve flagellin glikanının rolünü analiz etmek için Aeromonas'ın GT'lerini içeren kromozomal bir bölgeyi tanımlar ve sileriz. Bu glikan'ın biyosentezindeki işlevini ve modifiye glikan'ın rolünü belirlemek için belirli bir GT'nin nasıl silineceğini gösteriyoruz. Örnek olarak Aeromonas kullanılmasına rağmen, prensip diğer Gram-negatif bakterilerin flagella glikozilasyon adalarını tanımlamak ve incelemek ve O-antijen lipopolisakkarit gibi diğer glikanların biyosentezinde yer alan GT'lerin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Prosedürün şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Aeromonas'ta flagella glikozilasyon adasının (FGI'lar) biyoinformatik tanımlanması

  1. Aeromonas genomlarındaki PseAc biyosentetik kümelerini tanımlamak için, NCBI veritabanı26'daki tblastn aracını kullanın. İlk olarak, sıralanmış Aeromonas suşlarının veritabanlarından A. piscicola AH-3'ün PseC ve PseI'sine (tanımlama kodları OCA61126.1 ve OCA61113.1) ortolog proteinleri alın ve ardından çevrilmiş nükleotid dizilerini aramak için tblastn aracını kullanın.
    NOT: Pse genleri, kümenin bir ucunda pseB ve pseC ve diğer ucunda bulunan pseI ile Aeromonas FGI'ları çevreler. Pse genlerinin geri kalanının yeri bir FGI grubundan diğerine farklı olabilir.
  2. Birçok suşun polar flagellin genlerinin FGI'lara bitişik olduğu göz önüne alındığında, A. piscicola AH-3'ün polar flagellinleri FlaA ve FlaB'sine (tanımlama kodları OCA61104.1 ve OCA61105.1'dir) ve bunları kodlayan genlere ortolog proteinler bulmak için NCBI veritabanından tblastn kullanın.
  3. Ek olarak, heteropolisakkaridik glikanların (grup II) biyosentezinde yer alan Aeromonas FGI'ler, luxC ve luxE gibi yağ asidi sentezinde yer alan enzimleri kodlayan birkaç gen içerir. NCBI veritabanındaki tblastn'ı, A. piscicola AH-3'ün LuxC'sine (tanımlama kodu OCA61121.1'dir) ve onu kodlayan gene ortolog proteinler bulmak için kullanın.

2. Flagella glikozilasyon adası genlerinde null mutantların oluşumu

NOT: Bu mutagenez yöntemi, intihar vektörü pDM428 (GenBank: KC795686.1) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) çerçeve içi delesyon ürünlerinin allelik değişimine dayanmaktadır. pDM4 vektörünün replikasyonu lambda pir'e bağımlıdır ve vektör üzerinde bulunan sacB geni kullanılarak tam allelik değişim zorlanır.

  1. PCR çerçeve içi silme ürünlerinin yapımı.
    1. Silinecek seçilen gen veya bölgenin DNA bölgelerini yukarı akış (A ve B primerleri) ve aşağı akış (C ve D primerleri) yükselten iki çift primer tasarlayın (Şekil 2B).
    2. Primer A ve D'nin, silinecek gen veya genlerin sırasıyla başlangıcından itibaren 600 bp'den fazla yukarı akışa ve duraktan aşağı akışa sahip olduğundan emin olun. Bu iki primerin 5' ucunda, pDM4'te klonlamaya izin veren bir endonükleaz için bir kısıtlama bölgesi içermesi gerekir.
      NOT: A ve D astarlarının 5' ucunda bulunan kısıtlama bölgesi, AB veya CD amplikonları içindeki sitelerle aynı olmamalıdır.
    3. Primer B ve C'nin silinecek genin içinde veya silinecek bölgenin sırasıyla ilk ve son geninin içinde olduğundan emin olun. Her iki primerin de (B ve C) çerçeve içinde olduğundan ve genin içindeki 5-6 kodon arasında bulunduğundan emin olun. Ayrıca, her iki primerin de 5' ucunda, DNA amplikonları AB ve CD'nin birleştirilmesine izin veren 21 bp tamamlayıcı bir dizi (Tablo 1) içerdiğinden emin olun.
    4. Seçilen Aeromonas suşunu 30 °C'de gece boyunca (O/N) 5 mL triptik soya suyu (TSB) içinde büyütün. Genomik DNA saflaştırması için piyasada satılan bir kit kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin (Malzeme Tablosu). Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış DNA'nın 2 μL'sini sayın.
      NOT: Çift damıtılmış suyu boş olarak kullanın, cihaz 260 nm'de absorbans kaydedecek şekilde ayarlanmıştır. 2 μL saflaştırılmış DNA ile emilimi 3-5 kez kaydedin ve ortalama bir absorbans okuması hesaplayın. DNA konsantrasyonunu hesaplamak için Beer-Lambert yasasını kullanın, burada A = Ɛ.c.l. burada "A" absorbanstır, "Ɛ" DNA için molar ortalama yok olma katsayısıdır, "c" DNA konsantrasyonudur ve "l" yol uzunluğudur (her bir enstrümanın yol uzunluğu için üreticinin talimatına bakın).
    5. A-B ve C-D primerleri olan iki asimetrik PCR setinde şablon olarak 100 ng saflaştırılmış kromozomal DNA kullanın (Malzeme Tablosu). A:B ve D:C astar çiftlerinin 10:1 molar oranını kullanın (Ek Malzeme).
      NOT: Asimetrik PCR'ler, şablonun bir ipliğinin diğerinden daha fazla tercihli amplifikasyonuna izin verir.
    6. PCR ürünlerini% 1'lik bir agaroz jelinde elektroforez ile analiz edin. TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) jel çalışma tamponu ve 8 V/cm güç ayarı olarak kullanın. DNA'yı görselleştirmek için, jele ethidyum bromür (0.5 μg / mL) ekleyin ve bir biyo-görüntüleme istasyonu (Malzeme Tablosu) kullanarak PCR ürünlerini görselleştirin.
    7. Bir neşter kullanarak amplikonları jelden tüketin, üreticinin protokolünü (Malzeme Tablosu) izleyerek saflaştırın ve bunları ölçün.
    8. AB ve CD amplikonlarını, PCR ürünlerinin 3' ucundaki 21 bp örtüşen dizileriyle birleştirin (Şekil 3). Her amplikodan (AB ve CD) 100 ng'yi PCR reaktifleri (AD öncesi PCR) ile bir PCR tüpünde, ancak primerler olmadan karıştırın ve termosikler programını (Ek Malzeme) kullanarak genişletin. Daha sonra, reaksiyona 100 μM A ve D primer ekleyin (AD PCR) ve tek bir parça olarak yükseltin (Ek Malzeme).
    9. PCR ürününü (AD amplicon), adım 2.1.6'da açıklanan koşulları kullanarak% 1'lik bir agaroz jelinde elektroforez ile analiz edin, amplikonu jelden ayırın, üreticinin protokolünü izleyerek saflaştırın ve amplikonu (Malzeme Tablosu) sayısallaştırın.
  2. Çerçeve içi delesyon ile pDM4 rekombinant plazmidin yapımı.
    1. Luria-Bertani (LB) Miller suyunda (10 mL) pDM4 içeren Escherichia coli cc18λ pir'in 30 ° C'de kloramfenikol (25 μg / mL) ile bir O / N kültürünü büyütün.
    2. Kültürü 4 ° C'de 5.000 x g'da döndürün ve peleti 600 μL steril damıtılmış suda askıya alın. Plazmid pDM4'ün ekstraksiyonunu ve saflaştırılmasını, sağlayıcının talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir plazmid saflaştırma kiti kullanarak gerçekleştirin (Malzeme Tablosu).
    3. AD amplikonunun her iki ucunu ve pDM4'ün klonlama bölgesini sindirebilen bir endonükleaz ile 2 saat boyunca 1 μg pDM4 ve 400 ng AD amplikonu sindirin (Şekil 3). Reaksiyon koşulları için enzim üreticisinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosu).
    4. Sindirilmiş plazmidi ve amplikonu bir DNA saflaştırma kiti kullanarak temizleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek bunları ölçün (Malzeme Tablosu).
    5. Doğrusallaştırılmış pDM4'ün yeniden bağlanmasını önlemek için, üreticinin talimatlarını izleyerek alkali fosfataz enzimini kullanarak fosfat grubunu her iki 5' ucundan çıkarın (Malzeme Tablosu). Ardından, işlenmiş plazmidi temizleyin ve adım 2.1.4'te (Malzeme Tablosu) açıklandığı gibi bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
    6. Sindirilmiş ve fosfataz alkali ile muamele edilmiş pDM4'ün 150 ng'sini 95-100 ng sindirilmiş AD amplikonu ile molar vektör: 1:4'lük bir ekleme oranında birleştirin. Ligasyon reaksiyonunu, üreticinin talimatlarını izleyerek 15 μL'lik bir hacimde hazırlayın (Malzeme Tablosu).
    7. O/N'yi 20 °C'de veya hafta sonu boyunca 4 °C'de inkübe edin. Kuluçkadan sonra, T4 ligazını 70 ° C'de 20 dakika boyunca inaktive edin.
    8. Plazmidi elektroporasyon yoluyla Escherichia coli MC1061λpir suşuna sokmak için ligasyon kullanın. Elektroremejman bakteriler ve 2 mm aralıklı elektroporasyon küvetleri kullanın.
  3. Elektroremetuar E. coli'nin hazırlanması ve pDM4 rekombinant plazmidinin elektroporasyonu
    1. Tek bir E. coli MC1061λpir kolonisini Luria-Bertani (LB) Miller suyuna aşılayın ve 200 rpm sallama ile 30 ° C'de O / N'yi büyütün.
    2. Bakteri kültürünün 2 mL'sini 18 mL LB suyunda seyreltin ve 0.4-0.6 arasında bir optik yoğunluğa (OD 600) ulaşılana kadar sallama (200 rpm) ile 30 ° C'de inkübe edin.
    3. Bakteri kültürünü 5.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Süpernatantı atın ve peleti 40 mL soğutulmuş damıtılmış H2O'da askıya alın.
    4. Tüm kültür tuzlarını çıkarmak için bu temizleme adımını iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, peleti 4 mL soğutulmuş damıtılmışH2O içinde askıya alın ve süspansiyonun 1 mL'sini dört konik 1.5 mL mikrofüj tüpünün her birine aktarın.
    5. Bakteri kültürünü 14.000 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve her peleti 100 μL soğutulmuş damıtılmışH2O içinde askıya alın.
    6. Her tüpe 3-3.5 μL ligasyon karışımı ekleyin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, her tüpün içeriğini soğutulmuş 2 mm aralıklı bir elektroporasyon küvetine aktarın ve 2 kV, 129 Ω ve 5 ms civarında sabit zaman uygulayın.
      NOT: Elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde önceden soğutun. Tüm prosedür boyunca bakterileri buz üzerinde tutun.
    7. Elektroporasyondan sonra, içeriklerini geri kazanmak için dört küvetin her birine 250 μL SOC ortamı ekleyin, bunları bir kültür tüpüne (yaklaşık 1 mL) aktarın ve sallanarak (200 rpm) 30 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
    8. Luria-Bertani (LB) agar plakaları üzerindeki dönüştürülmüş hücreleri, plakada büyüyen tüm kolonilerin plazmid omurgasına sahip olmasını sağlamak için kloramfenikol (25 μg / mL) ile takviye edilmiş olarak plakalayın.
    9. LB agar plakalarından kloramfenikollü bazı koloniler seçin ve O / N'yi 30 ° C'de inkübe edin. Koloniler büyüdüğünde, pDM4 klonlama tarafını çevreleyen primerleri kullanarak silme yapısının PCR tarafından pDM4'e yerleştirilmesini kontrol edin: pDM4for ve pDM4rev (Tablo 1) ve şablon olarak lize koloniler (Ek Malzeme).
    10. Steril bir kürdan ile bir koloni seçin ve 15 μL% 1 Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0 içeren 1.5 mL'lik bir tüpe batırın. Tüpleri 100 ° C'de 5 dakika ve daha sonra buz üzerinde 1 dakika inkübe edin.
    11. Tüpleri 12.000 x g'lık bir mikrofüjde 10 dakika boyunca bakteri ve döküntüleri pelet etmek için döndürün. PCR reaksiyonunda şablon olarak süpernatantın 1 μL'sini kullanın (Malzeme Tablosu). Astar çiftinin tavlama sıcaklığı 50 ° C'dir ve PCR reaksiyonu% 10 DMSO (Ek Malzeme) gerektirir.
    12. İlgilenilen ürünü 10 mL LB suyuna kloramfenikol (25 μg / mL) ile yükselten kolonileri aşılayın ve 30 ° C'de O / N'yi büyütün. Plazmidi 2.2.1-2.2.2 adımlarında açıklandığı gibi kültürlerden çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek pDM4 astarlarını kullanarak sıralayın (Malzeme Tablosu).
  4. Çerçeve içi silme işleminin Aeromonas soy
    NOT: pDM4 rekombinant plazmidi seçilen kişiye eklenmelidir. Aeromonas triparental çiftleşme ile gerilme (Şekil 4). Aeromonas Suş, triparental çiftleşmesinden sonra seçilmek üzere rifampisine dirençli olmalıdır. Bu nedenle, seçilen O / N suşlarını TSB'de 30 ° C'de, santrifüj 2 mL, 4 mL ve 6 mL kültürleri 5.000 x'te büyütün g 15 dakika boyunca, her peleti 100 μL TSB içinde ve plakayı TSA'da rifampisin (100 μg / mL) ile askıya alın.
    1. 25 μg/mL kloramfenikol (donör suşu) ile LB agar üzerinde pDM4 rekombinant plazmid ile E. coli MC1061λpir'in, TSA'da 100 μg/mL rifampisin (alıcı suşu) ile Aeromonas suşu rifampisin dirençli Aeromonas suşu rifampisin ve 30 °C'de 80 μg/mL spektinomisin (yardımcı suş) ile LB agar üzerinde pRK2073 plazmidli E. coli HB101'in O/N kültürlerini hazırlayın.
    2. Koloniler büyüdüğünde, donör, alıcı ve yardımcı suşların aynı sayıda kolonisini (10-15 koloni), 150 μL LB içeren üç LB tüpünde steril bir kürdan ile nazikçe askıya alın.
    3. Daha sonra, bir LB agar plakasında, antibiyotiksiz, üç bakteriyel süspansiyonu bir alıcıda iki damla halinde karıştırın: yardımcı: 5: 1: 1 donör oranı (alıcının 50 μL'si, donörün 10 μL'si ve 10 μL yardımcı). Plakayı 30 °C'de O/N'ye bakacak şekilde inkübe edin. Rekombinant plazmid olmadan donör suşu kullanarak konjugasyonun negatif kontrolünü gerçekleştirin.
      NOT: Yardımcı suş konjugatif plazmid pRK2073'ü taşır ve pDM4'ün Aeromonas'a aktarılmasına yardımcı olur. Pili'nin kırılmasını önlemek için donör, alıcı ve yardımcı suşları askıya almak için vorteks kullanmayın.
    4. 1 mL LB suyu ekleyerek ve bakteriyel bir süspansiyon elde etmek için steril bir cam serpme makinesi ile yayarak LB agar plakasından bakteri toplayın. Bakteriyel süspansiyonu konik 1,5 mL mikrofüj tüpüne ve girdabına kuvvetli bir şekilde aktarmak için bir pipet kullanın.
    5. pDM4 rekombinant plazmidini içeren alıcı kolonileri seçmek için, rifampisin (100 μg / mL) ve kloramfenikol (25 μg / mL) içeren LB agar plakaları üzerinde hasat edilen bakteriyel süspansiyonun 100 μL'lik plakası.
    6. Numunelerin 200 μL ve 600 μL'sini 15 dakika boyunca 5.000 x g'de bir mikrofüjde döndürün, peleti 100 μL LB suyu ve plakası içinde LB agar üzerine rifampisin (100 μg / mL) ve kloramfenikol (25 μg / mL) ile askıya alın. Tüm plakaları 30 °C'de 24-48 saat boyunca inkübe edin.
    7. Yetiştirilen kolonileri toplayın, rifampisin (100 μg / mL) ve kloramfenikol (25 μg / mL) içeren LB plakalarına aktarın ve 30 ° C'de O / N'yi inkübe edin. Daha sonra, oksidaz testi29 ile kolonilerin Aeromonas olduğunu ve pDM4 rekombinant plazmidinin, A ve D primerleri (Malzeme Tablosu) ile güçlendirilmiş bölgenin dışına bağlanan E ve F primerleri (Ek Materyal) kullanılarak PCR tarafından spesifik kromozomal bölgeye yerleştirildiğini (ilk rekombinasyon) doğrulayın. Adım 2.3.11'de açıklandığı gibi, şablon olarak 1 μL lize koloni kullanın.
    8. Çerçeve içi silme için allelik değişimi tamamlamak için, entegre intihar plazmidi ile kolonileri ikinci bir rekombinasyona zorlayın. Rekombinant kolonileri% 10 sakkaroz ile ve antibiyotiksiz, 30 ° C'de O / N'de 2 mL LB içinde büyütün.
    9. Sakkarozlu LB agar plakası üzerinde 2.4.8 adımından itibaren bakteri kültürlerinin 100 μL'lik plakası (%10). Ayrıca, plaka 100 μL farklı kültür seyreltmeleri (10-2-10-4) ve 30 ° C'de O / N'yi inkübe edin.
    10. pDM4 kaybını doğrulamak için, kolonileri toplayın, kloramfenikollü (25 μg / mL) LB plakalarına aktarın, 30 ° C'de O / N'yi inkübe edin ve ardından kloramfenikol duyarlı kolonileri seçin.
    11. Hassas kolonileri, E-F primer çiftini ve 1 μL lize kolonilerini şablon olarak kullanarak PCR ile analiz edin (Malzeme ve Ek Materyal Tablosu). PCR ürünü silinen yapının boyutuyla ilişkili olan kolonileri seçin.

3. Motilite tahlilleri

NOT: Glikozile flagellalı bazı bakteri türlerinde, glikozilasyon veya glikan bileşimi seviyelerindeki değişiklikler, genellikle bir motilite azalması veya hareketlilik yokluğu olarak yansıtılan flagellinlerin montajını etkiler. Bu nedenle, boş mutantlarla iki motilite testi yapıldı.

  1. Sıvı ortamda motilite testi
    1. Kültür Aeromonas, 25-30 ° C'de TSB'nin 1 mL'sinde O / N'yi suşlar. Bir mikroskop kapağı slaytını kazılmış bir slayda yapıştırmak için, kürdan ucuyla az miktarda silikon alın ve kapak slaytının dört köşesine küçük bir damla koyun. Daha sonra, kapak slaytının ortasına 1 μL Aeromonas kültürü koyun ve bir damla taze TSB ortamı (2 μL) ile karıştırın.
    2. Kapak slaytına kazılmış bir slayt yerleştirin. Kazıyı biriken damla ile eşleştirin, hafifçe bastırın ve slaytı baş aşağı çevirin.
    3. Daldırma yağı kullanarak 100x objektifli bir optik mikroskop (Malzeme Tablosu) kullanarak ışık mikroskobu ile yüzme hareketliliğini analiz edin.
      NOT: Aeromonas'ın vahşi tip suşu pozitif kontrol olarak kullanılmalıdır. Negatif bir kontrol olarak, Klebsiella gibi kamçılanmamış bir bakteri kullanın.
  2. Yarı katı ortamda motilite testi
    1. Kültür Aeromonas, TSB'de (1 mL) 25-30 °C'de O / N'yi suşlar. Daha sonra, kültürün 3 μL'sini yumuşak bir agar plakasının merkezine (% 1 tripton,% 0.5 NaCl,% 0.25 bacto agar) aktarın ve plakayı 25-30 ° C'de O / N'ye bakacak şekilde inkübe edin.
    2. Bir cetvel kullanarak, bakteri göçünü agar boyunca plakanın merkezinden çevreye doğru ölçün.

4. Flagella saflaştırma

  1. Bakteriyel yüzeye tutturulmuş flagellanın izolasyonu
    1. Kültür Aeromonas 25-30 °C'de TSB'de (10 mL) O/N suşları. Ardından, kültürü TSB (900 mL) ile bir şişeye genişletin ve sallanarak (200 rpm) 25-30 ° C'de O / N'nin büyümesine izin verin.
    2. 4 °C'de 20 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj. Peleti 20 mL'lik 100 mM Tris-HCl tamponunda (pH 7.8) askıya alın.
    3. Ankrajlı flagellayı çıkarmak için, süspansiyonu 3-4 dakika boyunca bir cam çubukla (2-3 mm çapında) bir girdapta kesin ve ardından 21-G şırıngadan tekrar tekrar (en az altı kez) geçirin.
    4. 4 ° C'de iki ardışık santrifüjleme ile pelet bakterileri: ilk olarak, 30 dakika boyunca 8.000 x g'de . Süpernatantı ve santrifüjü 20 dakika boyunca 18.000 x g'de çıkarın. Ücretsiz flagella içeren süpernatanı toplayın.
    5. Süpernatantı 4 °C'de 1 saat boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüj yapın ve peleti 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) artı 2 mM EDTA tamponunun 150 μL'sinde askıya alın. Pelet flagella filamentleri içerir.
    6. 4.1.5 adımından itibaren yeniden askıya alınan peletin 5-10 μL'sini% 12'lik bir SDS-Poliakrilamid jelinde elektroforez ile analiz edin ve Coomassie mavi boyama kullanarak proteinleri görselleştirin.
      NOT: Protein elektroforezi ve jel boyama için üreticinin talimatlarını izleyin. Glikozile flagellinin pozitif bir kontrolü olarak, vahşi tip suşun saflaştırılmış flagellasını kullanın. Flagella'nın zenginleştirilmiş fraksiyonunu bir sezyum klorür (ClCs) gradyanında saflaştırın.
  2. Flabella'yı saflaştırmak için sezyum klorür gradyanı.
    1. 12.1 g CsCl'yi 27 mL damıtılmış H2O ile karıştırın.
    2. Flagella'nın zenginleştirilmiş fraksiyonunu (150 μL) ince duvarlı ultra berrak bir tüpe (14 mm x 89 mm) (Malzeme Tablosu) aktarın ve 12 mL CsCl çözeltisi ile doldurun.
    3. Tüpü 60.000 x g'de 4 ° C'de 48 saat boyunca sallanan bir kova rotorunda ultrasantrifüj yapın (Malzeme Tablosu).
    4. Flagella bandını bir şırınga ve diyaliz ile 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) artı 2 mM EDTA'ya karşı CsCl gradyanına toplayın. Daha sonra, diyalize flagella'yı% 12'lik bir SDS-Poliakrilamid jel ve Coomassie mavi boyamasında (adım 4.1.6) elektroforez veya kütle spektrometrisi ile analiz edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu metodoloji, Aeromonas'ın genlerinde veya kromozomal bölgelerinde flagella glikozilasyonunu ve flagella filamentinin rolünü etkileyebilecek null mutantlar üretmek için etkili bir sistem sağlar (Şekil 1).

Protokol, varsayılan FGI'ların ve GT'leri kodlayan genlerin bu bölgede bulunan biyoinformatik tanımlanması ile başlar. Aeromonas'ta, FGI'ların kromozomal yerleşimi üç tip genin tespitine dayanır: pseudaminik asidin (pseI ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu yöntemin kritik erken adımı, flagella ve varsayılan GT'lerin glikozilasyonunda yer alan bölgelerin tanımlanmasıdır, çünkü bu enzimler yüksek homoloji gösterir ve birçok süreçte yer alır. Aeromonas genomlarının halka açık veri tabanlarındaki biyoinformatik analizi, bu bölgenin birçok suşta flagellin genlerini içeren ve pseudaminik asit27'nin biyosentezinde rol oynayan genleri içeren polar flagella bölgesi 2'ye bitişik olduğunu göstermektedir. Bu, Aerom...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Kanada Ulusal Araştırma Konseyi tarafından, Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) için desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction KitApplied Biosystems4337455Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelityInvitrogen12346-086Used for amplification of AB, CD and AD fragments
AgaroseConda-Pronadise8008Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP)PromegaM1821Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agarBecton Dickinson214010Use for motility analysis
BamHIPromegaR6021Used for endonuclease restriction
BglIIPromegaR6081Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin SystemUVPBio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymeraseBiolineBIO-21040Used for colony screening
Cesium chlorideApplichemA1126,0100Used for flagella purification
ChloramphenicolApplichemA1806,0025Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification KitCytivia28-9034-71Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTAApplichem131026.1211Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gapVWR732-1133Used for transformation
Ethidium bromideApplichemA1152,0025Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb markerBiolineBIO-33053DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification KitInvitrogen10750204Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agarCondalab996Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller brothCondalab1551Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000NanoDrop Techonologies IncSpectrophotometer used for DNA quantification
RifampicinApplichemA2220,0005Used for triparental mating
SOC MediumInvitrogen15544034Used for electroporation recovery
SpectinomycinApplichemA3834,0005Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman331362Used for flagella purification
T4 DNA ligaseInvitrogen15224017Used for ligation reaction
Trypticasein soy agarCondalab1068Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy brothCondalab1224Used for Aeromonas grown
TryptoneCondalab1612Use for motility analysis
TrisApplichemA2264,0500Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100ApplichemA4975,0100Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm)Beckman344059Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal CyclerApplied BiosystemsUsed for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II KitZymmo researchD4020Used for isolation of plasmid DNA

Referanslar

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377(2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91(2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697(2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703(1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116(2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 181O glikozilasyonglikoziltransferazlarheteroglikaner eve i i mutantlarmezofilik Aeromonasflagellinlerflagella safla t rmaCsCl gradyan

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır