Arkeolojik Kalıntılar'dan Antik DNA'nın Alınması için Optimize Edilmiş Kemik Örnekleme Protokolleri

Özet

Protokol, ortaçağ bireylerinden beş farklı iskelet elemanı (yaklaşık 1040-1400 CE, kalibre edilmiş 2-sigma aralığına tarihlenen radyokarbon) boyunca önerilen sekiz anatomik örnekleme yerinden (belirli bir iskelet elemanı üzerindeki belirli yerler) kemik tozunun toplanması için bir dizi en iyi uygulama protokolü sunmaktadır.

Özet

Burada sunulan yöntemler, insan DNA'sının eski arkeolojik kalıntılardan geri kazanılma şansını en üst düzeye çıkarmaya çalışırken, girdi numune materyalini sınırlandırmaktadır. Bu, iskelet boyunca DNA geri kazanımının karşılaştırmalı bir analizinde daha önce en yüksek miktarda antik DNA (aDNA) verdiği belirlenen anatomik örnekleme konumlarını hedefleyerek yapıldı. Önceki araştırmalar, bu protokollerin antik insan ve patojen DNA'sının arkeolojik kalıntılardan başarılı bir şekilde geri kazanılma şansını en üst düzeye çıkardığını ileri sürmüştür. DNA verimleri daha önce Parker ve ark. 2020 tarafından, Peißen Almanya yakınlarındaki terk edilmiş bir ortaçağ yerleşimi olan Krakauer Berg'deki ortaçağdan (yaklaşık 1040-1400 CE, kalibre edilmiş 2-sigma aralığına tarihlenen radyokarbon) mezarlıktan kurtarılan 11 kişiden elde edilen 11 kişiden çoklu iskelet elementleri arasında aDNA korumasının geniş bir araştırmasında değerlendirildi. Beş iskelet elementini (pars petrosa, kalıcı azı dişleri, torasik vertebra, distal falanks ve talus) kapsayan bu sekiz örnekleme noktası, verimin tüm elementler ve bireyler arasında genel ortalamadan önemli ölçüde daha yüksek olduğu yüksek kaliteli antik insan DNA'sını başarıyla verdi. Verimler, en yaygın aşağı akış popülasyon genetik analizlerinde kullanım için yeterliydi. Sonuçlarımız, arkeolojik kalıntılardan antik insan DNA'sının analizini içeren çoğu çalışma için bu anatomik örnekleme yerlerinin tercihli kullanımını desteklemektedir. Bu yöntemlerin uygulanması, değerli arkeolojik örneklerin tahribatını en aza indirmeye yardımcı olacaktır.

Giriş

DNA geri kazanımı ve analizi amacıyla eski insan kalıntılarının örneklenmesi doğası gereği yıkıcıdır 1,2,3,4. Örneklerin kendileri değerli örneklerdir ve morfolojik koruma mümkün olan her yerde korunmalıdır. Bu nedenle, örnekleme uygulamalarının hem yeri doldurulamaz malzemenin gereksiz yere tahrip edilmesini önlemek hem de başarı olasılığını en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmesi zorunludur. Mevcut en iyi uygulama teknikleri, adli araştırmalar^5,6, optimal örneklemenin geliştirilmesinin çalışmanın doğrudan amacı olmadığı eski örneklerin çalışmaları⁷ veya insan^{dışı kalıntıları kullanan} 8 veya çok küçük bir anatomik örnekleme yeri seçimini hedefleyen özel çalışmalarla sınırlı küçük bir çalışma kohortuna dayanmaktadır (burada kemik tozunun bulunduğu iskelet elemanının belirli bir alanını belirtmek için kullanılır), aşağı akış DNA analizlerinde kullanılmak üzere üretilmiştir)^9,10. Burada sunulan örnekleme protokolleri, birden fazla bireyden çoklu iskelet elemanlarında DNA korumasının ilk büyük ölçekli sistematik çalışmasında optimize edilmiştir¹¹. Tüm örnekler, Peißen, Saksonya-Anhalt, Almanya yakınlarındaki terk edilmiş ortaçağ yerleşimi Krakauer Berg'in kilise mezarlığından çıkarılan 11 kişiden elde edilen iskelet elemanlarından kaynaklanmıştır (ayrıntılı örnek demografisi için Tablo 1'e bakınız) ve bu nedenle, bu coğrafi/zamansal aralığın dışındaki örneklerle kullanım için modifikasyona ihtiyaç duyabilir.

Birey	Seks	Tahmini ölüm yaşı	14 adet C tarihleri (CE, Cal 2-sigma)
KRA001	Erkek	25-35	1058-1219
KRA002	Dişi	20-22	1227-1283
KRA003	Erkek	25	1059-1223
KRA004	Erkek	15	1284-1392
KRA005	Erkek	10-12	1170-1258
KRA006	Dişi	30-40	1218-1266
KRA007	Dişi	25-30	1167-1251
KRA008	Erkek	20	1301-1402
KRA009	Erkek	Bilinmeyen	1158-1254
KRA010 Serisi	Erkek	25	1276-1383
KRA011	Dişi	30-45	1040-1159

Tablo 1: Genetik olarak belirlenmiş cinsiyet, arkeolojik olarak belirlenmiş tahmini ölüm yaşı ve örneklenen ¹¹bireyin tümü için radyokarbon tarihlemesi (14 C Cal 2-sigma). Bu tablo Parker, C. et al. 2020^11'den uyarlanmıştır.

Bu protokoller, laboratuvar kaynaklı DNA kontaminasyonu ile beş iskelet elemanı (pars petrosa dahil) boyunca sekiz anatomik örnekleme yerinden nispeten basit ve verimli bir kemik tozu üretilmesine izin verir. Bu beş iskelet elemanından, dört iskelet elemanı üzerinde bulunan yedi anatomik örnekleme yerinin, petroz piramidin yıkıcı örneklemesine uygulanabilir alternatifler olduğu belirlenmiştir^11,12. Bunlar arasında kalıcı azı dişlerinin sementum, dentin ve kağıt hamuru odası; torasik vertebraların gövdesinden olduğu kadar superior vertebral çentikten toplanan kortikal kemik; apikal tutamın inferior yüzeyinden ve distal falanjların şaftından kaynaklanan kortikal kemik; ve tali'nin dış kısmı boyunca yoğun kortikal kemik. Pars petrosa 4,12,13,14, dentin ve diş pulpası odası ^1,2,15'in örneklenmesi için yaygın olarak uygulanan birkaç yöntem olsa da^, sementumdan başarılı bir şekilde kemik tozu üretimini tanımlayan yayınlanmış yöntemler ¹⁶ , vertebral gövde, inferior vertebral çentik ve talus elde etmek zor olabilir. Bu nedenle, burada petroz piramidi için optimize edilmiş örnekleme protokollerini gösteriyoruz (adım 3.1); yetişkin azı dişlerinin sementum (adım 3.2.1), dentin (adım 3.2.2) ve diş pulpası (adım 3.2.3); vertebral cismin kortikal kemiği (adım 3.3.1) ve üstün vertebral ark (adım 3.3.2); distal falanks (adım 3.4); ve bu iskelet elemanlarının hem aDNA hem de adli tıp araştırmaları için etkili bir şekilde kullanılmasını daha yaygın olarak erişilebilir kılmak için talus (adım 3.5).

Protokol

Burada sunulan tüm araştırmalar, Max Planck İnsanlık Tarihi Bilimi Enstitüsü, Jena, Almanya tarafından eski insan kalıntılarıyla çalışmak için belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolün herhangi bir adımını gerçekleştirmeden önce, hem bilimsel çalışma için izin almak hem de bölgenizdeki yıkıcı örnekleme için insan kalıntılarının kullanımı ile ilgili tüm yerel / eyalet / federal etik gerekliliklere uyduğunuzdan emin olun. Tüm prosedürler / kimyasal depolama, bireysel kurumsal güvenlik kurallarına göre yapılmalıdır.

1. Numune işlemeden önce dikkat edilmesi gereken noktalar

1. Eski kalıntılar tekrarlanamaz ve sonlu bir kaynak olduğu için numunelere dikkatle davranın (örneğin; örnekleme mümkün olduğunca az israf edici olmalı ve mümkünse tüm kalıntılar ilgili ve yasal sağlayıcılarına iade edilmelidir).
2. Tüm adımları temiz oda ortamında, tercihen özel bir antik DNA tesisinde gerçekleştirin^17,18,19. Kapüşonlu steril mikro gözenekli tulumlar, steril eldivenler (iki çift), cerrahi maske, koruyucu gözlükler ve steril botlar veya steril kapaklı kaymaz ayakkabılardan oluşan kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın (bkz. Eldivenleri, özellikle numuneler arasında sık sık değiştirin.
3. Tüm ekipmanı ve yüzeyleri ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV ışınlaması (dalga boyu: 254 nm) ile mümkün olduğunca iyice temizleyin ve dezenfekte edin (ör. matkap uçları, matkaplar, mengeneler/kelepçeler, vb.). Son olarak, temiz oda ortamı nedeniyle aşırı yorgunluğu önlemek için düzenli ergonomik molalar (mümkünse her 2-3 saatte bir) almanız şiddetle tavsiye edilir.
   NOT: Tüm iskelet kalıntıları örneklemeden önce uygun şekilde belgelenmelidir (örneğin, fotoğraflanmış, tartılmış ve mümkünse mikro-BT taramalı, 3D görüntülü, vb.) (uygun dokümantasyon protokolleri bu makalede ele alınmamıştır). Tüm örnekleme protokolleri örnekleme yinelemeleri arasında duraklatılabilir ve numuneler kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C), steril bir ortamda süresiz olarak saklanabilir.

2. Ön işlem

1. Kontaminasyon riskini en aza indirmek için kemik tozu oluşturmadan önce tüm anatomik numune alma yerlerini dekontamine edin¹⁸.
   NOT: Numune dekontaminasyonu için ağartıcının ve/veya yüzey gideriminin etkinliği (yüzey kaldırma adımları için adım 3.3.2'deki NOT'a bakınız) aDNA araştırmacıları arasında hala bir tartışma konusudur 8,19,20,21,22,23,24,25 çünkü her ikisi de genel DNA verimini^, özellikle de yüksek oranda bozulmuş numunelerde etkileyebilir. Bu nedenle, aşağıdaki adımlar isteğe bağlı olarak kabul edilir ve bu makalede sunulan temsili sonuçları oluşturmak için tüm örneklerde kullanıldığı için buraya dahil edilmiştir. Bu ön tedavi protokollerinin kullanımının, her bir numune setinin moleküler uygulamasına, yaşına, nadirliğine ve morfolojik bozunma seviyesine bağlı olarak duruma göre belirlenmesi önerilir.
   1. Tüm numune alımlarını, UV ışığı ile donatılmış polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) davlumbaz veya hava akışı kapalı biyogüvenlik kabini altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın.
   2. Folyoyu atmadan önce tüm kemik parçalarının geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her iskelet elemanının tedavisi arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın.
   3. Alanı tüy bırakmayan kuru steril bir mendille nazikçe silerek anatomik örnekleme yerlerinden mümkün olduğunca fazla gevşek kir/detritusu temizleyin (bkz. Mendilleri otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplara atın.
   4. Temizlenen yüzeyi, seyreltilmiş ticari ağartıcı ile nemlendirilmiş steril bir mendille silerek dekontamine edin (~% 0.01 v / v, ultra saf DNaz / RNaz içermeyen su ile seyreltilmiş) ve 5 dakika boyunca inkübe etmeye bırakın. Mendilleri otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplara atın.
      DİKKAT: Ağartıcı oldukça aşındırıcı ve reaktif bir kimyasaldır; bu nedenle kullanımdan önce uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır.
   5. Ultra saf DNase/RNase içermeyen suyla nemlendirilmiş steril bir mendil ile anatomik örnekleme yerinden mümkün olduğunca fazla artık ağartıcıyı temizleyin. Mendilleri otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplara atın.
   6. Temizlenmiş tüm anatomik numune alma yerlerini 30 dakika boyunca UV radyasyonuna maruz bırakın (dalga boyu: 254 nm) ve ardından oda sıcaklığında tamamen kurumaya bırakın. Sadece kemik tozu oluşumunu kolaylaştırmak için değil, aynı zamanda numunenin daha fazla bozulmasını önlemek için numuneye almadan veya depolamaya geri dönmeden önce anatomik numune alma yerlerinin tamamen kuru olduğundan emin olun (örneğin, küf).
      DİKKAT: UV radyasyonuna maruz kalmak gözlere zararlı olabilir.
   7. Hemen numune almaya geçin veya iskelet elemanlarını kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın.

3. Kemik tozu üretimi

NOT: Aşağıdaki protokoller, Dabney et al. 2019 protokol^26'yı takiben DNA ekstraksiyonunda kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

1. Örnekleme pars petrosa
   NOT: Bu protokol, Pinhasi et al. 2019'da açıklanan prosedürlerden uyarlanmıştır.⁴ ve kullanım kolaylığı için burada sunulmaktadır. Bu protokol, örnekleme için güncel, en az yıkıcı yöntemi temsil etmemektedir. pars petrosa. Bu nedenle, Sirak ve ark. 2017 tarafından açıklanan protokolün kullanılması önerilir.¹³ veya Orfanou ve ark. 2020¹⁴ morfolojik korumanın maksimum öneme sahip olduğu örnekler için.
   1. Tüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın.
   2. Folyoyu atmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/kabına atın.
   3. Kuru, dekontamine olmuş elemanı sterilize edilmiş bir kelepçe veya mengene kullanarak sabitleyin.
   4. Aşırı ısınmayı önlemek için pars petrosa'yı üstün sulkus petrosus boyunca ikiye bölün (bkz. Şekil 1), 0,6 mm'lik bir bıçakla donatılmış standart bir kuyumcu testeresi kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu) orta hızda (bkz. adım 3.1.6'nın altındaki NOT).
      DİKKAT: Pars petrosa çok yoğundur ve bu nedenle kesilmesi zor olabilir. Yaralanmayı önlemek için elemanı güvenli bir şekilde kelepçeli tutmaya özen gösterin. Kırık testere bıçaklarını uygun kesici uçların kabına atın.
   5. Petrus kısımlarını kelepçeden çıkarın. Gevşek / fazla malzemeyi kurtarın ve kaydedin.
   6. Tartım kağıdını steril bir tartım teknesine yerleştirin
   7. Petrus kısmını tartım kağıdının üzerinde tutun, tarafı tartım tepsisine doğru eğerek kesin. Küçük bir gösterge ucu ile donatılmış diş matkabını kullanarak yüz kanalı ile mastoid antrum arasındaki yoğun kortikal kemiğe delin (çevreleyen malzemeden daha parlak görünür, bkz. Şekil 1) ve kemik tozu üretmek için orta hıza, orta torka ayarlayın.
      NOT: Delme/Kesme, kemiğin aşırı ısınmasını ve potansiyel olarak DNA'yı tahrip etmeyi/zarar vermesini önlemek için düşük ila orta hızlarda kısa patlamalarla yapılmalıdır. Anekdotsal olarak, petrozun yoğun kısmı aşırı ısınmaya başladığında, pastırma pişirme pastırması olarak tanımlanan bir koku gözlenebilir. Delmeyi/testereyi derhal durdurun ve devam etmeden önce kemiğin yeterince soğuyana kadar dinlenmesini sağlayın.
   8. Tartım kağıdında yaklaşık 50-100 mg toz toplanana kadar sondaj işlemini tekrarlayın ve en az 0,01 mg'a kadar hassas kapalı bir terazi kullanılarak ölçülür (bkz.
      NOT: Mümkün olduğunda, her biri 50 mg'lık iki replika DNA ekstraksiyonuna izin vermek için 100 mg kemik tozu toplanması önerilir. Bununla birlikte, anatomik örnekleme yerlerinin kendilerinin sınırlandırılması (örneğin, distal falanks, diş pulpası odası) veya morfolojik koruma ihtiyacı nedeniyle bu her zaman mümkün olmayabilir. Sementum gibi diğer yerler için, 50 mg'dan daha az malzeme mevcut olabilir. Bununla birlikte, sementum, diş pulpası odası ve distal falanksın hepsinin, ekstraksiyon işleminden kemik tozunun daha düşük ilk girişine rağmen, önemli endojen DNA^11,27,28 verdiği gösterilmiştir.
   9. Tozu tartım kağıdından ekstraksiyon veya depolama için 2 mL etiketli, düşük ciltli, emniyetli kilitli bir tüpe aktarın. Numuneleri süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
   10. Kalan kemik/fazla tozu, iade/geri dönüş tamamlanana kadar kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın.
   11. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler, vb.) ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetini kullanarak sterilize edin/dekontamine edin.

Resim 1: Pars petrosa dahil temporal kemik. (A) Petrus piramidinin ve sulkus petrosasının yerlerini gösteren numune ön kesimi. (B) Delinecek yoğun alanları vurgulayan kesim sonrası Petrous kısmı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Kalıcı azı dişlerinin örneklenmesi
   NOT: Kalıcı azı dişlerinin örneklemesi için, önceden seçim yapın in situ kaynaşmış kökleri olan ve ideal olarak çürüklerden, emayedeki çatlaklardan veya en iyi sonuçlar için aşırı aşınmadan arındırılmış azı dişleri. Herhangi bir diş taşı örneklemesini çıkarın ve oral mikrobiyomun gelecekteki olası analizleri için -20 ° C'de saklayın (prosedür burada ele alınmamıştır).
   1. Sementumun örneklenmesi
      1. Tüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın.
      2. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın.
      3. Steril bir tartım tepsisine bir tartım kağıdı yerleştirin.
      4. Dekontamine olmuş azı dişini, ayarlanabilir anahtar gibi elde tutulan bir kelepçe kullanarak emaye ile bir tartım tepsisinin üzerinde tutun/sabitleyin (bkz.
      5. Bir diş matkabını elmas kenarlı dairesel bir kesme tekerleği ile donatın. Matkap orta hız/tork ayarına ayarlandığında, ucun kenarını yaklaşık -20°'lik bir açıyla köke hafifçe vurun.
      6. Sarı, en dıştaki malzemeyi kökten (çimento) çıkarmak / toplamak için tepsiye aşağı doğru kazıyın. Dentinin daha hafif (beyaz) materyali görünür hale geldiğinde toplamayı durdurun.
         NOT: Tozun aerosol haline gelmesini ve tepsiyi tamamen kaçırarak numuneyi potansiyel olarak boşa harcamasını önlemek için kesme ucunun toplama tepsisine göre dönme yönünü eşleştirmek önemlidir. Sementum özellikle DNA bakımından zengindir; Bununla birlikte, tipik malzeme verimleri diğer anatomik örnekleme yerlerinden (~ 7-20 mg) ^11,27,28'den çok daha küçüktür.
      7. Tartım kağıdında toplanan toz kütlesini, en az 0,01 mg'a kadar hassasiyete sahip kapalı bir terazi kullanarak kaydedin (bkz.
      8. Tozu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL'lik alçak bağlantılı, emniyetli bir kilit tüpüne aktarın. Süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
   2. Kağıt hamuru odasından numune alma
      1. Sementum toplandıktan sonra (istenirse), tacı çıkarmak için bir kuyumcu testeresi kullanarak azı dişini semento-emaye kavşağı boyunca kesitleyin (bkz. Şekil 2).
      2. Yeni bir tartım tepsisine yeni bir tartım kağıdı yerleştirin.
      3. Kurma kolu bölümünü, tartım tepsisinin üzerine elde taşınan bir kelepçe veya mengene ile sabitleyin. Kesme tarafını aşağı doğru eğilmiş tutun ve taç kısmı içindeki kağıt hamuru haznesinin kenarları boyunca küçük bir gösterge delme ucu (bkz. Malzeme Tablosu) ile donatılmış bir dental matkapla ilk geçiş olarak malzemeyi delin/kazıyın (bkz. Şekil 2).
         NOT: Pulpa odasının iç kısmının sadece ilk geçişi toplanmalı ve pulpa malzemesi olarak etiketlenmelidir (5-15 mg tipik verim), dişin derinliklerindeki herhangi bir şey dentin olarak kabul edilir.
      4. Dişi, alt kısmı aşağı bakacak şekilde çevirin, kelepçeye çekiçle dokunun ve tartım kağıdındaki serbest bırakılmış tozu toplayın.
      5. Tartım kağıdında toplanan tozun ağırlığını, en az 0,01 mg'a kadar hassasiyete sahip kapalı bir terazi kullanarak kaydedin (bkz.
      6. Tozu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL düşük ciltli, emniyetli kilitli bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
   3. Dentin örneklemesi
      1. Yeni bir tartım tepsisine yeni bir tartım kağıdı yerleştirin.
      2. Taç bölümünü tartım tepsisinin üzerinde tutun (3.2.2.3. adıma göre), daha fazla dentin örneklemesi için pulpa haznesinin iç kısmından 0,01 mg'a kadar hassas kapalı bir terazi kullanılarak ölçülen 50-100 mg dentini delin ve toplayın (bkz. Şekil 2).
      3. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL'lik düşük bağlantılı, güvenli kilitli bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
      4. Kalan diş parçalarını/fazla tozu, iade/geri dönüş tamamlanana kadar kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın.
      5. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Her numune alma işlemi arasında uygun olduğu şekilde ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetlerini kullanarak tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler vb.) sterilize edin/dekontamine edin.

Şekil 2: Kalıcı azı dişi ön örneklemesi . (A) Örneklemeden önce önceden işlenmiş azı dişi, taç, sementum (kökün sarımsı tabakası) ve semento-emaye kavşağındaki kesme bölgesini gösterir. (B) Semento-emaye kavşağındaki kesim bölgesini gösteren aynı azı dişi post-sementum koleksiyonu. (C) Diş pulpası odası ve taç içindeki dentin için anatomik örnekleme yerlerini gösteren molar kesim sonrası ve örnekleme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Torasik vertebra örneklemesi
   1. Vertebral cismin örneklenmesi
      1. Tüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın.
      2. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın.
      3. Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin.
      4. Omurları, omur gövdesi dışa doğru olacak şekilde bir kelepçe veya el mengene ile sabitleyin.
      5. Omurları, omur gövdesi aşağı doğru eğilmiş olarak tartım tepsisinin üzerinde tutun. Düşük hızlı yüksek torka ayarlanmış küçük bir gösterge delme ucu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile donatılmış bir dental matkap kullanarak, vertebral gövdenin cancellous iç dokusunu çevreleyen kortikal kemiğin en dış kenarı (alt ve üstün) boyunca delin (bkz. Şekil 3).
      6. 0,01 mg'a kadar hassas bir kapalı terazi kullanılarak ölçülen 50-100 mg malzeme toplanana kadar biti standart bir ağırlık tepsisi üzerinde kortikal tabakaya karşı kazıyın (bkz.
      7. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL'lik düşük bağlantılı, güvenli bir kilit tüpüne aktarın. Süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
   2. Superior vertebral arkın örneklenmesi
      NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Üstün vertebral kemerin kortikal kemiğinin en dış tabakasını, yüzey¹⁹ boyunca kazıyarak küçük bir delme ucu ile donatılmış bir diş matkabı kullanarak çıkarın ve atın (bkz. Bu, vertebral gövdeden örnekleme için önerilmez, çünkü kortikal kemik tabakası genellikle çok incedir ve bu işlemle tamamen tükenmesi muhtemeldir (bkz. bölüm 2'deki NOT).
      1. Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin.
      2. Omurları, vertebral süreç dışa doğru, üstün yönü aşağı doğru olan bir el kelepçesi / mengene ile sabitleyin.
      3. Omurları tutarken, üstün yönü aşağıda, bir tartım tepsisi üzerinde, dikenli işlemin lameller ile füzyonu ile oluşturulan V şeklindeki çentiğin ortasına doğru yukarı doğru delin (bkz. Şekil 3), düşük hıza ve yüksek torka ayarlanmış küçük bir gösterge ucuna sahip bir diş matkabı kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu).
      4. Dirençte gözle görülür bir düşüş olduğunda sondajı durdurun. Delme pozisyonunu hafifçe değiştirin ve 0,01 mg'a kadar hassas bir kapalı terazi kullanılarak ölçüldüğü gibi 50-100 mg kemik tozu toplanana kadar tekrarlayın (bkz.
      5. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL'lik düşük bağlanmalı bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
      6. Kalan kemik/fazla tozu kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda iade/geri dönüşe kadar saklayın.
      7. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Her bir numune alma arasında ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetini kullanarak tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler vb.) sterilize edin/dekontamine edin.

Şekil 3: Torasik omurların vertebral gövdesi ve superior vertebral arch kortikal kemik anatomik örnekleme yerleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Distal falanks örneklemesi
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Şaftın ve/veya apikal tutamın kortikal kemiğinin en dış tabakasını, yüzey¹⁹ boyunca kazıyarak küçük bir mastar delme ucu ile donatılmış bir diş matkabı kullanarak çıkarın ve atın. Bu, aşırı ince kortikal kemik veya çocuk kalıntıları olan numuneler için mümkün olmayabilir (bkz. bölüm 2'deki NOT).
   1. Tüm numune alımlarını özel bir temiz odada, UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (UV dalga boyu: 254 nm) altında, hava akışı kapalıyken gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın.
   2. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın.
   3. Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin.
   4. Numuneyi el tipi kelepçe/mengene ile sabitleyin, üst tarafı yukarı doğru.
   5. Numuneyi tartım tepsisinin üzerinde tutun, küçük bir gösterge delme ucuyla donatılmış bir diş matkabı kullanarak en dıştaki yoğun katmanları delerek (bkz. Şekil 4) apikal kemiğin alt tarafındaki kortikal kemikten kemik tozu toplayın (bkz. Malzeme Tablosu).
   6. Dirençte belirgin bir azalma olduğunda sondajı durdurun, çünkü bu daha hafif, iptal edici malzeme anlamına gelir. İlk sondajdan dışarıya doğru yayılan bu işlemi tekrarlayın, en az 50-100 mg kemik tozu toplanana kadar, 0,01 mg'a kadar doğru kapalı bir terazi kullanılarak ölçüldüğü gibi (bkz.
   7. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL'lik düşük bağlantılı, güvenli kilitli bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
   8. Kalan kemik/fazla tozu kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda, geri dönüşe/geri dönüşe kadar saklayın.
   9. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Her bir numune alma arasında uygun olduğu şekilde ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV ışınlarına maruz kalma özelliklerini kullanarak tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler vb.) sterilize edin/dekontamine edin.
      NOT: Daha küçük numuneler için (örneğin, genç numuneler), numune için önerilen 50-100 mg kortikal kemikten çok daha az olabilir. Bununla birlikte, düşük miktarlarda bile, bu anatomik örnekleme yerinin DNA¹¹ açısından özellikle zengin olduğu gösterilmiştir.

Şekil 4: Yoğun kortikal kemiğin şaft boyunca ve apikal tutamın inferior tarafındaki yerlerini gösteren distal falanks. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. Talus'un örneklenmesi
   1. Tüm numune alımlarını, hava akımı kapalıyken UV ışığı ile donatılmış bir PCR başlığı veya biyogüvenlik kabini (dalga boyu: 254 nm) altında özel bir temiz odada gerçekleştirin. Herhangi bir başıboş kemik tozunu / parçasını yakalamak için steril alüminyum folyoyu tezgahın üzerine yayın.
   2. Folyo atılmadan önce tüm kemik parçalarının ve mümkün olduğunca fazla tozun geri kazanıldığından emin olun (geri dönüş için). Her örnekleme arasındaki folyoyu değiştirin. Kullanılmış folyoyu otoklavlanabilir bir biyolojik tehlike torbasına/haznesine atın.
   3. Standart tartım tepsisine küçük bir tartım kağıdı yerleştirin.
   4. Numuneyi el tipi kelepçe/mengene ile sabitleyin, kubbe yukarı doğru yerleştirin.
   5. Talus'u, kubbeyi yukarı ve medial yüzeyi toplayıcıya doğru, tartım tepsisinin üzerinde tutun. Düşük hız ve yüksek torka ayarlanmış düşük gösterge ucuna sahip bir diş matkabı kullanarak kortikal kemiği talusun boynundan ~1 mm derinliğe kadar kazıyın (bkz. Şekil 5).
   6. Delme pozisyonunu hafifçe değiştirin ve 0,01 mg'a kadar doğru kapalı bir terazi kullanılarak ölçüldüğü gibi yaklaşık 50-100 mg kemik tozu toplanana kadar tekrarlayın (bkz.
   7. Kemik tozunu tartım kağıdından ekstraksiyon için 2 mL'lik düşük bağlanmalı bir tüpe aktarın. Süresiz olarak -20 °C'de saklayın.
   8. Kalan kemik/fazla tozu, iade/geri dönüş tamamlanana kadar kuru, sıcaklık kontrollü (25 °C) steril bir ortamda saklayın.
   9. Tüm atıkları otoklavlanabilir biyolojik tehlike torbalarına veya kaplarına atın. Tüm yeniden kullanılabilir ekipmanları (ör. kelepçeler, matkap uçları, matkaplar, testereler, vb.) ağartıcı/DNA dekontaminasyon çözeltisi/etanol ve UV (dalga boyu: 254 nm) maruziyetini kullanarak sterilize edin/dekontamine edin.

Şekil 5: Kortikal kemik geri kazanımı için talusun örnekleme alanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Talus çok az kortikal kemiğe sahiptir (ince bir dış tabaka). Malzeme sadece yüzeyden değil, aynı zamanda altta yatan yoğun cancellous kemik tabakasından da toplanmalıdır.

Sonuçlar

Ayrı bir çalışmada 11, DNA, kalsifiye doku^2'den kısa fragmanlar için optimize edilmiş standart bir DNA ekstraksiyon protokolü kullanılarak,¹¹ bireyde her anatomik örnekleme yerinden üretilen kemik tozundan ekstrakte edildi. Tek sarmallı kütüphaneler daha sonra²⁸ adet üretildi ve bir HiSeq 4000 (75 bp çift uçlu) üzerinde örnek başına ~ 20.000.000 okuma derinliğine kadar sıralandı. Elde edilen dizi verileri daha sonra EAGER boru hattı²⁹ kullanılarak endojen insan DNA içeriği için değerlendirildi (BWA ayarları: 32 tohum uzunluğu, 0.1 uyumsuzluk cezası, 37 eşleme kalitesi filtresi). Tüm temsili sonuçlar, tutarlılık için Parker et al. 2020¹¹ ile aynı metrikler kullanılarak raporlanır. Pars petrosa'nın toz haline getirilmiş kısımlarından elde edilen kütüphaneler, ortalama olarak, incelenen diğer 23 anatomik örnekleme yerinin herhangi birinden daha yüksek endojen DNA vermiştir (Şekil 6A-B). Bu protokolde sunulan yedi ek anatomik örnekleme yeri (sementum, diş pulpası odasının ilk geçişi ve kalıcı azı dişlerinin dentini; vertebral gövdeden kortikal kemik ve torasik omurların üstün vertebral kemeri; distal falanksın apikal tutamından kortikal kemik; ve talusun boynundan kortikal kemik) bir sonraki en yüksek verimi üretti (bu anatomik örnekleme yerleri arasında istatistiksel bir anlam olmadan; Şekil 6A-B; Ek Dosya 1: Endojen DNAPreCap). Bu alternatif konumların tümü, mitokondriyal analizler ve tek nükleotid polimorfizmi (SNP) analizleri gibi standart popülasyon genetiği analizleri için tutarlı bir şekilde üretilen DNA'yı yeterli hale getirmektedir. Tüm anatomik örnekleme konumlarından kaynaklanan kütüphanelerdeki çoğaltma oranları düşüktü (küme faktörleri ortalama 1.2'<, tüm haritalama okumalarının benzersiz haritalama okumalarına oranı olarak hesaplanmıştır, Tablo 2; Ek Dosya 1: ClusterFactor), taranan tüm kitaplıkların çok yüksek karmaşıklığa sahip olduğunu gösterir. Benzer şekilde, ortalama eksojen insan DNA kontaminasyon tahminleri düşüktü, üstün vertebral ark hariç tüm anatomik örnekleme yerlerinde ortalama% 2 <(ANGSD³⁰ boru hattı tarafından bildirildiği gibi erkeklerde X kromozom kontaminasyonu, n = 7) (ortalama tahmini kontaminasyon: % 2.11, bir örnek aykırı değer olarak çıkarıldı; KRA005: %19,52, bkz. Tablo 2; Ek Dosya 1: Xcontamination). Ortalama parça uzunluğu (30 bp'< tüm okumaları çıkarmak için filtrelemeden sonra), diş pulpası odasından ve dentinden toplanan materyalde en düşüktü ve diğer anatomik örnekleme yerleri arasında anlamlı bir değişiklik olmadı (sırasıyla 55.14 bp ve 60.22 bp, ortalama medyan 62.87, çift yönlü p değerleri < 0.019, Tablo 2; Ek Dosya 1: AvgFragLength). Ek olarak, dişler ve torasik omurların her biri, yüksek endojen DNA iyileşmesinin gözlendiği çoklu anatomik örnekleme yerleri içerir ve bu da onları pars petrosa'ya alternatif olarak özellikle uygun hale getirir.

Şekil 6: Taranan tüm örnekler için insan DNA içeriği. Siyah çizgiler genel ortalamayı temsil ederken, kırmızı çizgiler medyanı temsil eder (katı: insan DNA oranı, kesikli: üretilen milyon okuma başına eşlenmiş insan okumaları). Ortalama insan DNA oranı genel ortalamadan (%8.16) daha yüksek olan bireysel anatomik örnekleme yerleri tüm analizlerde renklendirilmiştir. (A) Okumaların hg19 referans genomuna eşlenmesinin oranı. Mavi kesikli çizgi, boru hattının haritalama parametreleri göz önüne alındığında teorik maksimumu temsil eder (simüle edilmiş hasarla^hg19 referans genomundan 5.000.000 okumanın rastgele dağılımını simüle etmek için Gargammel 31 kullanılarak oluşturulur). Bireysel ortalamalar (siyah X) ve medyanlar (kırmızı daire), genel ortalamadan daha yüksek bir ortalama insan DNA oranına sahip örnekler için bildirilmiştir. Güven aralıkları, istatistiksel aykırı değerler hariç üst ve alt sınırları gösterir. (B) Dizileme çabasının milyon okuması başına hg19 referans genomuna eşlenen benzersiz okuma sayısı (75 bp eşleştirilmiş uç). Güven aralıkları, istatistiksel aykırı değerler hariç üst ve alt sınırları gösterir. Bu rakam Parker, C. et al. 2020^11'den uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Tüm anatomik örnekleme yerleri için ortalama çoğaltma seviyeleri (haritalama okumaları/benzersiz okumalar), ortalama ve medyan fragman uzunlukları ve X kromozomu kontaminasyon tahminleri. Ortalamanın standart hatası olarak bildirilen hata. Bu tablo Parker, C. et al. 2020^11'den uyarlanmıştır.

Örnekleme konumu	Ortalama çoğaltma faktörü (# eşlenmiş okumalar /# benzersiz eşlenmiş okumalar)	Bp cinsinden ortalama parça uzunluğu	X kromozomu kontaminasyonunun ortalama tahmini oranı
Petrus piramidi	1.188 ± 0.006	65,40 ± 1,36	0.000 ± 0.003
Cementum	1.197 ± 0.028	67,28 ± 1,76	0.011 ± 0.003
Dentin	1.188 ± 0.061	60,22 ± 2,37	0.002 ± 0.007
Hamuru	1.179 ± 0.024	55,14 ± 2,90	0.013 ± 0.006
Distal falanks	1.191 ± 0.049	65,95 ± 1,08	0.013 ± 0.005
Vertebral gövde	1.194 ± 0.037	66,14 ± 1,03	0.008 ± 0.003
Üstün vertebral ark	1.19 ± 0.017	63,02 ± 1,23	0,021 ± 0,009*
Aşık kemiği	1.198 ± 0.010	68,20 ± 1,24	0.011 ± 0.003
*Örnek KRA005, 0.1952'de aykırı değer olarak kaldırıldı

Kod kullanılabilirliği
Bu makalenin analizinde kullanılan tüm analiz programları ve R modülleri, ilgili yazarlarından ücretsiz olarak temin edilebilir. Tüm özel R kodları istek üzerine kullanılabilir.

Veri kullanılabilirliği
Temsili sonuçların hesaplanmasında kullanılan tüm ham veriler, Avrupa Nükleotid Arşivi ENA veri havuzunda (katılım numarası PRJ-EB36983) veya Parker, C. ve ^ark.11'in ek materyallerinde serbestçe kullanılabilir.

Ek Dosya 1. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Eski insan popülasyonu genetiğindeki mevcut uygulama, mümkün olduğunda tercihen pars petrosa'dan (adım 2.1) örnekleme yapmaktır. Bununla birlikte, pars petrosa, sayısız iskelet değerlendirmesi (örneğin, popülasyon öyküsü^{32, ölümde} fetal yaşın tahmini 33 ve cinsiyet belirleme³⁴) için oldukça değerli olduğu için elde edilmesi zor bir örnek olabilir ve tarihsel olarak, DNA analizi için pars petrosa'nın örneklemesi oldukça yıkıcı olabilir ^3,4 (burada sunulan protokol dahil^, her ne kadar yeni, minimal invaziv protokoller^13,14 bu endişeyi hafifletmek için yaygın olarak benimsenmiş olsa da). Bu, çok yakın zamana kadar, iskelet boyunca insan DNA'sı geri kazanımının büyük ölçekli, sistematik bir çalışmasının denenmemiş olması gerçeğiyle birleşiyor¹¹, petroz piramidi mevcut olmadığında uygun bir örnekleme stratejisi bulmayı zorlaştırıyor.

Burada sunulan protokoller, pars petrosa ve dört ek iskelet elemanı boyunca yedi alternatif anatomik örnekleme yeri de dahil olmak üzere arkeolojik/adli iskelet kalıntılarından DNA örneklemesi için bir dizi optimize edilmiş prosedür sağlayarak bu zorluğun hafifletilmesine yardımcı olmaktadır. Dahil edilen kritik adımların tümü, verimsiz örnekleme (adım 2.1.6 ve 3.2.1.3) veya sondaj/kesim sırasında numunelerin aşırı ısınması (adım 3.1.6) nedeniyle DNA kaybı / hasarı olasılığını en aza indirmeyi amaçlamaktadır. Ek olarak, protokol boyunca, yüksek oranda bozulmuş numunelerde en iyi performansı sağlamak için ön işlem adımlarını değiştirmenin / atlamanın gerekli olabileceği belirtilmiştir. Ayrıca, burada sunulan seçilmiş elementler arasında bile, birkaç olası alternatif örnekleme tekniğinin (özellikle pars petrosa^13,14 için) yanı sıra, burada sunulan az sömürülen anatomik örnekleme yerlerinin (yani^, talus: adım 2.5 ve omurlar: adım 2.3) daha fazla optimizasyonu için yeterli alanın kaldığı da belirtilmelidir.

Bu protokollerin, endojen insan DNA analizleri amacıyla yüksek kalitede (iyi morfolojik koruma) eski genç-yetişkin kalıntıları kullanılarak tasarlandığını ve test edildiğini akılda tutmak da önemlidir. Sunulan sonuçlar, daha yüksek oranda bozulmuş materyallere, diğer koruma bağlamlarına, bebek kalıntılarına, insan dışı kalıntılara veya patojenler veya mikrobiyom çalışmalarına uzanmayabilir, çünkü bu protokollerin ek bağlamlarda kullanımına yönelik daha büyük bir araştırmaya ihtiyaç vardır. Ek olarak, burada sunulan alternatif iskelet elemanları (dişler, omurlar, distal falanks ve tali), karışık kalıntılar arasında tek bir bireye atanması zor olabilir, bu da tek bir kökeni sağlamak için birden fazla elementten örnekleme yapılmasını gerektirir. Bu sınırlamalara rağmen, bu protokollerin yaygın olarak kullanılabilir hale getirilmesi, insan kalıntıları üzerinde gelecekteki aDNA / adli çalışmalarda kullanılmak üzere genelleştirilmiş ve nicel olarak optimize edilmiş bir çerçeve sağlayarak numune seçimi ve işlenmesini çevreleyen heterojenliğin bir kısmını hafifletmeye yardımcı olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#16 Dental Drill Bit	NTI	H1-016-HP	example drilling bit
0.6 mm scroll saw blade	Fisher Scientific	50-949-097	blade for Jewellers Saw
22mm diamond cutting wheel	Kahla	SKU 806 104 358 514 220	Dremel cutting attachment
Commercial Bleach	Fisher Scientific	NC1818018
Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil	Fisher Scientific	15-078-29X
DNA LoBind Tubes (2 mL)	Eppendorf	22431048
Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment	Dremel	225-01	Dremel flexible extension
Dremel 4300 Rotary Tool	Dremel	4300	Example drill
Dremel collet and nut kit	Dremel	4485	Adapters for various Dremel tool attachments/bits
Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag	Fisher Scientific	17-988-501
Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube	Fisher Scientific	13-698-792
Ethanol (Molecular Biology Grade)	Millipore Sigma	1.08543
FDA approved level 2 Surgical Mask	Fisher Scientific	50-206-0397	PPE
Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves	Fisher Scientific	19-041-171X	PPE
Fisherbrand Safety Glasses	Fisher Scientific	19-130-208X	PPE
Granger Stationary Vise	Fisher Scientific	NC1336173	benchtop vise
Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water	Fisher Scientific	10-977-023
Jewellers Saw	Fisher Scientific	50-949-231
Kimwipes	Sigma-Aldritch	Z188956
Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet	Fisher Scientific	30-368-1101
LookOut DNA Erase	Millipore Sigma	L9042-1L
Medium weighing boat	Heathrow Scientific	HS120223
MSC 10pc plier/clamp set	Fisher Scientific	50-129-5352	Miscellaneous clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting
Sartorius Quintix Semi-Micro Balance	Fisher Scientific	14-560-019	enclosed balance
Tyvek coveralls with hood	Fisher Scientific	01-361-7X	PPE
Weigh paper	Heathrow Scientific	HS120116