Murin Arka Ekstremite Kangren Modelinde Footpad Vaskülatürünün Yüksek Çözünürlüklü Üç Boyutlu Görüntülenmesi

Özet

Bu protokol, FVB farelerde arka bacak kangrenini indüklemek için femoral arter ve ven elektrokoagülasyonunu nitrik oksit sentaz inhibitörü uygulamasıyla birleştiren benzersiz, klinik olarak ilgili bir periferik arter hastalığı modelini tanımlamaktadır. İntrakardiyak DiI perfüzyonu daha sonra ayak yastığı vaskülatürünün yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu görüntülenmesi için kullanılır.

Özet

Periferik arter hastalığı (PAH), aterosklerotik risk faktörlerine kronik maruziyet sonucu ortaya çıkan önemli bir morbidite nedenidir. En şiddetli formu olan kronik uzuvları tehdit eden iskemiden (CLTI) muzdarip hastalar, kronik ağrı, ağrısız sınırlı yürüme mesafesi ve iyileşmeyen yaralar dahil olmak üzere günlük yaşamda önemli bozukluklarla karşı karşıyadır. PAD'i incelemek için çeşitli hayvanlarda preklinik modeller geliştirilmiştir, ancak fare arka bacak iskemisi en yaygın kullanılanı olmaya devam etmektedir. Bu modellerde iskemik hakarete cevaben, kullanılan fare suşuna ve arteriyel bozulmanın yerine, sayısına ve araçlarına bağlı olarak önemli farklılıklar olabilir. Bu protokol, CLTI'nin doku kaybına benzeyen Friend Virus B (FVB) farelerinde ayak tabanı kangrenini güvenilir bir şekilde indüklemek için femoral arter ve ven elektrokoagülasyonunu nitrik oksit sentaz (NOS) inhibitörü uygulamasıyla birleştiren benzersiz bir yöntemi açıklamaktadır. Lazer Doppler perfüzyon görüntüleme (LDPI) gibi geleneksel reperfüzyon değerlendirme yöntemleri hala önerilmekle birlikte, vaskülatürü etiketlemek için lipofilik boya 1,1'-dioktadesil-3,3,3',3'-tetrametilindokarbosiyanin perkloratın (DiI) intrakardiyak perfüzyonu kullanılmaktadır. Daha sonraki tam montajlı konfokal lazer tarama mikroskopisi, arka bacak iskemi modellerinde reperfüzyonu değerlendirmenin geleneksel yollarını tamamlayan ayak yastığı vasküler ağlarının yüksek çözünürlüklü, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonuna izin verir.

Giriş

Ateroskleroz nedeniyle ekstremitelere kan akışının azalması ile karakterize periferik arter hastalığı (PAD), Amerika Birleşik Devletleri'nde 6,5 milyon kişiyi ve dünya çapında 200 milyon insanı etkilemektedir1. PAD'li hastalar uzuv fonksiyonlarında ve yaşam kalitesinde azalma yaşarken, PAD'in en şiddetli formu olan CLTI'lı hastalar, 5 yıllık mortalite oranı %50'ye yaklaşarak amputasyon ve ölüm riski ^{altındadır2}. Klinik pratikte, ayak bileği-brakiyal indeksleri (ABI) <0.9 olan hastalarda PAD, ABI <0.4 olanlarda ise dinlenme ağrısı veya doku kaybı ile ilişkili ^CLTI3 olarak kabul edilir. Semptomlar benzer ABI'li hastalar arasında günlük aktiviteye, iskemiye karşı kas toleransına, anatomik varyasyonlara ve kollateral gelişimdeki farklılıklara bağlı olarak ^değişir4. Basamak ve ekstremite kangreni, CLTI ile sonuçlanan tüm vasküler tıkayıcı hastalıkların en şiddetli belirtisidir. Yumuşak dokuları mumyalayan bir kuru nekroz şeklidir. Aterosklerotik PAH'a ek olarak, diyabetli hastalarda, Buerger hastalığı ve Raynaud fenomeni gibi vaskülitlerde veya son dönem böbrek hastalığı ortamında kalsifilaksi hastalarında da ^{gözlenebilir5,6}.

PAD/CLTI'nın patogenezini incelemek ve potansiyel tedavilerin etkinliğini test etmek için çeşitli preklinik modeller geliştirilmiştir ve bunlardan en yaygın olanı fare arka bacak iskemisi olmaya devam etmektedir. Farelerde arka bacak iskemisinin indüklenmesi tipik olarak iliak veya femoral arterlerden kan akışının engellenmesiyle, sütür ligasyonu, elektrokoagülasyon veya istenen damarı daraltmanın diğer yollarıyla ^{gerçekleştirilir7}. Bu teknikler arka bacağa perfüzyonu büyük ölçüde azaltır ve uyluk ve baldır kaslarında neovaskülarizasyonu uyarır. Bununla birlikte, kısmen kollateral dağılımdaki anatomik farklılıklar nedeniyle iskemik hakarete duyarlılıkta murin suşuna bağlı temel farklılıklar ^vardır8,9. Örneğin, C57BL / 6 fareleri, arka bacak iskemisine nispeten dirençlidir, uzuv fonksiyonunun azaldığını gösterir, ancak genellikle ayak tabanında kangren kanıtı yoktur. Öte yandan, BALB / c fareleri, iskemiden kurtulmak için doğal olarak zayıf bir kapasiteye sahiptir ve tipik olarak tek başına femoral arter ligasyonunu takiben ayağın veya alt bacağın otomatik amputasyonunu geliştirir. İskemiye verilen bu şiddetli yanıt terapötik pencereyi daraltır ve ekstremite reperfüzyonu ve fonksiyonunun uzunlamasına değerlendirilmesini engelleyebilir. İlginçtir ki, murin kromozomu 7 üzerinde bulunan tek bir kantitatif özellik lokusundaki genetik farklılıklar, C57BL/6 ve BALB/c farelerinin doku nekrozuna ve ekstremite reperfüzyonuna karşı bu diferansiyel duyarlılıklarında rol ^{oynamıştır10}.

C57BL / 6 ve BALB / c suşları ile karşılaştırıldığında, FVB fareleri tek başına femoral arter ligasyonuna orta fakat tutarsız bir yanıt göstermektedir. Bazı hayvanlarda siyah iskemik tırnaklar veya mumyalanmış rakamlar şeklinde ayak tabanı kangreni gelişirken, diğerleri herhangi bir açık iskemi belirtisi ^yoktur11. Bir nitrik oksit sentaz (NOS) inhibitörü olan Nω-Nitro-L-arginin metil ester hidroklorürün (L-NAME)¹² eşzamanlı uygulanması, telafi edici vazodilatatör mekanizmaları önler ve arka bacak dokusunda oksidatif stresi daha da arttırır. Femoral arter ligasyonu veya pıhtılaşma ile kombinasyon halinde, bu yaklaşım sürekli olarak FVB farelerde CLTI'nın atrofik değişikliklerine benzeyen ancak nadiren uzuv oto-amputasyonuna ilerleyen ayak yastığı doku kaybına neden ^olur11. Oksidatif stres, PAD/CLTI'nin ayırt edici özelliklerinden biridir ve endotel disfonksiyonu ve nitrik oksidin (NO)^13,14 biyoyararlanımının azalması ile yayılır. NO, genellikle arteriyel ve kılcal kan akışı, trombosit yapışması ve agregasyonu ve lökosit alımı ve aktivasyonu üzerinde yararlı etkiler gösteren pluripotent bir ^{moleküldür13}. Azalmış NOS seviyelerinin, oksidatif stresi indükleyen ve aterosklerozun ilerlemesini hızlandıran anjiyotensin dönüştürücü enzimi aktive ettiği de ^{gösterilmiştir15}.

Bir arka bacak iskemisi modeli oluşturulduktan sonra, sonraki ekstremite reperfüzyonunun izlenmesi ve herhangi bir potansiyel tedavinin terapötik etkisinin de izlenmesi gerekir. Önerilen murin kangren modelinde, doku kaybının derecesi ilk önce ayağın brüt görünümünü değerlendirmek için Faber skoru kullanılarak ölçülebilir (0: normal, 1-5: skorun etkilenen tırnak sayısını temsil ettiği tırnak kaybı, 6-10: skorun etkilenen basamak sayısını temsil ettiği basamakların atrofisi, 11-12: kısmi ve tam ayak atrofisi, sırasıyla)⁹. Arka bacak perfüzyonunun kantitatif ölçümleri daha sonra tipik olarak, ilgilenilen bir bölgede (ROI) piksel düzeyinde perfüzyonu belirtmek için lazer ışığı ve kırmızı kan hücreleri arasındaki Doppler etkileşimlerine dayanan LDPI kullanılarak ^yapılır16. Bu teknik kantitatif, invaziv olmayan ve tekrarlanan ölçümler için ideal olsa da, arka bacak vaskülatürünün granüler anatomik detayını ^sağlamaz16. Mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), manyetik rezonans anjiyografi (MRA) ve X-ışını mikroanjiyografisi gibi diğer görüntüleme yöntemleri ya maliyetli, sofistike enstrümantasyon gerektiren ya da teknik olarak zorlayıcı olduğu ^{kanıtlanmıştır16}. 2008 yılında, Li ve ark. retinadaki kan damarlarını lipofilik karbosiyanin boyası ^DiI17 ile etiketlemek için bir teknik tanımladılar. DiI, endotel hücrelerine dahil olur ve doğrudan difüzyon yoluyla, anjiyojenik filizler ve psödopodal süreçler gibi vasküler membran yapılarını ^boyar17,18. Endotel hücrelerine doğrudan verilmesi ve boyanın yüksek floresan doğası nedeniyle, bu prosedür kan damarlarının yoğun ve uzun süreli etiketlenmesini sağlar. 2012 yılında Boden ve ark., femoral arter ligasyonunu takiben hasat edilen uyluk adduktör kaslarının tam montajlı görüntülenmesi yoluyla DiI perfüzyon tekniğini murin arka bacak iskemi modeline uyarlamışlardır19.

Mevcut yöntem, arka bacak iskemisi ve gen veya hücre bazlı terapötiklere yanıt olarak neovaskülarizasyonu değerlendirmek için nispeten ucuz ve teknik olarak uygulanabilir bir yol sunmaktadır. Başka bir uyarlamada, bu protokol, ayak yastığı vaskülatürünü yüksek çözünürlükte ve 3D'de arka bacak kangreninin bir murin modelinde görüntülemek için DiI perfüzyonunun uygulanmasını açıklar.

Protokol

Protokolde açıklanan tüm hayvan deneyleri, Miami Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Çalışma için 8-12 haftalık hem erkek hem de dişi FVB fareleri kullanıldı.

1. L-NAME çözeltisinin hazırlanması

1. Laminer bir davlumbazda steril koşullar altında, 50 mg/mL'lik bir çözelti oluşturmak için 1 g L-NAME tozunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 20 mL steril suyla çözerek bir L-NAME stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini -20 °C'de 300-500 μL alikotlarda 3 aya kadar saklayın.
2. Çalışan bir L-NAME çözeltisi yapmak için, L-NAME stok çözeltisinin bir alikotunu çözün ve son 10 mg / mL konsantrasyonunu elde etmek için steril koşullar altında PBS (1: 4) ile seyreltin.
3. PBS (pH 7.4) hazırlamak için, 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 ve 0.23 g NaH2PO4'ü 800 mL damıtılmış suda çözün. Toplam 1.000 mL hacme su ekleyin ve 0,22 μm şişe üstü filtreden süzün.
   NOT: 4 μL/g L-NAME çalışma solüsyonunun intraperitoneal (IP) enjeksiyonu, istenen 40 mg/kg L-NAME dozuna eşdeğerdir. L-NAME çalışma çözeltisi kullanım sırasında buz üzerinde tutulmalı ve taze çözülmüş stok çözeltisi alikotları kullanılarak günlük olarak yeni seyreltmeler yapılmalıdır.

2. Arka bacak kangreninin kimyasal ve cerrahi indüksiyonu

1. 8-12 haftalık FVB farelerini bir yetiştiriciden veya tesis içinde yetiştirilmiş olarak elde edin (bkz. Ameliyattan 2 saat önce, 40 mg / kg IP dozunda L-NAME uygulayın.
2. PBS'de seyreltilmiş 100 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg ksilazin IP enjeksiyonu ile fareleri anestezi altına alın. Ayak parmağını sıkıştırma refleksinin yokluğunda yeterli sedasyonu onaylayın ve işlem sırasında solunum hızını izlemeye devam edin.
   1. Saçları iki taraflı arka bacaklardan ve kasıklardan makas ve / veya tüy dökücü krem kullanarak çıkarın. Hayvanı cerrahi mikroskop altında yerleştirin; ekstremiteleri yerinde uzatın ve bantlayın. Povidon-iyot çözeltisini cerrahi bölgeye çevresel olarak uygulayarak cerrahi alanı sterilize edin.
3. 10-20x büyütme altında, kasık kıvrımı boyunca kasık bağından hemen daha düşük bir kesi yapmak için makas veya neşter kullanın. Kasık yağ yastığını inguinal ligamentten lateral olarak açıkça diseke etmek ve altta yatan femoral kılıfı ortaya çıkarmak için ince forseps ve steril pamuk ucu aplikatörü kullanın, böylece femoral arter, ven ve sinir açıkça tanımlanır (Şekil 1).
4. İnce forseps kullanarak, femur kılıfını delin. Femoral siniri femoral arterden dikkatlice fırçalayın. Femoral arterin (LCFA) lateral circumflex dalının femoral sinirin derinliklerine doğru kalkışını tanımlayın (Şekil 1).
   1. Koteri cihazını aktive ederek (bakınız Malzeme Tablosu) ve damarları yan yana hareketle hafifçe temas ettirerek femoral arterin ve venin LCFA'ya sadece proksimal elektrokoagülasyonuna devam edin, böylece femoral sinirin iyi izole edilmesini ve termal yaralanmalardan korunmasını sağlayın. Pıhtılaşmış damar segmentini makasla bölün.
5. Kasık yağ yastığını medial olarak harekete geçirerek distal femoral arter ve venin maruziyetine devam edin. Yüzeyel epigastrik arteri ve safenopopliteal bileşkeyi daha distal olarak tanımlayın.
   1. Bu iki yer arasındaki femoral kılıfı delin ve femoral siniri femoral damarlardan dikkatlice ayırın. Adım 2.4.1'de açıklandığı gibi femoral arter ve venin pıhtılaşması ve transeksiyonu ile devam edin.
6. Steril PBS ile doldurulmuş bir şırınga kullanarak cerrahi alanı sulayın. Herhangi bir kanama bölgesine 3-5 dakika boyunca pamuk ucu aplikatörü ile hafif basınç uygulayarak hemostaz elde edin.
   1. Kesinin kapatılmasına basit ve sürekli bir şekilde emilebilir 5-0 dikiş kullanarak devam edin. Postoperatif ağrı kesici için 1 mg / kg deri altı dozunda sürekli salınan buprenorfin uygulayın (bakınız Malzeme Tablosu).
7. LDPI ile bağlı arka bacakta footpad perfüzyon kaybını onaylayın (bkz. Hala anestezi altındayken, hayvanı LDPI makinesinin altında yüzüstü bir konumda koyu renkli bir köpük ped üzerine yerleştirin ve ayakları yerine sabitlemek için elektrik bandı döngüleri kullanın.
   1. İki taraflı ayakların LDPI'si ile devam edin. Tarama tamamlandıktan sonra, her ayak tabanının etrafına bir yatırım getirisi çizin ve ortalama akı değerlerini elde edin.
   2. Perfüzyon indeksini, ortalama akı değerlerinin bağlı olmayan ayak tabanına oranı olarak hesaplayın. Perfüzyon indeksinin 0,1'den az olduğundan emin olun.
8. Çekirdek vücut ısısını korumak için hayvanı bir ısıtma yastığı veya baş üstü lamba ile temiz bir kafese geri aktarın. Fareleri hayvan tesisine geri göndermeden önce anesteziden tamamen kurtulun.

3. L-NAME'in postoperatif uygulanması ve arka bacak kangreninin izlenmesi

1. Postoperatif 1-3. günlerde, her hayvana ilave 40 mg / kg IP doz L-NAME uygulayın. Aynı zamanda, ayağı iskemik uzuvdan dikkatlice değerlendirin.
2. Faber arka bacak iskemisi skorunu kullanarak arka bacak iskemisi ve kangren derecesini ^ölçün9. Skorlar 1-5: iskemik tırnakların sayısı; skor 6-10: 1-5 iskemik basamak; skor 11 ve 12: kısmi ve tam ayak atrofisi. Faber puanlarını ameliyat sonrası günlerde 1-3 ve daha sonra haftalık olarak kaydedin.

4. Hayvan perfüzyonu için DiI ve çalışma çözeltilerinin hazırlanması

1. DiI stok çözeltisini hazırlamak için, 100 mg DiI kristalini ( Malzeme Tablosuna bakınız) 16.7 mL% 100 etanol içinde çözün. Alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında karanlıkta gece boyunca sallanan bir platformda bırakın.
2. Seyrelticiyi hazırlamak için,% 5'lik bir glikoz çözeltisi elde etmek için 50 g glikozu 1.000 mL damıtılmış suda çözün. 0,22 μm şişe üstü filtreden süzün. Çalışan bir seyreltici çözelti hazırlamak için PBS ve% 5 glikoz çözeltilerini 1: 4 oranında karıştırın.

5. Ekipman kurulumu ve DiI perfüzyonu

1. Kullanımdan hemen önce 10 mL'lik çalışma seyreltici çözeltisine (adım 4.2'de hazırlanan) 200 μL DiI stok çözeltisi ekleyerek DiI çalışma çözeltisi yapın. İyice karıştırmak için elinizle sallayın.
2. İki veya üç adet 3 stopcock ve 25 G kelebek iğnesini seri olarak bağlayın. 4 mL PBS, 10 mL DiI çözeltisi ve 10 mL% 10 nötr tamponlu formalin içeren 10 mL şırıngalar hazırlayın (bkz.
3. Şırıngayı formalin ile proksimal giriş portuna bağlayın ve havayı hattan temizlemek için çözeltiyi enjekte edin; limanı kapatmak için stopcock'u çevirin. Aynı prosedürü sırayla tekrarlayın, şırıngaları DiI ve ardından PBS ile sırasıyla orta ve distal giriş portlarına bağlayın, tüm hava kabarcıklarını stopcock tertibatından temizlemeye özen gösterin.
   NOT: Stopcock tertibatının veya borunun herhangi bir bölümünde hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları perfüzyon sırasında küçük arterleri tıkayarak intravasküler DiI dağılımının zayıflamasına ve görüntüleme sonuçlarının tehlikeye girmesine neden olabilir.
4. Kurulum tamamlandıktan sonra, hayvanı bir indüksiyon odasında aşırı dozda _CO2 ile ötenazi yapın.
5. Perfüze edilecek hayvanı emici bir ped üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve aksillaları ve alt ekstremiteleri iğnelerle sabitleyin.
6. Makas kullanarak, karın boşluğunu açmak için enine bir kesi yapın. Göğüs boşluğuna erişmek için sol ve sağ diyaframı açığa çıkarın ve ardından bölün.
   1. Sternumun her iki tarafındaki göğüs duvarını alt kaburgalardan birinci veya ikinci kaburgalara kadar kesin ve medikal olarak iç torasik (mammari) arterlerden kaçının. Sternumun alt ucunu kavramak için bir hemostat kullanın (bkz.
7. Sağ ventrikülden daha açık renkli görünen sol ventrikülü tanımlayın. Künt forseps ile kalbi yavaşça kavrayın ve kelebek iğnesini sol ventriküle yerleştirin.
   1. Doğru atriyumu delmek için makas veya 18 G'lik bir iğne kullanın, böylece kan ve perfüzyon çözeltilerinin boşalması için kalbe geri dönmesine izin verin. İğneyi bir veya iki elinizle stabilize edin, yanlışlıkla sağ ventrikülü delmemeye ve sistemik dolaşımdan ziyade akciğeri perfüze etmemeye dikkat edin.
8. PBS ile şırıngaya giden portu açın ve vasküler sistemden kanı temizlemek için 1-2 dakika boyunca 1-2 mL / dak hızında 2-4 mL'yi manuel olarak enjekte edin. Sağ atriyumdan kanamayı gözlemleyerek başarılı perfüzyon sağlayın. Enjeksiyondan sonra, PBS şırıngasının portunu kapatın.
9. Limanı DiI ile şırıngaya açın ve 5 dakika boyunca 1-2 mL / dak hızında 5-10 mL enjekte edin. DiI çözeltisinin enjeksiyonuyla hafifçe pembeye dönmesi gereken kulakları, burnu ve avuç içlerini izleyin. Enjeksiyondan sonra, DiI şırıngasının portunu kapatın ve fiksatif enjeksiyonundan önce boyanın dahil edilmesine izin vermek için 2 dakika bekleyin.
10. Portu formalin ile şırıngaya açın ve 5 dakika boyunca 1-2 mL / dak hızında 5-10 mL enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, iğneyi sol ventrikülden çıkarın ve ilgilenilen dokuları toplamaya devam edin.
11. Ağır makas kullanarak, ayak bileğindeki tibianı yerinden çıkarın, sol ve sağ ayakları alt bacaklardan tamamen ayırın. Hasat edilen ayakları, 1-2 mL% 10 formalin çözeltisi içeren 6 veya 12 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. Plakayı folyo ile sarın ve gece boyunca 4 ° C'de saklayın.

6. Konfokal lazer tarama mikroskobu için ayak yastığı dokusunun hazırlanması

1. Ertesi gün, fiksatif çözeltiyi 6 veya 12 delikli plakada, kuyu başına 1-2 mL PBS ile değiştirin.
2. Ayağı derileştirmek için, ilk önce, ayağın plantar ve dorsal yönlerinde bir neşter ile uzunlamasına bir kesi yapın. Daha sonra, dişli forseps ve küçük bir hemostat kullanarak, altta yatan yumuşak dokulara zarar vermeden, tüm cildi ayaktan ve basamaklardan dikkatlice çıkarın.
3. Dokuların montajına ve görüntülenmesine, tercihen perfüzyon ve hasattan sonraki 1-2 gün içinde devam edin. Alternatif olarak, ayak pedlerini 1-2 mL PBS içeren 6 veya 12 delikli plakalara geri döndürün; folyo ile örtün ve floresansı 1 aya kadar korumak için 4 ° C'de saklayın.
4. Dokuları monte etmek için, ayakları iki cam mikroskop slaytı arasına ayrı ayrı yerleştirin ve her iki ucunda kendi üzerine katlanmış bir köpük biyopsi pedi (doku kalınlığına bağlı olarak bir veya iki kez) (bkz. Cam slaytları her iki uçta birlikte sıkıştırmak için iki küçük bağlayıcı klips kullanın (son kalınlık yaklaşık 1 mm).
   NOT: Daha kalın dokular daha uzun tarama süreleri gerektirir. Derili ayak tabanı, doku kalınlığını azaltmak için görüntülemeden bir gün önce cam slaytlar arasında sıkıştırılabilir.

7. Konfokal lazer tarama mikroskobu

1. Görüntüleme oturumuna hazırlanın: görüntüleme sistemini açın ve edinme yazılımını başlatın (bkz. Düşük büyütmeli lensler genellikle bu deney için gereken daha uzun çalışma mesafelerine sahip olduğundan, görüntüleri yakalamak için düşük büyütme/düşük sayısal diyafram açıklığı hedefi (ör. x5/0,15) kullanın.
2. Sahne Alanını Etkinleştir iletişim kutusuna Evet'i tıklatın. Yapılandırma sekmesinde 561 nm lazeri etkinleştirin. Ana ekranda, Görünür düğmesine tıklayarak görünür bir ışın yolunu etkinleştirin. İlgili Etkin onay kutusuna tıklayarak bir dedektörü 570-600 nm aralığına ayarlayın.
3. Edinme > Edinme sekmesinde Döşeme Taraması simgesini seçin ve istediğiniz çözünürlüğü ayarlayın (512 x 512 veya 1024 x 1024).
4. Mikroskop aşamasında cam slaytlar arasında sıkıştırılmış kuru monte edilmiş (su veya PBS eklenmemiş) doku numunesini konumlandırın ve dokuyu odaklayın.
5. Tarama sınırlarını ayarlamak için örneğin sol üst veya sağ köşesine gidin. Edinme sekmesinde, Döşeme Taraması menüsünün altında, Konumu İşaretle düğmesine tıklayın. Karşı köşeye gidin (sırasıyla sağ alt veya sol) ve Konumunu İşaretle düğmesine bir kez daha tıklayın.
6. Z yığınının derinliğini ayarlamak için, ekranın sol alt köşesindeki Canlı düğmesine tıklayın ve örneğin ortasına gidin. Numunenin en altına gitmek için z ekseni düğmesini kullanın.
7. Edinme sekmesinde, Z-Stack menüsünün altında, Başlat düğmesine tıklayın. Numunenin en üstüne ilerleyin ve Sonlandır düğmesine tıklayın. Z-adım Boyut'a tıklayın ve istediğiniz değere ayarlayın (örneğin, 50 μm).
8. Ekranın sağ alt köşesinde, görüntü almaya başlamak için Başlat'a tıklayın.

8. Footpad vaskülaritesinin kantitatif analizi ve 3D rekonstrüksiyonu

1. Fiji'nin (ImageJ) en son sürümünü ve Gemi Analizi ^{eklentisini20} indirin ve yükleyin. Fiji'de mikroskopi görüntü dosyalarını açın, bu da tek tek Z serisini, görüntünün altındaki kaydırıcı kullanılarak z ekseninde görüntülenebilen Z-yığınları halinde birleştirecektir.
2. Bileşik Z-yığını görüntüsünü seçin ve ardından Görüntü menüsünün altında Z Projesi > Yığınlar'ı seçerek iki boyutlu bir projeksiyon oluşturun. Ardından, İkili Yap > İşlem İkili > altında Z-projeksiyonunu ikiliye dönüştürün.
3. Vasküler Yoğunluk eklentisini Plugins > Vascular Density altında çalıştırın. İstendiğinde, footpad ve rakamların çevresinde bir yatırım getirisi izlemek için imleci kullanın. ROI'nin (vasküler alan fraksiyonu) yüzdesi olarak ifade edilen bildirilen damar yoğunluğuna dikkat edin.
4. Fiji'de 3B yeniden yapılandırmalar oluşturmak için 3B Projede Yığınlar>ı seçin ve Görüntü menüsünün altında istediğiniz dönüş eksenini, açısını ve hızını ayarlayın. Alternatif olarak, görüntüleri dilimler halinde görselleştirmek veya istenen eksenlerde yeniden yapılandırmayı işlemek için Eklentiler menüsü altında Volume Viewer'ı seçin.
5. Daha fazla 3B işleme için, alternatif görüntü analizi ve işleme yazılımı kullanın (bkz. Dosyaları istediğiniz yazılımın formatına dönüştürün ve karo dikiş işlevini kullanarak tek tek karo taramalarını dikin.
6. Tek tek karo taramalarını bir araya getirdikten sonra, bileşik dosyayı açın ve birim yüzeyi oluşturmaya devam edin. Yüzey Oluşturma Sihirbazı'nı açmak için Yeni Yüzey Ekle'ye tıklayın ve özellikle yatırım getirisini ve eşik yoğunluğunu ayarlayarak menüler arasında geçiş yapmak için okları kullanın. Yüzey işlemeden memnun kaldıktan sonra, işlenen görüntünün videolarını oluşturmak için animasyon işlevini kullanın.

Sonuçlar

Bu protokol, duyarlı FVB farelerde bir nitrik oksit sentaz inhibitörü olan L-NAME uygulaması ile femoral arter ve ven pıhtılaşmasının bir kombinasyonunu kullanarak murin ayak pedinde iskemi ve doku kaybını indüklemek için güvenilir bir aracı detaylandırır. Şekil 1, murin arka ekstremite vaskülatürünün anatomisini detaylandırır ve lateral circumflex femoral artere (LCFA) sadece proksimal ve safenopopliteal bileşkeye proksimal olan femoral arter ve ven pıhtılaşması...

Tartışmalar

Fare arka bacak iskemisi, PAD ve CLTI'da neovaskülarizasyonu incelemek için en yaygın kullanılan preklinik model olsa da, kullanılan spesifik fare suşuna ve arteriyel bozulmanın yerine, sayısına ve yöntemine bağlı olarak iskemi şiddeti ve iyileşmesinde önemli farklılıklar vardır. Femoral arter ligasyonu ve L-NAME'in IP uygulamasının kombinasyonu, FVB farelerde arka bacak kangrenini güvenilir bir şekilde ^{indükleyebilir11}. Aynı tedavi, C57BL / 6 farelerde doku kaybı olmadan ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binder clips (small)	Office supply store
Buprenorphine (sustained-release)
Butterfly needle (25 G with Luer-Lok)	VWR	10148-584
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)	Invitrogen	D282
Electrocautery device	Gemini Cautery System	5917
Ethanol (100%)	VWR	89370-084
Fiji (ImageJ) software	NIH		Used version 2.1.0. Free download, no license required.
Foam biopsy pads	Fisher Scientific	22-038-221
Formalin (neutral buffered, 10%)	VWR	89370-094
FVB mice	Jackson Laboratory	001800
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HCl (1 M)	Sigma-Aldrich	13-1700
Imaris software	Oxford Instruments		Used version 9.6.0.
Isoflurane	Pivetal	NDC 46066-755-04
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride)	Sigma-Aldrich	N5751
Laser Doppler perfusion imager	MoorLDI	moorLDI2-HIR	Used moorLDI V5 software.
Microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	VWR	48311-703
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282
NaOH	Sigma-Aldrich	S8263
Needles (27 G)	BD	305109
Povidone-iodine swabstick (10%)	Medline	MDS093901ZZ
Surgical instruments	Roboz Surgical		Fine forceps, needle driver, spring scissors, and hemostat are recommended.
Suture (5-0 absorbable)	DemeTECH	G275017B0P
Syringes (10 mL)	BD	305482
Three-way stopcocks	Cole-Parmer	19406-49
Vascular Analysis Plugin			Free download, no license required. See reference: Elfarnawany (2015).
Xylazine