Enflamasyon Sırasında Lökosit-Endotelyal Hücre Etkileşimini İnceleyen Mikrofizyolojik Bir Sistem

Özet

Bu protokolde, fizyolojik olarak ilgili bir mikrovasküler ortamı yeniden üretebilen ve tüm lökosit adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen bir biyomimetik mikroakışkan testi, inflamatuar hastalıkta lökosit-endotel hücre etkileşimlerini incelemek için kullanılmaktadır.

Özet

Lökosit-endotelyal hücre etkileşimleri sepsis gibi inflamatuar hastalıklarda önemli rol oynamaktadır. Enflamasyon sırasında, aktif lökositlerin vasküler endotel boyunca anahtar organlara aşırı göçü organ yetmezliğine yol açabilir. Fizyolojik olarak ilgili bir biyomimetik mikroakışkan testi (bMFA), lökosit-endotelyal hücre etkileşimlerini incelemek için tüm lökosit haddeleme / adezyon / migrasyon kaskadını yeniden üretebilen çeşitli deneysel ve hesaplama teknikleri kullanılarak geliştirilmiş ve doğrulanmıştır. Kemirgenlerde in vivo görüntülerden elde edilen mikrovasküler ağlar, Coğrafi Bilgi Sistemi (CBS) yaklaşımı kullanılarak sayısallaştırıldı ve mikroskop slaytı üzerinde polidimetilsiloksan (PDMS) ile mikrofabrikasyona tabi tutuldu. Kesme hızının ve vasküler topolojinin lökosit-endotel hücre etkileşimleri üzerindeki etkisini incelemek için, ağ boyunca kayma hızlarının ve hızlarının karşılık gelen bir haritasını oluşturmak için bir Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) modeli geliştirilmiştir. bMFA, yuvarlanma hızı, farklı kesme oranlarına yanıt olarak yapıştırılmış lökosit sayısı, göç eden lökosit sayısı, endotel hücre geçirgenliği, adezyon molekülü ekspresyonu ve diğer önemli değişkenler dahil olmak üzere lökosit-endotel hücre etkileşimlerinin miktarını sağlar. Ayrıca, insan endotel hücreleri ve lökositler gibi insanla ilgili örnekleri kullanarak, bMFA, klinik çevrilebilirliklerini artırmak için potansiyel terapötiklerin hızlı bir şekilde taranması için bir araç sağlar.

Giriş

Enflamasyon, enfeksiyon ve yaralanmaya karşı konakçı yanıtıdır ve endotel, inflamatuar yanıtta önemli bir rol oynar ^1,2,3. İnflamatuar disregülasyon, sepsis, kardiyovasküler hastalıklar, astım, inflamatuar bağırsak hastalığı, kanser ve COVID-19 gibi bir dizi hastalık patolojisinin altında yatan nedendir. Lökosit-endotelyal hücre etkileşimleri bu inflamatuar hastalıklarda merkezi bir rol oynamaktadır. Enflamasyon sırasında, patojenlerden PAMPS'nin (patojenle ilişkili moleküler paternler) veya hasarla ilişkili moleküler paternler) yaralı dokulardan DAMPS'lerin (hasarla ilişkili....

Protokol

Heparinize insan kanı, Temple Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (Philadelphia, PA, ABD) tarafından onaylanan bilgilendirilmiş onam sonrasında, sağlıklı yetişkin donörlerden (21 ila 60 yaşları arasındaki erkek ve kadınlar) nötrofil izolasyonu için elde edilir.

1. Cihazın insan fibronektini ile astarlanması ve kaplanması

NOT: bMFA'nın vasküler bölmeye bağlı iki giriş bağlantı noktası ve iki çıkış bağlantı noktası vardır. Ayrıca doku bölmesine bağlı bir portu vardır (Şekil 2).

1. İnce noktalı forsepsli bir giriş portu hariç tüm portlara boru (0.06" O.D. ve 0.....

Sonuçlar

bMFA'da kesme akımı altında 48 saatlik kültürden sonra, endotel hücreleri bMFA'daki vasküler kanalların yüzeyini kapladı ve akış yönünde hizalandı (Şekil 6). Konfokal mikroskopi, vasküler kanalların tüm yüzeylerinin endotel hücreleri tarafından kaplandığını ve bMFA^18'de tam bir 3D lümen oluşturduğunu gösterdi.

Bu protokol kullanılarak, bMFA'da nötrofillerin endotel hücresine önemli ölçüde yapıştığın.......

Tartışmalar

bMFA, in vivo mikrovasküler ağların topografyasını ve akış koşullarını yeniden üretir ve fizyolojik olarak gerçekçi koşullar altında lökosit-endotelyal hücre etkileşimini ve endotel fonksiyonunu in vitro olarak incelemek için kullanılabilir. Fare veya insanın mikrovaskülatüründe, mikrovasküler ağların geometrisi kendine benzer ve fraktaldır ve Reynolds sayısı 1'<<, vasküler geometrinin akış modellerini önemli ölçüde etkilemediğini gösterir. Bu nedenle, bFMA, insanl.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)	SynVivo	SMN1-C001	Exclusive at SynVivo
Blunt needle	Jensen Global	JG24-0.5
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C70-500
CFDA, SE	ThermoFisher	C1157
Dextran, 250,000, Powder	Spectrum Chemical Mfg. Corp	DE-130
Ficoll-Paque Premium	GE Health Care	17-5442-02	Leukocyte isolation media
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506
Hepes	Fisher Scientific	AAJ1692630
Human fibronectin	Fisher Scientific	33-016-015	use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	cc-3202	Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells	Lonza	cc-2527	use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments Inc.		Microscope
NIS-elements, 5.20.01	Nikon Instruments Inc.		Imaging software
PBS	Fisher Scientific	MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3007	Syringe Pump
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha	R&D Systems	210-TA
Slide clamp	SynVivo
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640-500
Synvivo Pneumatic Primer	SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)	Lonza	cc-5034
Tygon tubing	Fisher Scientific	50-206-8921	Tubing