Yetişkin Farelerden Akut Striatal Dilimlerde Oksijen Tüketim Hızının Ölçülmesi

Özet

Oksijen tüketim hızı (OCR), mitokondriyal fonksiyon için yaygın bir vekildir ve farklı hastalık modellerini incelemek için kullanılabilir. Yetişkin farelerden akut striatal dilimlerdeki OCR'yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdik ve bu da fizyolojik olarak diğer yöntemlerden daha alakalı.

Özet

Mitokondri, hücresel ATP üretiminde, reaktif oksijen türlerinin düzenlenmesinde ve Ca^{2 +} konsantrasyon kontrolünde önemli bir rol oynamaktadır. Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı ve Alzheimer hastalığı dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalığın patogenezinde rol oynamıştır. Mitokondrinin bu hastalıkların modellerindeki rolünü incelemek için, mitokondriyal fonksiyon için bir vekil olarak oksijen tüketim oranı (OCR) yoluyla mitokondriyal solunumu ölçebiliriz. OCR, hücre kültürlerinde ve izole mitokondrilerde zaten başarıyla ölçülmüştür. Bununla birlikte, bu teknikler akut beyin dilimlerinde OCR'yi ölçmekten daha az fizyolojik olarak ilgilidir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yazarlar yetişkin farelerden akut striatal dilimlerde OCR'yi doğrudan ölçmek için bir Seahorse XF analizörü kullanarak yeni bir yöntem geliştirdiler. Teknik, PD ve Huntington hastalığında yer alan bir beyin bölgesi olan striatuma odaklanarak optimize edilmiştir. Analizör, 24 numunenin eşzamanlı kinetik ölçümüne izin veren 24 delikli bir plaka kullanarak canlı bir hücre testi gerçekleştirir. Yöntem, örnek olarak dairesel delikli striatal beyin dilimleri parçalarını kullanır. Bu tekniğin etkinliğini, PD'nin bir fare modelinin striatal dilimlerinde daha düşük bir bazal OCR tanımlayarak gösteriyoruz. Bu yöntem, PD ve Huntington hastalığı alanında çalışan araştırmacılar için geniş ilgi çekici olacaktır.

Giriş

Mitokondriyal disfonksiyon, Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı ve Alzheimer hastalığı ^1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli nörolojik hastalıklarda rol oynamıştır. PINK1 nakavt (KO) fareleri ve sıçanlar gibi PD modelleri, bozulmuş mitokondriyal fonksiyon 4,5,6,7,8,9,10,11 gösterir. Yaşlı PINK1 KO farenin s....

Protokol

Hayvan çalışmaları da dahil olmak üzere tüm prosedürler ulusal ve uluslararası kılavuzlara göre yürütülmüş ve Thomas Jefferson Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. 3-14 aylıkken erkek FVB/NTac fareleri kullanıldı. Aşağıdaki adımlar steril olmayan bir ortamda gerçekleştirilmiştir, ancak her şeyi mümkün olduğunca temiz tutmak için dikkatli olunmalıdır.

NOT: Burada sunulan yöntem, Zhi ve ^ark.24 tarafından bildirilen araştırmada kurulmuş ve kullanılmıştır. Burada açıklanan deneylerde bir Denizatı XF24 hücre dışı akı analizörü kullanılmıştır (bkz. Bu yöntemler XFe24 a....

Sonuçlar

Bu çalışmanın ilk adımı, striatumun bir bölümünü dilimden çıkarmak için kullanılan dilim kalınlığını ve zımba boyutunu optimize etmekti (Şekil 3A). 150 μm kalınlığındaki bir dilim ve 1,5 mm'lik bir zımba boyutu, kavrama verimliliği tarafından belirlenen en iyi sonuçları vermiştir (Şekil 3B-C). Şekil 3B'de gösterildiği gibi, OCR% 10'dan az tükenme ile 5 saat boyun.......

Tartışmalar

Geliştirdiğimiz yöntem, yetişkin farelerden striatal dilimlerde OCR'yi 4 saatlik bir süre boyunca ölçmek için bir XF analizörünün kullanılmasına izin verdi. Bu yöntem, anatomik olarak tanımlanmış beyin yapılarından eksize edilen yumruklardaki hücresel biyoenerjetik ölçümleri ölçmek için yeni bir yol sağlar. Analiz edilen doku örnekleri oldukça küçük olduğundan, bir hastalıkta yer alan belirli beyin bölgelerinin metabolik parametreleri araştırılabilir. Ek olarak, akut dilimlerin kulla.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accumet AB150 pH benchtop meter	Thermo Fisher Scientific	13-636-AB150	To measure pH
Antimycin A from streptomyces sp.	SIGMA	A8674	To inhibit complex III of the mitochondria
Bovine Serum Albumin (BSA)	SIGMA	A6003	To make modified artificial cerebrospinal fluid (BSA-ACSF)
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	SIGMA	C2920	To uncouple mitochondrial respiration
D-Glucose	SIGMA	G8270	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
DMSO	SIGMA	D8418	To dissovle compounds
HEPES	SIGMA	H3375	To make artificial cerebrospinal fluid (ACSF)
Humidified non-CO2 incubator	Fisher Scientific	11-683-230D	To hydrate plates at 37 °C
Oligomycin from Streptomyces diastatochromogenes	SIGMA	O4876	To inhibit mitochondrial ATP synthase
Parafilm	SIGMA-ALDRICH		sealing film
Rotenone	Tocris	3616	To inhibit complex I of the mitochondria
Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL	Seahorse Bioscience	103681-100	Solution for seahorse calibration
Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, old generation
Seahorse XFe24 Extracellular Flux Analyzer	Seahorse Bioscience		Equipment used to analyze oxygen consumption rate, new generation
Seahorse XF24 FluxPaks	Seahorse Bioscience	101174-100	Package of flux analyzer sensor cartridges, tissue culture plates, capture screens,  calibrant solution and calibration plates; assay kit.
Sodium pyruvate	SIGMA	P2256	To prevent any substrate-limiting constraints of substrate supply
Stainless steel biopsy punches	Miltex		Device used to punch slices
Sterile cell culture dish, 35 x 10 mm	Eppendrof	0030700102	Used for slice punch
Vibratome	Leica	VT1200	To slice brain tissue
Water bath	Thermo Scientific Precision	282-115	To heat buffer and solutions