CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Özet

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.

Özet

Hem enstrümantasyon hem de görüntü işleme yazılımındaki son gelişmeler, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobunu (kriyo-EM), yapısal biyologların çok çeşitli makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için tercih ettikleri yöntem haline getirmiştir. Görüntü işleme ve yapı hesaplaması için yeni ve uzman kullanıcılar tarafından aynı temel iş akışını kolaylaştıran birden fazla yazılım paketi mevcuttur: mikroskop dedektörleri tarafından edinilen filmler, ışın kaynaklı hareket ve kontrast aktarım fonksiyonu (CTF) tahmini için düzeltmeye tabi tutulur. Daha sonra, parçacık görüntüleri yinelemeli 2B ve 3B sınıflandırma için ortalama film karelerinden seçilir ve ayıklanır, ardından 3B yeniden yapılandırma, iyileştirme ve doğrulama yapılır. Çeşitli yazılım paketleri farklı algoritmalar kullandığından ve çalışmak için farklı uzmanlık seviyeleri gerektirdiğinden, ürettikleri 3D haritalar genellikle kalite ve çözünürlük bakımından farklılık gösterir. Böylece, kullanıcılar en iyi sonuçlar için çeşitli programlar arasında düzenli olarak veri aktarırlar. Bu makale, kullanıcıların popüler yazılım paketlerinde bir iş akışında gezinmeleri için bir kılavuz sağlar: adeno ilişkili virüsün (AAV) atomik çözünürlüğe yakın bir yapısını elde etmek için cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. İlk önce cryoSPARC v3 ile bir görüntü işleme boru hattını detaylandırıyoruz, çünkü verimli algoritmaları ve kullanımı kolay GUI'si kullanıcıların bir 3D haritaya hızlı bir şekilde ulaşmalarını sağlıyor. Bir sonraki adımda, parçacık koordinatlarını cryoSPARC v3'te elde edilen en iyi kalitede 3D rekonstrüksiyondan RELION-3 ve Scipion 3'e dönüştürmek ve aktarmak ve 3D haritaları yeniden hesaplamak için PyEM ve şirket içi komut dosyalarını kullanıyoruz. Son olarak, RELION-3 ve Scipion 3'ten algoritmaları entegre ederek ortaya çıkan yapıların daha fazla iyileştirilmesi ve doğrulanması için adımları özetliyoruz. Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak üzere üç işleme platformunun etkili bir şekilde nasıl kullanılacağını açıklayacağız.

Giriş

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) ve tek parçacık analizi (SPA), hidratlanmış hallerinde çok çeşitli biyomoleküler montajların yapı tayinini sağlayarak bu makromoleküllerin rollerini atomik detaylarda aydınlatmaya yardımcı olur. Mikroskop optiği, bilgisayar donanımı ve görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, biyomoleküllerin yapılarını 2 ^Å1,2,3'ün ötesine ulaşan çözünürlükte belirlemeyi mümkün kılmıştır. 2020 yılında Protein Veri Bankası'na (PDB) 2.300'den fazla kriyo-EM yapısı yatırılırken, 20144 yılında 192 yapıya kıyasla, kriyo-EM'nin birçok yapısal biyolog için tercih edilen yöntem haline geldiğini göstermektedir. Burada, yüksek çözünürlüklü yapı tayini için üç farklı SPA programını birleştiren bir iş akışını açıklıyoruz (Şekil 1).

SPA'nın amacı, bir mikroskop dedektörü tarafından kaydedilen gürültülü 2D görüntülerden bir hedef numunenin 3D hacimlerini yeniden yapılandırmaktır. Dedektörler, görüntüleri aynı görüş alanına sahip ayrı karelere sahip filmler olarak toplar. Numuneyi korumak için, çerçeveler düşük elektron dozuyla toplanır ve bu nedenle zayıf bir sinyal-gürültü oranına (SNR) sahiptir. Ek olarak, elektron pozlaması vitrifiye kriyo-EM ızgaraları içinde hareketi indükleyebilir ve görüntü bulanıklığına neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çerçeveler ışın kaynaklı hareketi düzeltmek için hizalanır ve artan SNR'ye sahip bir mikrograf üretmek için ortalamaları alınır. Bu mikrograflar daha sonra mikroskop tarafından uygulanan bulanıklaştırma ve sapmaların etkilerini hesaba katmak için Kontrast Transfer Fonksiyonu (CTF) tahminine tabi tutulur. CTF ile düzeltilmiş mikrograflardan, bireysel parçacıklar seçilir, ekstrakte edilir ve vitreus buzdaki numune tarafından benimsenen farklı yönelimleri temsil eden 2D sınıf ortalamalarına ayrılır. Ortaya çıkan homojen parçacık kümesi, kaba bir model veya modeller oluşturmak için ab initio 3D rekonstrüksiyonu için girdi olarak kullanılır ve bunlar daha sonra bir veya daha fazla yüksek çözünürlüklü yapı üretmek için yinelemeli olarak rafine edilir. Rekonstrüksiyondan sonra, kriyo-EM haritasının kalitesini ve çözünürlüğünü daha da iyileştirmek için yapısal iyileştirmeler yapılır. Son olarak, ya bir atomik model doğrudan haritadan türetilir ya da harita başka bir yerde elde edilen atomik koordinatlarla donatılmıştır.

^Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, ^Xmipp13 ve diğerleri dahil olmak üzere yukarıda özetlenen görevleri yerine getirmek için farklı yazılım paketleri mevcuttur. Bu programlar benzer işleme adımlarını izlerken, örneğin parçacıkları toplamak, ilk modeller oluşturmak ve rekonstrüksiyonları rafine etmek için farklı algoritmalar kullanırlar. Ek olarak, bu programların çalışması için farklı düzeyde kullanıcı bilgisi ve müdahalesi gerekir, çünkü bazıları yeni kullanıcılar için bir engel teşkil edebilecek parametrelerin ince ayarına bağlıdır. Bu tutarsızlıklar genellikle platformlar arasında tutarsız kalite ve çözünürlüğe sahip haritalara neden ^olur14 ve birçok araştırmacının sonuçları iyileştirmek ve doğrulamak için birden fazla yazılım paketi kullanmasına neden olur. Bu makalede, gen terapisi için yaygın olarak kullanılan bir vektör olan AAV'nin yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için kriyoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3'ün kullanımını ^{vurguladık15}. Yukarıda belirtilen yazılım paketleri akademik kullanıcılar için ücretsizdir; cryoSPARC v3 ve Scipion 3 lisans gerektirir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Yeni bir cryoSPARC v3 projesi oluşturma ve verileri içe aktarma

NOT: Veriler, Portland'daki Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi'nde (OHSU), bir Falcon 3 doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 300 kV Titan Krios elektron mikroskobu kullanılarak elde edilmiştir. Görüntüler, 129 kare boyunca kesirlenmiş toplam 28,38 e⁻/^Å2 dozu ve EPU kullanılarak 1,045 şpiksel boyutunda -0,5 μm ila -2,5 μm arasında bir bulanıklaştırma aralığı ile sayım modunda toplanmıştır. AAV-DJ örneği OHSU personeli tarafından sağlanmıştır.

1. cryoSPARC v3'ü bir web tarayıcısında açın ve Projeler başlığına tıklayın. Yeni bir proje oluşturmak için + Ekle'yi seçin. Projeyi buna göre adlandırın ve işlerin ve verilerin kaydedileceği varolan bir dizine giden bir yol sağlayın.
2. Projeyi açıp + Ekle'ye tıklayarak ve Yeni Çalışma Alanı'nı seçerek proje için bir çalışma alanı oluşturun. Çalışma alanına bir başlık verin ve Oluştur'a tıklayın.
3. Yeni çalışma alanına gidin ve sağ paneldeki İş Oluşturucu'yu açın. Bu sekme, cryoSPARC v3'te bulunan tüm işlevleri görüntüler. Filmleri İçe Aktar'a tıklayın ve film yolunu sağlayın, referans dosya yolunu kazanın ve alma parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın: Ham Piksel Boyutu 1.045 Å, Hızlanma Voltajı 300 kV, Küresel Sapma 2.7 mm, Toplam Maruz Kalma Dozu 28.38 e^-/Å^2.
4. Kuyruk'a tıklayın, işi ve çalışma alanını çalıştırmak için bir şerit seçin ve Oluştur'a tıklayın.
   NOT: Edinme parametreleri numuneye ve mikroskopa bağlıdır.

2. CryoSPARC v3 - film hizalaması ve CTF tahmini

1. Yama Hareket Düzeltme'yi (Çoklu) açın. Bu iş, adım 1.3'te içe aktarılan filmlerin giriş olarak kullanılmasını gerektirir. Çalışma alanında film içe aktarma iş kartını açın ve Imported_movies çıktısını yeni işteki filmler yer tutucusuna sürükleyin. İşi kuyruğa alın.
   NOT: Bu makalede özetlenen cryoSPARC yöntemleri hakkında daha fazla bilgi için, cryoSPARC ^{tutorial16'ya} bakın.
2. CTF tahmini gerçekleştirmek için, Yama CTF Tahmini'ni (Çoklu) açın. Adım 2.1'de oluşturulan mikrografları girin ve işi kuyruğa alın .
3. Ortalama ve CTF ile düzeltilmiş mikrografları incelemek ve daha sonraki işlemler için bir alt küme seçmek üzere Pozlamaları Küratörlüğünü Yap'ı açın ve adım 2.2'de elde edilen pozlamaları girin. İşi kuyruğa alın.
4. İş Bekleme moduna girdikten sonra, iş kartındaki Etkileşim sekmesine tıklayın, parametre eşiklerini ayarlayın ve daha fazla işlem için tek tek mikrografları kabul edin veya reddedin. İyi eşleşmiş tahmini ve deneysel CTF'lere sahip mikrografları kabul edin (Şekil 2) ve yüksek astigmatizma, zayıf CTF uyumu ve kalın buzu olanları atın.
5. Mevcut verileri işlerken, Astigmatizmanın üst eşiğini 400 Å, CTF uyum çözünürlüğünü 5 şve göreceli buz kalınlığını 2 olarak ayarlayın. Aşağı akış işleme için mikrografları seçmek üzere Bitti'ye tıklayın.

3. CryoSPARC v3 - manuel ve şablon tabanlı parçacık toplama

1. Manuel Seçici'yi açın, 2.4-2.5 adımlarından kabul edilen pozlamaları girin ve işi kuyruğa alın. Etkileşimli sekmesine tıklayın, Kutu Boyutu'nu (piksel) 300 olarak ayarlayın ve birden fazla mikrografta birkaç yüz parçacığa tıklayın ve çakışan parçacıkları seçmekten kaçının. Burada, 29 mikrografta 340 parçacık seçildi. İşiniz bittiğinde, Toplama Bitti'ye tıklayın! Parçacıkları ayıklayın.
   NOT: Bu protokol, otomatik seçim için şablonlar oluşturmak üzere manuel parçacık toplama kullanır. Ancak, başka yöntemler de ^mevcuttur17.
2. Otomatik partikül toplama şablonları oluşturmak için 2B Sınıflandırma'ya tıklayın ve adım 3.1'de oluşturulan parçacık seçimlerini girin. 2B Sınıf sayısını 10 olarak değiştirin ve işi kuyruğa alın .
3. 2B sınıfları seç'i açın. Adım 3.2'de elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin ve İnteraktif sekmesine tıklayın. İyi SNR'ye sahip temsili 2D sınıfları seçin ve Bitti'ye tıklayın.
   NOT: Sınıf ortalamaları farklı parçacık görünümlerini yansıtır. Her görünümü yansıtan sınıf ortalamalarını seçin. Amaç, otomatik toplama için numunenin farklı görünümlerini temsil eden iyi tanımlanmış şablonlar üretmektir.
4. Şablon Seçici'yi açın ve adım 3.3'te seçilen 2B sınıfları ve adım 2.4-2.5'teki mikrografları girin. Parçacık Çapı'nı (Å) 220 şolarak ayarlayın ve işi kuyruğa alın.
5. Otomatik çekimleri incelemek için Partikül Çekme Seç'i açın, adım 3.4'te oluşturulan parçacıkları ve mikrografları girin ve işi sıraya alın.
6. Parçacık Seçimlerini Seç iş kartında, Etkileşimli sekmesine tıklayın ve Kutu boyutunu (px) 300 olarak ayarlayın. Tek bir mikrografa tıklayın, parçacıklar açıkça görünene kadar lowpass filtresini ayarlayın ve Normalleştirilmiş Çapraz Korelasyon (NCC) Eşiğini 0,41'e ve Güç Eşiğini 54000 ile 227300 arasında ayarlayın.
7. Birkaç mikrografı inceleyin ve gerekirse eşikleri, çoğu parçacığın yanlış pozitifler dahil edilmeden seçileceği şekilde ayarlayın. İşiniz bittiğinde, Toplama Bitti'ye tıklayın! Parçacıkları ayıklayın.
   NOT: Gerçek parçacıklar tipik olarak şablona benzer olduklarını ve sırasıyla yüksek bir SNR'ye sahip olduklarını gösteren yüksek bir NCC ve güç puanına sahiptir.
8. Mikrograflardan Ekstrakt'ı açın ve adım 3.7'deki mikrografları ve parçacıkları girin. Ayıklanan Kutu Boyutu'nu (px) 300 olarak ayarlayın ve İşi kuyruğa alın.

4. CryoSPARC v3 - 2D sınıflandırma

1. 2B Sınıflandırma'ya tıklayın ve 3.8. adımdan çıkarılan parçacıkları girin. 2B sınıf sayısını 50 olarak ayarlayın ve işi kuyruğa alın.
2. Daha fazla işleme için en iyi 2B sınıfları seçmek üzere 2B sınıfları seç'i açın. Adım 4.1'de elde edilen parçacıkları ve sınıf ortalamalarını girin. İnteraktif sekmesine tıklayın ve sınıftaki parçacıkların çözünürlüğüne ve sayısına göre 2B sınıfları seçin (Şekil 3). Yapılar içeren sınıfları seçmeyin. Seçtikten sonra Bitti'ye tıklayın.
   NOT: Genellikle, farklı, iyi tanımlanmış sınıflara yakınsamayan parçacıkları çıkarmak için birden fazla 2B sınıflandırma turu gerekir. Bu tür parçacıkları veri kümesinden çıkarmak için gerektiği kadar 2B sınıflandırma turu çalıştırın (Şekil 3).

5. CryoSPARC v3 - ab-initio rekonstrüksiyonu ve homojen arıtma

1. İlk 3B hacim oluşturmak için, Ab-initio Rekonstrüksiyonu'nu açın ve adım 4.2'de veya son 2B sınıflandırmasından elde edilen parçacıkları girin. Simetriyi ikosahedral olarak ayarlayın. İşi kuyruğa alın.
   NOT: Simetri örneğe bağımlıdır ve buna göre değiştirilmelidir. Bilinmiyorsa, C1 simetrisini kullanın.
2. Açık Homojen İyileştirme. Adım 5.1'den gelen hacmi ve 4.2'deki parçacıkları veya son 2B sınıflandırmayı girin. Simetriyi değiştirin ve işi kuyruğa alın . İş bittiğinde, Fourier Shell Korelasyon (FSC) eğrisini inceleyin ve UCSF ^Chimera18'de incelemek üzere birimi indirin.

6. Parçacık koordinatlarını kriyoSPARC v3'ten dışa aktarma ve PyEM kullanarak RELION-3'e aktarma

NOT: Parçacık koordinatları, her mikrograftaki tek tek parçacıkların konumu hakkında bilgi taşır. Parçacık yığınları yerine koordinatların RELION-3'e aktarılması, aksi takdirde kullanılamayacak olan iyileştirme adımlarının çalıştırılmasına izin verir. Örneğin, parçacık parlatma işlemi ilk film karelerine erişim gerektirir. Bu nedenle, parçacık koordinatlarını kriyoSPARC v3'ten RELION-3'e ihraç etmeden önce, filmleri içe aktarın ve RELION-3'te hareket düzeltme ve CTF tahmini yapın. Ayrıntılar için RELION-3 ^{öğreticisine19} bakın.

1. RELION-3 proje dizinine gidin ve RELION-3'ü başlatın.
2. İş türü tarayıcısından İçeri Aktar'ı açın ve adım 1.3'te olduğu gibi filmlerin ve alma parametrelerinin yolunu belirtin.
3. Hareket düzeltmesi yapmak için, RELION-3 GUI aracılığıyla UCSF MotionCor220'yi kullanın, Hareket Düzeltme'yi açın ve UCSF MotionCor2 kılavuzundaki21 gibi varsayılan parametreleri ayarlayın. Adım 6.2'de içe aktarılan filmlerin yolunu girin. Hareket sekmesinde, motioncor2 yürütülebilir dosyasının yolunu belirtin.
   NOT: MotionCor2, birden fazla GPU kullanılarak paralel olarak çalıştırılabilir.
4. CTFFIND-4.122 kullanarak RELION-3 GUI aracılığıyla CTF tahmini gerçekleştirin. CTF Tahmini'ni açın ve adım 6.3'te oluşturulan micrographs.star'ı girin. CTFFIND-4.1 sekmesinde, CTFFIND-4.1 yürütülebilir dosyasının yolunu belirtin ve parametreleri RELION-3.1 ^{öğreticisinde19} olduğu gibi ayarlayın.
5. Partikül yığınlarını cryoSPARC v3'ten RELION-3'e aktarmak için, önce cryoSPARC v3'ten dışa aktarılmaları gerekir. CryoSPARC v3'te, adım 4.2'den veya son 2B sınıflandırmadan 2B sınıf seç işinin iş kartını açın. Ayrıntılar sekmesinde, İşi Dışa Aktar'a tıklayın. Dışa aktarma işi , particles_exported.cs dosyasının çıktısını verir.
6. Parçacık koordinatlarını cryoSPARC v3'ten RELION-3'e aktarmadan önce, adım 6.5'teki particles_exported.cs dosyası .star biçimine dönüştürülmelidir. ^PyEM23 kullanarak, aşağıdaki komutu yürüterek particles_exported.cs dosyasını .star biçimine dönüştürün: csparc2star.py particles_exported.cs particles_exported.star
7. RELION-3'te, Manuel Malzeme Çekme sekmesine tıklayın ve G/Ç sekmesinde, adım 6.4'te açıklanan CTF iyileştirmesinden mikrografları girin. Görüntü sekmesinde şu parametreleri girin: Partikül çapı (A): 220, Lowpass Filtresi (A): -1, CTF görüntüsü için ölçek: 0,5. İşi çalıştırın . RELION-3 giriş klasöründe ManualPick adlı bir dizin oluşturulur.
   NOT: Bu adım, RELION-3'te el ile toplama klasörü yapısı oluşturmak için gerçekleştirilir. El ile toplama çalıştırılırken, RELION-3 GUI'sinde toplama için kullanılan her ortalama mikrograf için toplanan parçacıkların koordinatlarını içeren tek bir .star dosyası oluşturulur.
8. Adım 6.6'dan particles_exported.star dosyasını içeren klasöre gidin ve adım 6.5'te dışa aktarılan son 2B sınıflandırmaya katkıda bulunan kriyo-SPARC v3 parçacıklarının toplanması için kullanılan her ortalama mikrograf için tek bir manualpick.star dosyası üreten ev yapımı bir komut dosyası çalıştırın. Elde edilen koordinat dosyaları ManualPick/Movies klasörüne kaydedilir.
9. RELION-3'e dönün ve El ile Malzeme Çekme işini yeniden açın. Devam'a tıklayın. Bu, daha önce RELION-3 GUI'de cryoSPARC v3'te toplanan parçacıkları gösterecektir. Parçacık koordinatlarının transferinin gerçekleştirilip gerçekleştirilmediğini ve parçacıkların uygun şekilde seçilip seçilmediğini doğrulamak için birkaç mikrografı inceleyin.

7. RELION-3 - Partikül ekstraksiyonu ve 2D sınıflandırma

1. Partikül Ekstraksiyonu'na tıklayın. G/Ç sekmesinde, adım 6.4'teki CTF düzeltilmiş mikrografları ve adım 6.9'daki koordinatları girin. Extract sekmesine tıklayın ve Parçacık Kutusu Boyutu'nu (pix) 300 olarak değiştirin. İşi çalıştırın.
2. Daha yüksek çözünürlüklü bir rekonstrüksiyon elde etmek için cryoSPARC v3'te üretilen partikül setini daha da temizlemek için 2D sınıflandırma gerçekleştirin. 2B Sınıflandırma'ya tıklayın ve G/Ç sekmesine tıklayın, adım 7.1'de oluşturulan particles.star dosyasını girin. Optimizasyon sekmesinde, Sınıf Sayısı'nı 50 ve Maske Çapı'nı (A) 280 olarak ayarlayın. İşi çalıştırın .
   NOT: Maske tüm parçacığı kapsamalıdır.
3. En iyi 2B sınıfları seçmek için Alt Küme Seçimi yöntemine tıklayın, adım 7.2'den _model.star dosyasını girin ve İşi çalıştırın . Adım 4.2'de açıklandığı gibi sınıfları seçin.
4. Yakınsak olmayan parçacıkları kaldırmak için 7.2 ve 7.3 numaralı adımları yineleyin.

8. RELION-3 - 3D iyileştirme, maske oluşturma ve son işlem

1. cryoSPARC v3'te (adım 5.2) oluşturulan haritayı RELION-3'te 3B iyileştirme için ilk model olarak kullanın. İçe Aktarma yöntemini seçin ve G/Ç sekmesinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Ham Filmleri/Mikrografları İçe Aktar: Hayır, Ham Giriş Dosyaları: Filmler/*.mrc.
2. MTF dosyasını sağlayın ve adım 1.3'te açıklandığı gibi film alma parametrelerini girin. Diğerleri sekmesinde, giriş dosyası olarak cryoSPARC v3 eşlemesini seçin, Düğüm Türü'nü 3B başvuru (.mrc) olarak değiştirin ve İşi çalıştırın .
3. 3B Otomatik Hassaslaştır'ı seçin ve G/Ç sekmesinde, Adım 7.3'ten veya son seçim işinden particles.star dosyası olarak Giriş Görüntüleri'ni ayarlayın. CryoSPARC v3 rekonstrüksiyonunu Referans Haritası olarak verin. Referans sekmesine tıklayın ve İlk Düşük Geçişli filtreyi (Å) 50 olarak ve Simetri'yi ikosahedral olarak değiştirin. Optimizasyon sekmesinde, Maske Çapı'nı (Å) 280 olarak değiştirin ve işi çalıştırın.
4. Koşu bittikten sonra UCSF Chimera'da run_class001.mrc'yi açın.
5. UCSF Chimera'da Araçlar'a tıklayın ve Birim Verileri altında Birim Görüntüleyici'yi seçin. Bu, ses ayarlarını yapmak için yeni bir pencere açacaktır. Adım'ı 1 olarak değiştirin ve haritada gürültü olmadığı seviye değerine ulaşana kadar kaydırıcıyı ayarlayın. Bir sonraki adımda maske oluşturmak için kullanılacağı için bu değeri kaydedin.
6. Otomatik arıtmadan üretilen harita gerçek FSC'yi yansıtmaz, çünkü çevreleyen çözücüden gelen gürültü çözünürlüğü düşürür. İşlem sonrası işlemden önce, numuneyi çözücü bölgesinden ayırt etmek için bir maske oluşturun.
   1. Maske Oluşturma'ya tıklayın ve adım 8.3'ten run_class001.mrc girin.
   2. Maske sekmesine tıklayın ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın: Lowpass Filtre Haritası (Å): 10, Piksel Boyutu (Å): 1.045, İlk Binarizasyon Eşiği: adım 8.5'te elde edilen düzey değeri, İkili Eşlemeyi şu kadar Pikselle Genişlet: 3 ve Bu kadar Pikselin Yumuşak Kenarını Ekle: 3. İşi çalıştırın.
7. UCSF Chimera'daki maskeyi inceleyin. Maske çok sıkıysa, İkili Eşlemeyi bu kadar Piksele Genişlet seçeneğini artırın ve/veya Bu kadar Pikselin Yumuşak Kenarını Ekleyin. Keskin bir maske aşırı takılmaya neden olabileceğinden, yumuşak kenarlı bir maske oluşturmak önemlidir.
8. İşlem Sonrası ve G/Ç sekmesine tıklayın, adım 8.3'te oluşturulan yarım haritaları girin ve 8.6'dan maskeleyin. Kalibre Edilmiş Piksel Boyutu'nu 1,045 şolarak ayarlayın. Keskinleştir sekmesinde aşağıdakileri girin: B-Faktörünü Otomatik Olarak Tahmin Et?: Evet, Otomatik B Sığdırma (A) için En Düşük Çözünürlük: 10, Kendi B-Faktörünüzü Kullanın?: Hayır. Filtre sekmesinde, FSC Ağırlıklandırmayı Atla? öğesini Hayır. İşi çalıştır olarak ayarlayın.

9. RELION-3 - Parlatma eğitimi ve partikül parlatma

1. Parçacık demeti kaynaklı hareketi düzeltmeden önce, önce veri kümesi için en uygun hareket izlerini tanımlamak üzere eğitim modunu kullanın. Bayesian Parlatma'yı açın ve G/Ç sekmesinde, adım 6.3'teki hareket düzeltmeli mikrografları, adım 8.3'teki parçacıkları ve adım 8.8'den işlem sonrası .star dosyasını girin. Eğitim sekmesine tıklayın ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: En Uygun Parametreleri Eğit : Evet, Test için Fourier Piksellerinin Kesri: 0,5, Şu kadar Parçacığı kullanın: 5000. İşi çalıştırın .
   NOT: Bu komut dosyası, RELION-3 Polish klasöründe, aşağıdaki adımı yürütmek için gereken optimize edilmiş parlatma parametrelerini içeren opt_params_all_groups.txt dosyası oluşturur.
2. Eğitim işi bittiğinde, Bayes Parlatma'ya tıklayın. Eğitim sekmesine tıklayın ve En Uygun Parametreleri Eğit? öğesini Hayır olarak ayarlayın. Lehçe sekmesini seçin ve En İyileştirilmiş Parametre Dosyası'nda adım 9.1'den itibaren opt_params_all_groups.txt dosyasının yolunu belirtin. Çalıştır'a tıklayın.
3. 3B iyileştirmeyi (adım 8.3) ve son işlemeyi (adım 8.8) bir dizi cilalı parçacıkla tekrarlayın.

10. RELION-3 - CTF ve parçacık başına iyileştirmeler

1. Daha yüksek dereceli sapmaları tahmin etmek için CTF Ayrıntılandırması'nı açın ve Parçacıklar altındaki G/Ç sekmesinde, son Hassaslaştırma 3B işinden (run_data.star) cilalanmış parçacıklar içeren .star dosyasının yolunu seçin.
   1. Postprocess Yıldız Dosyası altında, en son işlem sonrası işin çıktısının yolunu ayarlayın (adım 9.3).
   2. Sığdır sekmesini seçin ve aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Tahmin (Anizotropik Büyütme): Hayır, CTF Parametre Sığdırma Gerçekleştir? Hayır, Beamtilt'i tahmin edin: Evet, ayrıca Trefoil'i de tahmin edin? Evet, 4^. Dereceden Abberasyonları Tahmin Edin? Evet. İşi çalıştırın.
2. Önceki işte (particles_ctf_refine.star) oluşturulan giriş parçacıkları (Refine3D'den) olarak kullanarak adım 10.1'i yineleyin. Sığdır sekmesinde, Tahmin'i (Anizotropik Büyütme) Evet olarak değiştirin ve İşi çalıştırın .
3. Önceki işte (particles_ctf_refine.star) üretilen giriş parçacıkları (Refine3D'den) olarak kullanarak adım 10.2'yi yineleyin. Sığdır sekmesinde aşağıdaki parametreleri ayarlayın: Tahmin (Anizotropik Büyütme): Hayır, CTF Parametre Uydurma Gerçekleştir?: Evet, Bulanıklaştırmayı Sığdır?: Parçacık başına, Astigmatizmaya Uy? Mikrograf başına, Fit B-faktörü?: Hayır, Fit Phase-Shift: Hayır, Estimate Beamtilt?: Hayır, Estimate ^4th Order Anormalrations?: Hayır. Çalıştırın.
   NOT: Parçacığın yeterli kontrasta sahip olduğu göz önüne alındığında, Astigmatizmaya Uy? sekmesi Parçacık Başına olarak ayarlanabilir. Bu veri kümesi için, Parçacık Başına astigmatizma arıtması, haritanın kalitesini ve çözünürlüğünü iyileştirmedi.
4. Adım 10.3'teki parçacıklarla 3B iyileştirmeyi tekrarlayın ve G/ Ç sekmesinde Solvent Düzleştirilmiş FSC'ler Kullan? öğesini evet olarak ayarlayın. Çalıştırmayı bitirdiğinizde, bir işlem sonrası işi yürütün (adım 8.8) ve haritayı UCSF Chimera'da inceleyin (adım 5.2).

11. RELION-3 parçacık koordinatlarının ve 3D haritanın Scipion 3'e aktarılması

1. RELION-3 haritasını daha da hassaslaştırmak ve doğrulamak için, önce son işlem sonrası işteki (adım 10.4) hacmi ve parçacıkları Scipion 3'e aktarın. Scipion 3'ü başlatın ve yeni bir proje oluşturun.
2. Sol Protokoller panelinde, İçe Aktarmalar açılır menüsünü seçin ve Parçacıkları İçe Aktar'a tıklayın. Aşağıdaki parametreleri değiştirin: İçe Aktar: RELION-3, Yıldız Dosyası: postprocess.starve adım 1.3'teki gibi alma parametrelerini belirtin. Yürüt'e tıklayın.
3. İçe Aktarmalar açılır menüsüne tıklayın ve Birimleri İçe Aktar'ı seçin. İçe Aktar altında, RELION-3 haritasının yolunu verin. Piksel boyutunu (örnekleme hızı) Å/px değerini 1,045 olarak değiştirin ve uygulayın.

12. Scipion 3 - Yüksek çözünürlüklü iyileştirme

1. İlk olarak, genel bir hizalama gerçekleştirin. Protokoller panelinde İyileştir açılır menüsünü seçin ve Xmipp3 - highres24'e tıklayın. İçe aktarılan parçacıkları ve hacimleri sırasıyla 11.2 ve 11.3 adımlarından Tam Boyutlu Görüntüler ve Başlangıç Hacimleri olarak girin ve Simetri Grubunu ikosahedral olarak ayarlayın. Açısal Atama altındaki Görüntü Hizalama sekmesinde Genel'i seçin ve Maksimum Hedef Çözünürlüğü'nü 3 şolarak ayarlayın ve İşi çalıştırın.
2. İş bittiğinde, Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. Yeni pencerede, rafine edilmiş hacmi incelemek için UCSF Chimera simgesine tıklayın. Ek olarak, iyileştirmeden sonra FSC'nin nasıl değiştiğini görmek için Görüntü Çözünürlüğü Grafikleri'ne (FSC) ve Euler açı atamalarının değişip değişmediğini görmek için Açısal Değişikliklerle Grafik Histogramı'na tıklayın.
   NOT: Giriş RELION-3 yapısının çözünürlüğüne bağlı olarak, bu adım Açısal Atama sekmesi altındaki Maksimum Hedef Çözünürlüğü için ayarlanan farklı değerlerle birkaç kez yinelenebilir. Daha fazla bilgi için Scipion ^{öğreticisine25} bakın.
3. Adım 12.1'i yerel bir hizalamayla yineleyin. Önceki işi kopyalayın ve Önceki Çalıştırmayı Seç'i Xmipp3 - highres Global olarak değiştirin. Açısal Atama sekmesinde, Görüntü Hizalaması'nı Yerel olarak değiştirin. Maksimum Hedef Çözünürlüğünü 2,1 şolarak ayarlayın.
4. UCSF Chimera'daki rafine haritayı inceleyin ve FSC ve açısal atamalardaki değişimi analiz edin (adım 12.2). Çözünürlük düzelmeyene ve açısal atamalar birleşene kadar yerel iyileştirmeyi yineleyin ve Maksimum Hedef Çözünürlüğünü gerektiği gibi ayarlayın.
5. Scipion 3'ün çıkış haritası ayrıca ^Phenix26'da yoğunluk modifiye edilebilir ve keskinleştirilebilir.

13. Scipion 3 - Harita doğrulama

1. Xmipp3 - highres'te oluşturulan son haritanın yerel çözünürlüğünü inceleyin. Xmipp - yerel ^MonoRes27'yi açın ve adım 8.6'da oluşturulan önceki işin ve maskenin son birimini girin. Çözünürlük Aralığı'nı 0,1 şaralıklarla 1 ila 6 şarasında ayarlayın ve İşi yürütün.
2. Çalışmayı bitirdiğinizde, Sonuçları Analiz Et'e tıklayın ve çözünürlükle renklendirilmiş çözünürlük histogramını ve hacim dilimlerini inceleyin.
3. Parçacıkların iyi hizalanmış olup olmadığını görmek için Multireference Alignability28'i açın ve adım 12.3'ten itibaren parçacıkları ve hacmi girin. Doğrulama grafiğini görüntülemek için Sonuçları Analiz Et'e tıklayın. İdeal olarak, tüm noktalar (1.0,1.0) etrafında kümelenmelidir.
4. Xmipp3'ü açın - Aşırı Sığmayı Doğrulayın. Adım 12.3'teki parçacıkları ve hacimleri girin. Çalışmayı bitirdiğinde, sonuçları analiz edin ve aşırı uygun grafiği inceleyin. Hizalanmış Gauss gürültüsünün ve hizalanmış parçacık eğrilerinin çaprazlanması, aşırı uyumu gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Üç farklı işleme platformu kullanarak yüksek çözünürlüklü bir yapı elde etmek için kapsamlı bir SPA boru hattı sunduk: cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. Şekil 1 ve Şekil 4, genel işleme iş akışını özetler ve Tablo 1, iyileştirme protokollerini ayrıntılarıyla açıklar. Bu protokoller, AAV'nin 2.3 şyapısının iyileştirilmesi sırasında kullanıldı ve Nyquist çözünürlüğüne yakın bir çözünürlük eld...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu makalede, yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için çeşitli yazılım platformlarında kriyo-EM veri işleme için sağlam bir SPA iş akışı sunuyoruz (Şekil 1). Bu iş akışı çok çeşitli biyolojik makromoleküllere uygulanabilir. Protokolün sonraki adımları, film ön işleme, parçacık toplama ve sınıflandırma ve yapı iyileştirmeleri (Tablo 1) ve doğrulama için çoklu yöntemler dahil olmak üzere

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	https://cryosparc.com/
CTFFIND 4	Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School	https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4
MotionCorr2	UCSF Macromolecular Structure Group	https://msg.ucsf.edu/software
Phenix	Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC)	http://www.phenix-online.org/
PyEM	Univerisity of California, San Francisco	https://github.com/asarnow/pyem
RELION	MRC Laboratory of Structural Biology	https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page
Scipion	Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab	http://scipion.i2pc.es/
UCSF Chimera	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/