Farelerde Ağrı Davranışını Ölçmek için Mekanik Çatışmadan Kaçınma Testi

Özet

Mekanik çatışmadan kaçınma testi, farelerde ağrı duyarlılığının refleksif olmayan bir okuması olarak kullanılır ve çeşitli fare ağrısı modellerinde duygusal-motivasyonel tepkileri daha iyi anlamak için kullanılabilir.

Özet

Ağrı hem duyusal (nosiseptif) hem de duygusal (hoş olmayan) boyutlardan oluşur. Preklinik modellerde, ağrı geleneksel olarak ağrının nosiseptif bileşeni ile ilgili çıkarımlara izin veren, ancak ağrının duygusal veya motivasyonel bileşeni hakkında çok az bilgi sağlayan refleksif testler kullanılarak değerlendirilmiştir. Bu nedenle, ağrının bu bileşenlerini yakalayan testler geliştirmek translasyonel olarak önemlidir. Bu nedenle, araştırmacıların ağrı algısını bu düzeyde incelemek için refleksif olmayan davranışsal testler kullanmaları gerekir. Mekanik çatışmadan kaçınma (MCA), 3 odacıklı bir paradigmada zararlı bir mekanik uyarana motivasyonel tepkileri incelemek için kurulmuş gönüllü bir refleksif olmayan davranış testidir. Bir farenin konum tercihindeki bir değişiklik, rakip zararlı uyaranlarla karşı karşıya kaldığında, pençelerin dokunsal uyarımına karşı parlak ışığın algılanan tatsızlığını çıkarmak için kullanılır. Bu protokol, ağrı araştırmacılarının çeşitli fare ağrısı modellerinde duygusal-motivasyonel tepkileri anlamak için kullanabilecekleri MCA testinin değiştirilmiş bir versiyonunu özetlemektedir. Burada özel olarak tanımlanmamış olsa da, örnek MCA verilerimiz, MCA prosedürünü göstermek için ağrı modelleri olarak intraplantar tam Freund adjuvanını (CFA), korunmuş sinir hasarını (SNI) ve bir kırık / döküm modelini kullanır.

Giriş

Ağrı, duyusal ve duygusal bileşenlerle ilgili karmaşık bir deneyimdir. Ağrı algısı eşiğinde bir azalma ve termal ve / veya mekanik uyaranlara aşırı duyarlılık, uyaranla uyarılan ağrı davranış testlerinin yakalayabileceği bu deneyimin temel özellikleridir (Hargreaves'in ısı duyarlılığı testi ve von Frey mekanik duyarlılık testi gibi)^1,2. Bu tür testler sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar vermesine rağmen, algılanan zararlı bir uyarandan refleksif geri çekilmeye güvenmeleri ile sınırlıdır. Bu, yalnızca bu testlere devam eden ağrı araştırmalarına güvenmeyi sorgulamıştır. Bu amaçla, ağrı araştırmacıları birkaç yıldır ağrının duygusal ve / veya motivasyonel bileşenlerinin daha fazlasını yakalamak için kemirgen ağrı modellerinde kullanılmak üzere alternatif / tamamlayıcı davranış testlerini araştırmaktadır. Bu uyarılmamış, gönüllü veya refleksif olmayan önlemler (örneğin, tekerlek koşma, yuvalama aktivitesi, şartlı yer tercihi ^3,4,5), klinik öncesi ağrı araştırmalarının çevrilebilirliğini geliştirmek amacıyla uygulanmaktadır.

Mekanik çatışmadan kaçınma (MCA) testi ilk olarak Harte ve ark. tarafından 2016^{yılında 6}, ağırlıklı olarak sıçanlarda ^7,8'de kullanılır ve daha önceki bir yaklaşımın bir modifikasyonunu temsil eder - yerden kaçınma paradigması. Bu yaklaşımda, arka pençenin zararlı bir uyaranı, hayvanın bu tür bir uyarımdan kaçmak / kaçınmak için amaçlı davranışlarını yönlendirmek için başka türlü arzu edilen (karanlık) bir odada gerçekleştirilir ^9,10. MCA testi, arka pençenin bir gözlemci tarafından manuel olarak zararlı bir şekilde uyarılmasına güvenmek yerine, fareleri engelleyici bir ortamdan kaçmak ve karanlık odaya ulaşmak için potansiyel olarak zararlı bir uyaranı müzakere etmeye zorlar. Tahlil testine adını veren çatışma / kaçınma şu iki rakip motivasyondan kaynaklanmaktadır: parlak aydınlatılmış alanlardan kaçmak ve pençelerin zararlı uyarılmasından kaçınmak. MCA testi ayrıca, ağrı kesici çevresel ipuçlarıyla eşleştirilmesinin, ağrı kesici / ödüllendirici bağlam¹¹ için bir tercihi yansıtan davranış değişikliklerini yönlendirdiği şartlı yer tercihi testi ile özellikleri de paylaşır.

Temel olarak konuşursak, tüm bu analizler benzer bir yaklaşımı paylaşır: bir hayvanın bir aversif ortamı diğerine tercih etmesinde, duygusal / motivasyonel durumlarının bir göstergesi olarak bir kayma kullanmak. MCA testi, parlak bir şekilde aydınlatılmış bir odadan ve ardından ayarlanabilir yükseklik problarına sahip karanlık bir orta odadan ve herhangi bir engelleyici uyaran içermeyen karanlık bir üçüncü odadan oluşan 3 odalı bir paradigmadır. Yaralanmamış bir fare, kemirgenlerin parlak ışığa doğuştan gelen isteksizliği göz önüne alındığında, tipik olarak karanlık bir odaya kaçmak için motive edilir¹². Bu örnekte, parlak aydınlatılmış bir ortamdan kaçmak için doğal motivasyon, yalnızca karanlık ortamda meydana gelen arka pençe stimülasyonuyla (ayarlanabilir yükseklik probları) karşılaşma konusundaki isteksizliğin üstesinden gelir. Buna karşılık, ağrı yaşayan bir fare (örneğin iltihaplanma veya nöropati nedeniyle), parlak aydınlatılmış ortamda daha fazla zaman geçirmeyi tercih edebilir, çünkü devam eden dokunsal aşırı duyarlılık ortamında mekanik probların hoş olmayan dokunsal deneyiminden kaçınmak için motivasyon vardır.

Bu makalede, MCA testinin değiştirilmiş bir sürümü açıklanır. Orijinal yöntemi (sıçanlarda^{gerçekleştirilen 6}) farelerde kullanılmak üzere uyarladık. Ayrıca, veri toplamayı kolaylaştırmak için test edilen prob yüksekliklerinin sayısını altıdan üçe (zemin yüksekliğinden 0, 2 ve 5 mm yüksek) düşürdük. Bu yaklaşım çoklu ağrı modellerinde test edilmiş ve bilinen analjeziklerle doğrulanmıştır, bu da ağrı aşırı duyarlılığının ve / veya ilişkili duygusal ve motivasyonel değişikliklerin davranıştaki bu değişiklikleri yönlendirdiğini göstermektedir. Bu yaklaşımın uygulanması nispeten hızlıdır ve diğer refleksif olmayan önlemlerle karşılaştırıldığında uyarlanabilir, bu da günlerce süren alışkanlık ve eğitim ^1,2 gerektirebilir. Diğer ağrı ölçümleriyle uyum içinde, MCA ağrının duygusal ve motivasyonel yönleri hakkında değerli bilgiler üretebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Farelerin kullanımını içeren tüm deneyler ve burada izlenen prosedürler, MD Anderson Kanser Merkezi ve Stanford Üniversitesi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na sıkı sıkıya bağlı kalınarak onaylanmıştır.

1. MCA inşaatı

1. Aşağıdaki boyutlarda yapı haznesi 1: 125 mm x 125 mm x 125 mm (genişlik x derinlik x yükseklik) yan duvarlar, zemin, tavan için kullanılan opak beyazdan 3 mm kalınlığında akrilik. Öne bakan duvar için 3 mm kalınlığında şeffaf bir akrilik kullanın. Özel akrilik yapıştırıcı kullanarak her tarafı önceden birbirine yapıştırın.
   DİKKAT: Akrilik yapıştırıcı tehlikeli madde olarak kabul edilir (yanıcı, buhara zararlı, yutulduğunda zararlı olabilir, cildi veya gözleri tahriş edebilir). Bu tür yapıştırıcılar yalnızca üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılmalıdır (yani, iyi havalandırılan bir alanda uygun KKD ile).
2. Oda 1'in kapağını bir menteşe ile takın, böylece fareler odaya kolayca yerleştirilebilir ve odadan alınabilir. ~ 4800 lüks aydınlatma sağlamak için kapağın iç yüzeyine kendinden yapışkanlı ışık yayan diyot (LED) bandı takın.
3. Opak bir akrilik levhayı yerine ve konumundan kaydırarak MCA'nın geri kalanından 1 numaralı odayı kapatın.
4. MCA test odasını, oda 2'yi, her tarafta yarı saydam koyu kırmızı akrilikten (3 mm kalınlığında) imal edilmiş, üstte menteşeli bir kapak bulunan 270 mm uzunluğunda aydınlatılmamış bir oda olarak inşa edin. 2 no'lu odanın tabanına, içinden 0,5 mm çapında uçlara sahip bir dizi künt probun (örneğin, körelmiş harita pimleri) çıkıntı yapabileceği 2 mm'lik deliklerden oluşan 13 x 31 ızgara yerleştirin.
   NOT: 120 kumlu zımpara kağıdı bloğu veya benzeri bir yapıya sahip kör pimler. Sporisidal dezenfektan ile dezenfekte edilmeden önce deterjanla ılık suda temizleyin.
5. Prob taban plakasının altına ilave akrilik levhalar yerleştirerek probların yüksekliğini ayarlayın (Şekil 1). Bu yaklaşımı kullanarak cihazı üç ayarla yapılandırın: 0 mm, 2 mm ve 5 mm prob yüksekliği.
6. Körelmiş harita pimlerine veya benzer malzemelere alternatif olarak, oda 2'nin zeminini ve prob plakasını yazdırmak için 3D yazıcı dosyalarını kullanın (bkz. Ek Dosya 1: mekanik problara atıfta bulunan SpikeBed-MCA.stl ve Ek Dosya 2: oda 2'nin tabanını oluşturan MCA_baseplate.stl).
   NOT: 3D baskı mevcut değilse, cihazın duvarlarını inşa etmek için kullanılan aynı akrilik yapıştırıcıyı kullanarak pimleri akrilik bir tabakaya sabitleyin.
7. Naylon 12 plastik veya benzeri gibi yıkanabilir ve biyouyumlu bir malzemeyle yazdırın (önerilir).
8. Aşağıdaki boyutlarda yapı haznesi 3: 125 mm x 125 mm x 125 mm, ışıksız yarı saydam koyu kırmızı akrilik kutu olarak (her tarafta), oda 1'in karşı ucuna yerleştirilmiştir. Odaya, oda 1 ve 2'ye benzer şekilde menteşeli bir kapak yerleştirin. Bu oda, oda 2'deki mekanik problardan karanlık bir kaçış alanı görevi görür.

2. Fare MCA alışkanlığı ve testi

1. Hayvanlarda davranışsal sonuçları içeren tüm deneylerde olduğu gibi, potansiyel önyargıyı en aza indirmek için uygun randomizasyonu ve körleşmeyi gözlemleyin.
   NOT: Temsili sonuçlar 8-12 haftalık erkek ve dişi C57BL/6J fareler kullanılarak elde edilmiştir (Jackson Laboratuvarları suş numarası 000664). Fareler, kafes başına 5'e kadar, yiyecek ve su ad libitumuna erişim ve 07: 00 saat ila 19: 00 saat ışık döngüsü ile sosyal olarak barındırıldı. MCA, ışık döneminde, saat 09:00 ile 12:00 arasında gerçekleşti.
2. Temel testlerin planlanmadan bir gün önce, tüm cihazın sosyal keşfini kolaylaştırmak için fareleri kafes arkadaşlarıyla birlikte 5 dakika (minimum) ila 15 dakika (maksimum) boyunca MCA ünitesine alıştırın.
3. İşlem boyunca, oda 1'deki LED'lerin kapatıldığından, oda 1 ve 2 arasındaki bariyerin açık bırakıldığından ve probların sıfır yüksekliğe ayarlandığından (yani, oda 2'nin tabanından çıkıntı yapmadığından) emin olun.
4. Çalışma negatif kontrol hayvanlarını içeriyorsa (yani, sahte cerrahi veya araç enjeksiyon kontrolleri) farelerin temel bir testini (isteğe bağlı) gerçekleştirin. İstenirse, oda 2'ye asla geçmeyen yaralanmamış aykırı değerleri hariç tutmak için bir taban çizgisi testi kullanın, ancak bunun gerekli olduğu kanıtlanmamıştır. Kullanılıyorsa, hariç tutulma için tüm ölçütleri ve hariç tutulan fare sayısını bildirin.
   1. Teste başlamadan önce, tüm MCA cihazının yana bakan görünümüyle bir tripoda 1080p çekim yapabilen bir video kamera kurun. Görüş alanını, MCA kaydedilen görüntüyü dolduracak şekilde ayarlayın.
   2. Kayıt başladıktan sonra, videonun başlangıcını hayvanın test çalışmasıyla ilgili tanımlayıcı bilgilerle (ör. fare kimliği, prob yüksekliği, tarih, saat noktası vb.) etiketlemek için kameranın görüş alanında elde taşınan bir kuru silme panosu tutun.
   3. İlk çalıştırma için prob yüksekliğini sıfıra ayarlayın. Test edilecek fareyi ev kafesinden bariyer kapısı yerinde olacak şekilde oda 1'e aktarın. Kaydedilen çekimde görünen bir zamanlayıcı başlatın.
      NOT: Zamanlayıcı, testin farklı bölümleri arasındaki aralıkların çalıştırmalar arasında tutarlı olmasını sağlar.
   4. 10 sn sonra, oda 1 LED'lerini açın. Fare 20 saniye boyunca yanan odada kaldıktan sonra, 1 ve 2 numaralı odalar arasındaki bariyeri geri çekin.
   5. Hayvanı 2 dakika boyunca gözlemleyin. Test devam ederken gecikme sürelerini ve/veya bekleme sürelerini bir kronometre ile ölçün. Alternatif olarak, test tamamlandıktan sonra video görüntüleri analiz edilebilir.
      NOT: Verim ve engelleyici uyaranlara uzun süre maruz kalmaktan kaçınma nedenleriyle, kesinti 2 dakika olarak ayarlandı.
   6. Tanımlanmış birkaç yararlı sonuçtan birini veya birkaçını ölçün (aşağıya bakın; Şekil 1). Belirli bir deney düzeneğinde davranışın hangi yönlerinin farklı olduğunu belirlemek için teste başlarken 5 sonuç ölçütünün tümünü analiz etmeniz önerilir.
      1. Seçenek I: Oda 2'ye ilk girişteki gecikmeyi kaydedin. Seçenek II: Oda 2'nin yarısından fazlasını geçme gecikmesini kaydedin. Seçenek III: Toplam bekleme süresini 2 numaralı odaya kaydedin. Seçenek IV: Oda 3'e ulaşmak için gecikmeyi kaydedin (kaçış). Seçenek V: Seçenek II'ye benzer şekilde, her odadaki toplam bekleme süresini 2 dakika içinde kaydedin ve bunları oranlara dönüştürün.
         NOT: Her deney benzersiz olduğundan ve hastalık modeline özgü biyolojik faktörlerden ve davranış değişikliklerinden etkilenebileceğinden, araştırmacılar bu ve diğer önlemleri kendi ellerinde deneyebilirler.
   7. Test tamamlandıktan sonra, fareyi ev kafesine geri getirin, MCA odalarını% 70 etanol ile temizleyin ve tamamen kurumasını bekleyin.
      NOT: Fekal boli genellikle etanol/dezenfektan önce kağıt havlularla odadan nispeten kolay bir şekilde temizlenebilir. Daha kapsamlı temizlik gerekli hale gelirse, oda 2 ve 3 sökülebilir ve ılık, sabunlu suya batırılabilir.
   8. Tüm fareleri prob yüksekliği sıfıra ayarlanmış bir kohortta çalıştırdıktan sonra, mekanik prob taban plakasının altına 3 mm'lik bir akrilik levha yerleştirin ve 2 mm'lik bir prob yüksekliği ile 2.4.2 ila 2.4.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
   9. Prob yüksekliği 2 mm'ye ayarlanmış tüm fareleri çalıştırdıktan sonra, prob taban plakasının altına ikinci bir 3 mm akrilik tabaka yerleştirin ve prob yüksekliği 5 mm olan 2.4.2 ila 2.4.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
      NOT: 8 fareden oluşan bir grup, bu yaklaşım kullanılarak yaklaşık 2 saat içinde test edilebilir. Daha kesin ilaç sonrası zamanlama gerekiyorsa daha küçük grup boyutları kullanın (örneğin, bir ilaç zamanı kursu deneyi için).
   10. Bir test seansının sonunda bir dezenfektan ile son bir temizlik yapın.
5. Ağrıya aşırı duyarlılığı indükledikten sonra ve / veya ilaç tedavisi ile testi tekrarlayın.
6. Her farenin performansını, başlangıçta ağrı indüklendikten sonraki performanslarıyla karşılaştırın. Farmakolojik bir müdahalenin etkisini, araçla tedavi edilen hayvanları ilaçla tedavi edilen hayvanlarla aynı zaman noktasında karşılaştırarak değerlendirin.
7. Hayvanlar istenen sonuç ölçüsünü yerine getirmeden 2 dakikalık kesime ulaşırsa ve sürekli olmayan verilerle sonuçlanırsa, parametrik olmayan istatistiksel analiz (örneğin, Mann Whitney U Testi) gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

MCA testi, mekanik olarak farklı birkaç fare ağrısı modeliyle başarıyla kullanılmıştır. Şekil 2, seçilen sonuç ölçüsünün oda 2'nin orta noktasını geçtiği verileri göstermektedir (Şekil 2A). Yarım nokta ve oda 3'e kaçış kullanılarak elde edilen veriler çok benzerdir, 5 mm prob yüksekliği¹³ olan nöropatik ağrının korunmuş sinir hasarı (SNI) modelinde oda 3 kaçışı için ~ 40 s, yarı yol için ~ 40 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Tüm davranış testlerinde olduğu gibi, hayvanların tedavisine uygun kullanım, randomizasyon ve körleştirme baştan sona esastır. Karmaşık davranışlara ve karar vermeye yönelik çok faktörlü girdiler göz önüne alındığında, hayvanların sıkıntıyı en aza indirirken mümkün olduğunca tutarlı bir şekilde ele alınması, alışkanlık haline getirilmesi ve test edilmesi zorunludur. Fare yerleştirme zamanlamasını oda 1'e yeniden üretmek, LED ışıklarını açmak ve bariyeri kaldırmak için d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
32.8ft 3000K-6000K Tunable White LED Strip Lights, Dimmable Super Bright LED Tape Lights with 600 SMD 2835 LEDs	Lepro	SKU: 410087-DWW-US	For lighting chamber 1. https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D printed 'spike bed' and 'chamber 2 floor'	Shapeways	N/A	Optional, for mechanical probes as an alternative to blunted map pins.
70% ethanol	Various	N/A	To clean MCA between mice.
Acryl-Hinge 2	TAP Plastics	N/A	for attaching chamber lids to rear walls. https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast Cast Acrylic Sheet, Clear	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For front wall of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast Cast Transparent Colored Acrylic, Transparent Dark Red - 50%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. 50% light transmission. For walls and lids of chambers 2 and 3. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast Translucent & Opaque Colored Cast Acrylic, Sign Opaque White - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3mm thick. For side walls and lid of chamber 1. https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
Disinfectant (e.g. Quatricide)	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	To disinfect MCA at the end of a testing session.
Dry-erase markers and board	Various	N/A	To add experimental info to the beginning of video footage.
Map pins	Various	N/A	Optional, for mechanical probes. Use sandpaper to blunt sharp points before use. Can be used in place of 3D-printed parts.
Paper towels	Various	N/A	To clean/disinfect MCA.
SCIGRIP Weld-On #3 Acrylic Cement	TAP Plastics	N/A	For assembling acrylic sheets into chambers and affixing hinges. https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
Stopwatch	Various	N/A	To record escape latencies/dwell times in real-time or from recorded video.
Timer	Various	N/A	To ensure LED turn-on, barrier removal and test completion are timed consistently.
Video camera	Various	HDRCX405 Handycam Camcorder	To record mouse behavior in the MCA device. Can be substituted with any consumer-grade video camera capable of 1080p resolution.
Tripod	Famall	N/A	Any tripod that can hold the camera at bench height for recording MCA footage is acceptable.