JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı kullanarak, demiyelinizan hastalıkların hayvan modellerinde birincil mikrogliayı izole etmek ve saflaştırmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Beyindeki yerleşik doğuştan gelen bağışıklık hücreleri olan mikroglia, merkezi sinir sistemindeki (CNS) iltihaplanma veya yaralanmaya birincil yanıt verenlerdir. Mikroglia dinlenme durumuna ve aktif duruma ayrılabilir ve beynin mikro ortamına yanıt olarak durumu hızla değiştirebilir. Mikroglia farklı patolojik koşullar altında aktive olacak ve farklı fenotipler sergileyecektir. Ek olarak, aktif mikroglianın birçok farklı alt grubu ve farklı alt gruplar arasında büyük heterojenlik vardır. Heterojenlik esas olarak mikroglia'nın moleküler özgüllüğüne bağlıdır. Çalışmalar, mikroglia'nın aktive olacağını ve inflamatuar demiyelinizasyonun patolojik sürecinde önemli bir rol oynayacağını ortaya koymuştur. Multipl skleroz ve nöromiyelit optika spektrum bozukluğu gibi inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın özelliklerini daha iyi anlamak için perilezyonel primer mikroglial sıralama protokolü öneriyoruz. Bu protokol, yüksek oranda saflaştırılmış primer mikroglia elde etmek ve mikroglia'nın moleküler özelliklerini korumak için kolumnar manyetik aktive hücre sıralamayı (MACS) enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglia'nın potansiyel etkilerini araştırmak için kullanır.

Giriş

Mikroglia, embriyonik beyne çok erken ulaşan ve CNS 1,2'nin gelişimine katılan yumurta sarısı kesesi progenitörlerinden kaynaklanır. Örneğin, sinaptik budama3 ve aksonal büyümeyi düzenleyen4'te rol oynarlar. Nöronal sağkalımı destekleyen ve nöronal lokalizasyona yardımcı olan faktörleri salgılarlar5. Aynı zamanda, normal beyin gelişimini sağlamak için anormal hücrelerin ve apoptotik hücrelerin çıkarılmasında rol oynarlar6. Ek olarak, beynin bağışıklık yetkin hücreleri olarak, mikroglia ölü hücreleri, işlevsiz sinapsları ve hücresel kalıntıları temizlemek için beyin parankimini sürekli olarak izler7. Mikroglial aktivasyonun, inflamatuar demiyelinizan hastalıklar, nörodejeneratif hastalıklar ve beyin tümörleri de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Multipl sklerozda (MS) aktive mikroglia, oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) farklılaşmasına ve miyelin kalıntılarını yutarak miyelinin rejenerasyonuna katkıda bulunur8.

Alzheimer hastalığında (AD), amiloid beta (Aβ) birikimi, mikroglia9'un fagositik ve enflamatuar fonksiyonlarını etkileyen mikroglia'yı aktive eder. Glioma ile ilişkili mikroglia (GAM) adı verilen glioma dokusundaki aktif mikroglia, gliomun ilerlemesini düzenleyebilir ve sonuçta hastaların prognozunu etkileyebilir10. Aktivasyon mikroglial transkriptomu derinden değiştirir, morfolojik değişikliklere, immün reseptörlerin ekspresyonuna, fagositik aktivitenin artmasına ve sitokin sekresyonunun artmasına neden olur11. Nörodejeneratif hastalıklarda hastalıkla ilişkili mikroglia (DAM), aktif yanıt mikroglia (ARM) ve mikroglial nörodejeneratif fenotip (MGnD)8 gibi farklı aktif mikroglia alt kümeleri vardır.

Benzer şekilde, mikroglia'nın çoklu dinamik fonksiyonel alt kümeleri de enflamatuar demiyelinizan hastalıklarda beyinde bir arada bulunur12. Mikroglia'nın farklı alt kümeleri arasındaki heterojenitenin anlaşılması, inflamatuar demiyelinizan hastalıkların patogenezini araştırmak ve potansiyel tedavi stratejilerini bulmak için gereklidir. Mikroglia'nın heterojenliği esas olarak moleküler özgüllüğe bağlıdır8. Heterojenliğin incelenmesi için mikroglia'nın moleküler değişikliklerini doğru bir şekilde tanımlamak esastır. Tek hücreli RNA dizileme (RNA-seq) teknolojisindeki ilerlemeler, patolojik koşullarda aktive mikroglianın moleküler özelliklerinin tanımlanmasını sağlamıştır13. Bu nedenle, hücre popülasyonlarını izole etme yeteneği, bu hedef hücrelerin belirli koşullar altında daha fazla araştırılması için kritik öneme sahiptir.

Mikroglia'nın özelliklerini ve işlevlerini anlamak için yapılan çalışmalar genellikle in vitro çalışmalardır, çünkü kültür şişelerine bağlanan ve plastik yüzeyde diğer karışık glial hücrelerle birlikte büyüyen fare yavrusu beyinlerinden (1-3 günlük) çok sayıda birincil mikroglianın hazırlanabileceği ve kültürlenebileceği bulunmuştur. Daha sonra, saf mikroglia, karışık glial hücrelerin farklı yapışkanlığına dayanarak izole edilebilir14,15. Bununla birlikte, bu yöntem sadece mikroglia'yı perinatal beyinden izole edebilir ve birkaç hafta sürer. Hücre kültüründeki potansiyel değişkenler, moleküler ekspresyon16 gibi mikroglial özellikleri etkileyebilir. Dahası, bu yöntemlerle izole edilen mikroglia, yalnızca CNS hastalıklarının koşullarını simüle ederek in vitro deneylere katılabilir ve in vivo hastalık durumlarında mikroglia'nın özelliklerini ve işlevlerini temsil edemez. Bu nedenle, mikroglia'yı yetişkin fare beyninden izole etmek için yöntemler geliştirmek gerekir.

Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik ayırma, kendi farklı sınırlamalarına sahip olmalarına rağmen, yaygın olarak kullanılan iki yöntemdir16,17,18,19. İlgili avantaj ve dezavantajları tartışma bölümünde karşılaştırılacaktır. MACS teknolojisinin olgunlaşması, hücreleri hızla saflaştırma imkanı sunar. Huang ve ark. beyinlerdeki demiyelinizan lezyonları etiketlemek için uygun bir yöntem geliştirmişlerdir20. Bu iki teknik yaklaşımı birleştirerek, yetişkin fare beyinlerinde demiyelinizan lezyonlar etrafındaki mikrogliayı izole etmek ve mikroglia'nın moleküler özelliklerini korumak için adım adım bir açıklama sağlayan hızlı ve verimli bir sütunlu CD11b manyetik ayırma protokolü öneriyoruz. Fokal demiyelinizan lezyonlara, protokol 21'e başlamadan 3 gün önce korpus kallozuma 2 μL lizositin çözeltisinin (%0.9 NaCl'de %1 LPC) stereotaktik enjeksiyonu neden oldu. Bu protokol, in vitro deneylerde bir sonraki adımı gerçekleştirmek için temel oluşturur. Dahası, bu protokol zamandan tasarruf sağlar ve çeşitli deneylerde yaygın kullanım için uygun olmaya devam eder.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Tongji Tıp Koleji, Huazhong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi, Çin Hayvan Bakım Komitesi Enstitüsü tarafından onaylanmıştır.

1. Malzemeler

  1. Protokole başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
    1. Fosfat tamponlu saline (PBS) fetal sığır serumu (FBS,% 2) ekleyerek yükleme tamponunu hazırlayın.
    2. PBS'ye nötr kırmızı (NR) boya (son %1) ekleyin.
  2. Ticari olarak temin edilebilen Yetişkin Beyin Ayrışma Kitini kullanarak aşağıdaki çözümleri hazırlayın ( bkz.
    1. Enzim karışımı 1'i hazırlamak için, 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne 1,9 mL Tampon Z ve 50 μL Enzim P pipetin.
    2. Enzim karışımı 2'yi hazırlamak için, 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 20 μL Tampon Y ve 10 μL Enzim A pipetin.
    3. Enkaz kaldırma çözeltisini hazırlayın.

2. Farelerin perfüzyonu ve diseksiyonu

  1. İntraperitoneal olarak (i.p.) anesteziden önce fareye PBS'de 500 μL% 1 NR boya enjekte edin.
    NOT: Demiyelinizan fare modellerinde intraperitoneal NR enjeksiyonu lezyonların ayırt edilmesine yardımcı olur (Şekil 1).
  2. Pentobarbital (50 mg/kg, yani 50 mg) ile fareyi uyuşturun ve ağrı yanıtlarını inceleyerek farenin başarılı bir şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
  3. Farenin göğüs boşluğunu açın ve kalbi açığa çıkarın.
  4. Sağ atriyumun küçük bir köşesini dikkatlice kesin ve fareyi sol ventrikülden 20-30 mL soğuk PBS ile intrakardiyal olarak perfüze edin.
  5. Farenin kafasını anestezi altında kesin.
  6. Farenin kafatasını açın ve beyni kafatasından dikkatlice kurtarın.
  7. Beyni fare beyin dilimi kalıbına aktarın ve beyni 0,1 cm'lik dilimler halinde kesin.
  8. Beyin dilimlerini çıkarın ve bir Petri kabında (60/15 mm) soğuk PBS'ye yerleştirin. Korpus kallozumun etrafındaki NR boyası ile etiketlenmiş lezyonları mikrocerrahi forseps kullanarak stereomikroskop altında mikrodiseke eder.
    NOT: Parçalanmış dokunun, sonraki transferi kolaylaştırmak için mümkün olduğunca eksiksiz olduğundan emin olun; toplam diseksiyon ilerlemesi 2 saat içinde tamamlanmalıdır.
  9. Disseke edilen dokuyu uygun miktarda soğuk yükleme tamponu içeren 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.
    NOT: 2-3 fareden korpus kallozum dokusunu tek bir tüp içinde tek bir örnek olarak bir araya getirin.

3. Doku ayrışması

  1. Tüpün dibinde numune toplamak için disseke edilmiş dokuyu 300 ×g'de 30 s boyunca (bu hıza ulaştıktan sonra) santrifüj edin.
  2. Bir inkübatörde enzim karışımı 1 ve enzim karışımı 2 ila 37 ° C'yi önceden ısıtın.
  3. Bir numuneye 1.950 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 1 ekleyin ve 5 dakika boyunca 37 ° C'de bir inkübatörde sindirin.
  4. 30 μL önceden ısıtılmış enzim karışımı 2 ekleyin ve yavaşça karıştırın.
  5. 37 ° C'de bir inkübatörde 15 dakika boyunca sindirin ve her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
  6. Sindirimden sonra tüpe 4 mL soğuk PBS ekleyin ve hafifçe çalkalayın.
  7. 50 mL santrifüj tüplerine 70 μm filtre yerleştirin ve filtreleri 500 μL soğuk PBS ile önceden ıslatın. Sindirilmiş doku örneklerini filtrelerden geçirerek ayrışmış dokuyu filtreleyin ve 50 mL santrifüj tüpündeki filtrelenmiş süspansiyonu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
    NOT: Doku miktarı çok küçükse bu adımı atlayın.
  8. Filtrelenmiş doku örneklerini 300 × g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı yavaşça ve tamamen aspire edin.
    NOT: Enzimatik sindirim hariç tüm adımlar buz üzerinde yapılmalıdır.

4. Enkaz kaldırma

  1. Hücre peletini 1.550 μL soğuk PBS ile nazikçe yeniden askıya alın.
  2. Enkaz giderimi için 450 μL soğuk çözelti ekleyin ve iyice karıştırın.
  3. Yukarıdaki karışımı 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak 2 x 1 mL soğuk PBS ile çok yavaş ve nazik bir şekilde kaplayın.
    NOT: Santrifüj tüpünü 45° eğin ve pipetle birlikte tüp duvarı boyunca PBS'yi yavaşça ekleyin.
  4. Tüpü yavaşça ve nazikçe bir santrifüje aktarın ve 10 dakika boyunca 4 ° C ve 3.000 × g'da döndürün.
  5. Santrifüjlemeden sonra üç katman arayın. 1.000 μL'lik bir pipet kullanarak iki üst katmanı tamamen aspire edin (Şekil 2).
  6. Tüpü 5 mL'ye kadar soğuk yükleme tamponuyla doldurun ve tüpü yavaşça üç kez ters çevirin.
  7. 10 dakika boyunca 4 °C'de ve 1.000 × g'de santrifüj. Süpernatantı tamamen aspire edin ve hücre peletini bozmaktan kaçının.

5. Mikroglial hücrelerin manyetik olarak ayrılması

  1. Hücre peletini 90 μL yükleme tamponu ile yeniden askıya alın ve 10 μL CD11b (Microglia) boncukları ekleyin.
  2. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. 1 mL yükleme tamponu ekleyin ve inkübasyondan sonra hücreleri yıkamak için sıvıyı 1.000 μL'lik bir pipetle yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri 4 ° C ve 300 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin ve bağlanmamış boncukları çıkarmak için süpernatantı tamamen aspire edin.
  4. Hücreleri 500 μL yükleme tamponunda yeniden askıya alın.
  5. Manyetik alanda pozitif seçim için MS sütununu ayırıcısıyla birlikte yerleştirin.
  6. Hücreleri korumak ve üreticinin protokolüne göre manyetik sıralamanın verimliliğini sağlamak için sütunu 500 μL yükleme tamponu ile durulayın.
  7. Hücre süspansiyonunu MS sütununa uygulayın ve etiketsiz hücreler içeren akışı atın.
  8. Kolon duvarına yapışan hücreleri yıkamak ve akışı atmak için sütuna üç kez 500 μL yükleme tamponu ekleyin.
    NOT: Yalnızca kolon haznesi tamamen boşaldığında yıkamak için yeni yükleme tamponu ekleyin.
  9. Kolonu yıkadıktan sonra kolonu ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin.
  10. Sütuna 1 mL yükleme tamponu ekleyin ve manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri temizlemek için pistonu sütunun altına itin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri tamamen toplamak için bu adımı üç kez yineleyin.

Sonuçlar

CD11b boncukları kullanılarak izole edilen mikroglia yüksek saflığa sahiptir
Demiyelinasyon fare modellerinde lezyonların etrafındaki mikroglial hücreler yukarıda belirtilen protokol kullanılarak izole edildi ve akım sitometrisi ile test edildi. Hücreler, üreticinin talimatlarına göre akış sitometrisinde mikrogliayı belirlemek için CD11b-floresein izotiyosiyanat (FITC) ve CD45-allofikosiyanin (APC) ile floresan olarak etiketlenir. CD11b ve CD45 antikorlarının izole mikroglia ...

Tartışmalar

Protokol, demiyelinizan lezyonların etrafındaki mikrogliayı izole etmek için bir yöntem önermektedir, bu da inflamatuar demiyelinizan hastalıklarda mikroglianın fonksiyonel özelliklerini incelemeye yardımcı olabilir. CD11b boncukları kullanılarak yakalanan mikroglia, yüksek saflık ve canlılık gösterir. Protokoldeki kritik adımlar, odakların hassas lokalizasyonunu ve optimal mikroglial saflaştırmayı içerir. Protokol adım 2.1'de, lezyonların doğru bir şekilde görüntülenebilmesini sağlamak i?...

Açıklamalar

Yazarlar, rakip çıkarların olmadığını ilan etmişlerdir.

Teşekkürler

Çalışma, Tongji Hastanesi (HUST) Mükemmel Genç Bilim İnsanı Vakfı (Hibe No. 2020YQ06) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Micro Centrifuge TubesBIOFILCFT001015
15 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011150
50 mL Centrifuge TubesBIOFILCFT011500
70 µm FilterMiltenyi Biotec130-095-823
Adult Brain Dissociation Kit, mouse and ratMiltenyi Biotec130-107-677
C57BL/6J MiceSJA Labs
CD11b (Microglia) Beads, human and mouseMiltenyi Biotec130-093-634
Fetal Bovine SerumBOSTERPYG0001
FlowJoBD BiosciencesV10
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-102
MS columnsMiltenyi Biotec130-042-201
Neutral RedSigma-Aldrich1013690025
NovoCyte Flow CytometerAgilentA system consisting of various parts
NovoExpressAgilent1.4.1
PBSBOSTERPYG0021
PentobarbitalSigma-AldrichP-010
StereomicroscopeMshOtMZ62

Referanslar

  1. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  2. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  3. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  4. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  5. Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
  6. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  7. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  8. Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
  9. Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
  10. Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
  11. Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
  12. Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
  13. Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Reports. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  14. Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , (2010).
  15. Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
  16. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  17. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  18. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  19. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  20. Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
  21. Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
  22. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  23. Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
  24. Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
  25. Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
  26. He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır