200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Özet

Makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü kriyo-EM haritaları da 200 kV TEM mikroskopları kullanılarak elde edilebilir. Bu protokol, 200 kV TEM kullanarak yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde toplanması için gerekli olan doğru optik hizalamaları, veri toplama şemalarını ve görüntüleme alanlarının seçimini ayarlamak için en iyi uygulamaları gösterir.

Özet

Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), son on yılda protein yapı tayini için rutin bir yöntem olarak kurulmuş ve yayınlanan yapısal verilerin giderek artan bir payını almıştır. TEM teknolojisindeki ve otomasyondaki son gelişmeler, hem veri toplama hızını hem de elde edilen görüntülerin kalitesini artırırken, aynı zamanda 3 şaltı çözünürlüklerde kriyo-EM haritaları elde etmek için gerekli uzmanlık seviyesini azaltmıştır. Bu tür yüksek çözünürlüklü yapıların çoğu son teknoloji ürünü 300 kV kriyo-TEM sistemleri kullanılarak elde edilirken, özellikle bir enerji filtresi ile donatıldığında 200 kV kriyo-TEM sistemleri ile yüksek çözünürlüklü yapılar da elde edilebilir. Ek olarak, mikroskop hizalamalarının ve veri toplamanın gerçek zamanlı görüntü kalitesi değerlendirmesi ile otomasyonu, sistem karmaşıklığını azaltır ve optimum mikroskop ayarlarını garanti eder, bu da yüksek kaliteli görüntülerin veriminin ve veri toplamanın genel veriminin artmasına neden olur. Bu protokol, 200 kV'luk bir kriyo-transmisyonlu elektron mikroskobu üzerinde son teknolojik gelişmelerin ve otomasyon özelliklerinin uygulanmasını ve de novo atomik model oluşturma için yeterli olan 3D haritaların yeniden yapılandırılması için verilerin nasıl toplanacağını göstermektedir. Bu tür yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri kümelerinin rutin olarak toplanmasını sağlamak için göz önünde bulundurulması gereken en iyi uygulamalara, kritik değişkenlere ve yaygın sorunlara odaklanıyoruz. Özellikle aşağıdaki temel konular ayrıntılı olarak gözden geçirilmiştir: i) mikroskop hizalamalarının otomasyonu, ii) veri toplama için uygun alanların seçimi, iii) yüksek kaliteli, yüksek verimli veri toplama için optimum optik parametreler, iv) sıfır kayıplı görüntüleme için enerji filtresi ayarı ve v) veri yönetimi ve kalite değerlendirmesi. En iyi uygulamaların uygulanması ve bir enerji filtresi kullanılarak ulaşılabilir çözünürlüğün iyileştirilmesi, 1.6 Å'ye yeniden yapılandırılmış apo-ferritin ve bir enerji filtresi ve bir doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 200 kV'luk bir TEM kullanılarak 2.1-şçözünürlüğe yeniden yapılandırılmış Thermoplasma acidophilum 20S proteazom örneğinde gösterilecektir.

Giriş

Protein yapısının belirlenmesi, hücre metabolizması, sinyal iletimi veya konakçı-patojen etkileşimleri gibi anahtar hücresel süreçlerde yer alan protein komplekslerinin moleküler mimarisini, işlevini ve düzenlenmesini anlamak için kritik öneme sahiptir. Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM), X-ışını kırınımı ve NMR spektroskopisi gibi geleneksel yapısal teknikler için çok zor olan birçok proteinin ve komplekslerinin 3D yapısını çözebilen güçlü bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, kriyo-EM'nin, geleneksel yapısal teknikler için kolayca kristalize edilemeyen veya yeterli miktarlarda hazırlanamayan membran proteinleri için tercih edilen yöntem olduğu kanıtlanmıştır ve önemli hücresel reseptörlerin ve iyon kanallarının yapısı ve işlevi hakkında yeni bilgiler sağlamıştır 1,2,3,4,5 . Son zamanlarda, kriyo-EM, Covid-19 hastalığının kökenlerini aydınlatan ve etkili aşıların ve terapötiklerin hızlı bir şekilde geliştirilmesine temel oluşturan moleküler düzeyde SARS-CoV-2 enfeksiyonunun mekanizmasını belirleyerek Covid-19 pandemisi ile mücadelede önemli bir rol oynamıştır ^6,7,8,9,10.

Tipik olarak, üst düzey 300-kV iletim elektron mikroskopları (TEM), konformasyonlarını ve etkileşimlerini ortaya çıkarmak için kriyo-EM tek parçacık analizi (SPA) ile biyomoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapı tayini için kullanılır. Son zamanlarda, SPA tekniği, ortak kriter kriyo-EM numunesi apo-ferritin, soğuk alan emisyon tabancası (E-CFEG), bir doğrudan elektron dedektörü ve bir enerji filtresi ile donatılmış 300 kV'luk bir TEM kullanılarak atomik çözünürlükte (^{1.2 Å) 11,12} yeniden yapılandırıldığında yeni bir sınıra ulaştı. Bu kararda, bireysel atomların yapıdaki konumlarını, bireysel amino asit yan zincirlerinin konformasyonunu, hidrojen bağını ve diğer etkileşimleri açık bir şekilde çözmek mümkün olmuştur; bu, yeni hedeflerin yapı tabanlı ilaç keşfi ve mevcut ilaç adaylarının optimizasyonu için yeni olanaklar açmaktadır.

Orta menzilli 200 kV TEM mikroskopları, özellikle daha büyük kriyo-EM tesislerinde, üst düzey TEM mikroskopları kullanılarak nihai yüksek çözünürlüklü veri toplamadan önce numune taraması ve numune optimizasyonu için sıklıkla kullanılır. Tipik olarak, görüntülenen örnekler, nihai veri toplama için üst düzey bir 300 kV TEM'e geçmek için yeterli olan 3-4 şçözünürlük aralığında çözümlenebilir. Sonuç olarak, 200 kV TEM kullanılarak veri toplama genellikle mümkün olan en yüksek çözünürlük sonuçları için daha fazla optimize edilmez. Dahası, birçok ilginç biyolojik soru bu kararlarda zaten cevaplanabilir ve yayınlanabilir, çünkü tüm amino asit yan zincirleri zaten çözülmüştür ve ligand bağlanma bölgelerinin doluluğu da güvenilir bir şekilde belirlenebilir¹³. 200-kV TEM'lerin^{14,15,16,17,18} numaralı numune için 3 ^Å'nın ötesinde çözünürlüklere ulaşabileceği zaten gösterilmiştir. 200 kV'ta çekilen görüntüler, görüntülenen parçacıkların doğal olarak daha yüksek kontrastını sergiler, bu da 300 kV TEM görüntülerine kıyasla yüksek çözünürlükte daha zayıflatılmış sinyale rağmen parçacıkların daha doğru ilk hizalanmasını bile kolaylaştırabilir. Yeniden yapılandırılmış kriyo-EM haritalarının elde edilen çözünürlüğünün, hem 200-kV hem de 300-kV rekonstrüksiyonlarını etkileyen görüntülü numunelerin yapısal esnekliği ve konformasyonel heterojenliği ile sınırlı olduğunu belirtmek önemlidir. Aslında, 300-kV sistemleri kullanılarak elde edilen kriyo-EM rekonstrüksiyonları, 3-4 şçözünürlük aralığında, daha yüksek çözünürlüklerde^19'dan daha fazla çözülmüştür. 200 kV TEM mikroskoplar daha az karmaşık olduğundan ve daha küçük odalara sığdığından, bu mikroskoplar, mikroskop Otomatik Yükleyici sisteminde depolanan birden fazla numuneden uzun veri toplamanın otomasyonunu korurken, kriyo-EM ile biyolojik makromoleküllerin yapı tayini için iyi, daha düşük maliyetli bir seçeneği temsil eder.

Yüksek çözünürlüklü yapı tayini için kriyo-EM veri setlerinin toplanması, mikroskop optiklerinin doğru bir şekilde hizalanmasını gerektirir. Sütun hizalamaları, elektron kaynağından kondenser lens sistemine, objektif lense ve bir elektron dedektörü ile enerji filtresine sistematik olarak ilerler. Hizalamaların tam sırası tipik olarak gerekli değildir. Gerektiğinde, kullanıcı, mikroskop kullanıcı arayüzündeki (Doğrudan Hizalama kontrol paneli) hizalama prosedürü boyunca bağlama duyarlı bir yardım penceresindeki her adımın uygun bir açıklamasıyla yarı otomatik prosedürler aracılığıyla yönlendirilir. Mikroskop tamamen hizalandıktan sonra, elektron optikleri sabit kalır ve hizalamaların en az birkaç ay boyunca değiştirilmesi gerekmez. Yalnızca örnek düzlemin paralel aydınlatılması, nesnel astigmatizm ve komasız hizalama gibi en hassas hizalamalar, her veri kümesinin toplanmasına başlamadan hemen önce iyileştirilmelidir. Toplanan verilerin kalitesi daha sonra EPU Quality Monitor, cryoSPARC Live 20, Relion 21, Scipion 22, WARP 23 veya Appion ²⁴ gibi farklı yazılım paketleri kullanılarak veri toplama sırasında izlenebilir.

Mikroskobun doğru hizalanmasının yanı sıra, minimum konformasyonel ve bileşimsel heterojenliğe sahip iyi saflaştırılmış numunelerin yüksek kalitesi de yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin toplanması ve yüksek çözünürlüklü yapıların çözülmesi için bir ön koşuldur. Tipik protokoller, sık karşılaşılan zorluklar ve olası çözümler hakkında daha fazla ayrıntı, bu konuya adanmış diğer incelemelerde bulunabilir^25,26,27. Temel olarak, belirli bir kriyo-EM ızgarasında, yüksek çözünürlüklü bilgileri korumak için yeterince ince buza sahip alanları bulmak çok önemlidir ve bireysel parçacıklar, örtüşmeler olmadan rastgele yönlerde yoğun bir şekilde dağıtılır. Bununla birlikte, tipik kriyo-EM ızgaraları düzgün olmayan buz kalınlığına sahiptir ve bu nedenle görüntüleme için en uygun alanları bulmak ve seçmek önemlidir. Izgaradaki buz kalınlığının tahmini için farklı araçlar, EPU 2, Leginon²⁸ veya SerialEM²⁹ gibi kriyo-EM veri kümelerinin otomatik olarak toplanmasına adanmış yazılım paketlerinde mevcuttur.

Hızlı ve hassas doğrudan elektron dedektörlerinin ortaya çıkışı, ışın kaynaklı hareketlerin telafisi sağlayan filmler olarak birçok fraksiyonda görüntülerin toplanmasını sağladı ve görüntü işleme ve son 3D rekonstrüksiyonda kullanılan verilerin kalitesinde ve miktarında önemli bir artışa neden oldu³⁰. Aynı zamanda, otomasyon ve yüksek verimli veri toplama, veri depolama ve erişim için zorlukları temsil eden binlerce görüntü/film içeren devasa veri kümeleri sağlar. Onlarca ila yüzlerce kullanıcıya hizmet veren büyük cryo-EM tesislerine sahip benimsenen model, özellikle yerleşik cryo-EM boru hatlarında uygun izleme ve veri paylaşımı ile organize veri yönetimi çağrısında bulunmaktadır^31,32.

Bu çalışmada, 200 kV Glacios TEM mikroskobu kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-EM veri kümelerinin rutin olarak toplanması için bir protokol açıklanmaktadır. Mikroskop optiklerinin gerekli hizalamaları, kriyo-EM numunelerinin değerlendirilmesi ve yüksek çözünürlüklü veri toplama için uygun alanların seçimi için prosedürlerle birlikte açıklanmaktadır. Toplanan verilerin ve ilgili meta verilerin örnek bilgilerle organizasyonu, örnek bilgilerin ve toplanan verilerin gözden geçirilmesini kolaylaştıran bir veri yönetimi platformu olan Athena'da gösterilmiştir. Fare apo-ferritin örneğini kullanarak, 1.6^{şçözünürlükte} 13D rekonstrüksiyon elde etmek mümkündü. Açıklanan protokolü kullanarak, 20S proteazomunun 3D yoğunluk haritasını Thermoplasma acidophilum'dan 2.1 şçözünürlükte yeniden yapılandırdık.

Protokol

Protokolün tüm adımları, Selectris-X enerji filtresi (bundan böyle enerji filtresi olarak anılacaktır) ve Falcon 4 dedektörü (bundan böyle doğrudan elektron dedektörü olarak anılacaktır) ile donatılmış 200 kV Glacios TEM sistemi (bundan böyle 200 kV TEM olarak anılacaktır) için açıklanmıştır. Protokol adımları, her Glacios sistemine önceden yüklenmiş varsayılan SPA veri toplama yazılımı olan EPU uygulamasına özgüdür. Aşağıdaki protokol adımları EPU sürüm 2.14'e karşılık gelir ve farklı bir EPU sürümü kullanıldığında küçük değişiklikler beklenir. Bu protokol için ön koşullar şunlardır: i) tabanca ve kolon hizalamaları iyi hizalanmış, ii) EM kalibrasyonları doğru ve iii) EPU otomatik fonksiyonları doğru şekilde kalibre edilmiştir.

1. Izgaraların mikroskopa yüklenmesi

NOT: Bu deneyde kullanılan 200 kV TEM, mikroskopun Otomatik Yükleyicisinin içine yüklenen ve numune sapmasını önlemek için sürekli olarak -170 ° C'nin altındaki sıcaklıklarda tutulan bir kaset içinde 12 adede kadar otomatik ızgarayı (yani, özel bir kartuşa tutturulmuş geleneksel TEM ızgaraları) tutabilir.

1. Otomatik ızgaraları sıvı nitrojen koşulları altında Otomatik Yükleyici kasetine takın.
2. Otomatik ızgaralı kaseti sıvı-azot soğutmalı bir transfer kapsülüne yerleştirin.
3. Kapsülü mikroskopa yerleştirin ve kaseti kapsülden mikroskobun Otomatik Yükleyicisine yüklemek için mikroskop kullanıcı arayüzündeki Dock düğmesine tıklayın.
4. Yüklenen kasetteki otomatik ızgaraların varlığını kontrol etmek için Envanter düğmesine tıklayın.
5. TEM görüntüleme sütununa otomatik ızgaralar eklemek için Yükle ve Kaldır düğmelerine tıklayın.

2. Veri yönetimi platformunda proje ayarlama (İsteğe bağlı)

NOT: Örnek bilgiler ve toplanan veriler, bağlı tüm cihazlar için yapılandırılmış verilerin depolanmasına izin veren sağlanan veri yönetimi platformunda düzenlenebilir. Görüntüleri ve meta verileri gözden geçirme ve dışa aktarma için düzenli bir şekilde yakalamak üzere herhangi bir iş akışı adımının tanımlanabileceği bir proje oluşturulabilir.

1. Veri yönetimi portalı uygulamasını başlatın ve bir kullanıcı adı ve parola ile oturum açın.
2. Portal kullanıcı arabiriminin sol panelinde, yeni bir proje oluşturmak için Proje Ekle düğmesine tıklayın veya bir projeyi açmak için aşağıdaki listede varolan bir projenin düğmesine tıklayın.
3. Açılan projede yeni bir deneme oluşturmak için Deneme Ekle düğmesini tıklayın.
4. Yeni denemenin Meta Veri panelindeki açıklamayı doldurun ve deney içinde yeni bir iş akışı oluşturmak için İş Akışı Ekle düğmesini tıklatın (ör. Tek Parçacık Analizi).
5. İsteğe bağlı olarak, özel yapım bir İş Akışı oluşturmak veya önceden tanımlanmış SPA İş Akışına ek adımlar eklemek için orta paneldeki Adım Ekle düğmesine tıklayın (Şekil 1 ve Şekil 2).
   NOT: Adımlar numune hazırlama, biyokimya teknikleri ile numune karakterizasyonu, numune vitrifikasyonu, kriyo-EM ızgaralarının taranması, veri toplama oturumları ve veri analizini temsil edebilir.
6. İsteğe bağlı olarak, her adımın Notları'ndaki açıklamaları resim ve fotoğraf içerebilecek şekilde doldurun.
7. İş Akışı'nda bir veri kümesi adımı oluşturun ve veri kümesi türünü EPU olarak seçin.
   NOT: Bu, analiz yazılımının veri toplama sırasında tüm sonuç verilerini/meta verilerini otomatik olarak veri yönetimi portalında doğru yere yerleştirmesine ve tüm adımların ve veri aktarımının tam bir kaydını tutarken verileri otomatik olarak tercih edilen hedefe aktarmasına olanak tanır.
8. Biyokimya adımındaki Numune ve EM ızgaraları hakkındaki şablonları doldurun ve her ızgarayı bir numuneyle ilişkilendirin (bir numunenin birden fazla ızgarayla ilişkilendirilebileceğini unutmayın).
9. Veri kümesi adımının meta veriler bölümünde örnek-kılavuz birleşimlerini ilişkilendirin.

3. Analiz yazılımında görüntüleme ön ayarlarını ve görüntü kaydırma kalibrasyonlarını ayarlayın

1. Tablo 1'de gösterildiği gibi bireysel görüntüleme modları için görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Belirli ayarların seçimiyle ilgili dikkat edilmesi gereken noktalar Tartışma bölümünde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
2. Analiz yazılımının Veri Toplama ön ayarında seçilen büyütme için paralel aydınlatmayı ayarlayın
   NOT: Bu çalışmada kullanılan 200 kV TEM gibi 2 kondenserli TEM sistemlerinde, numunenin verilen SPOT boyutunda (yani, C1 lensin önceden ayarlanmış mukavemetleri) paralel aydınlatılması için C2 lensin yalnızca bir ayarı vardır. Bu nedenle, birim alan başına elektron doz hızı (e^-/Ų/s) yalnızca SPOT boyutu ayarları değiştirilerek ve C2 mukavemeti (ışın yoğunluğu) aşağıdaki adımlara göre yeniden ayarlanarak ayarlanabilir.
   1. Destek karbon folyo ve ince veya buz içermeyen bir alana hareket edin.
   2. TEM UI'nin Diyafram Açıklığı menüsünde 100 μm veya 70 μm objektif diyafram açıklığını seçin.
   3. Kırınım moduna geçmek için kontrol panellerindeki Kırınım düğmesine basın.
   4. Floresan ekranı takın ve FluCam modunu Yüksek Çözünürlük olarak değiştirin.
   5. Merkezi kırınım noktasını diyafram açıklığının bir kenarına taşıyın. Diyafram kenarı görünmüyorsa fotoğraf makinesi uzunluğunu artırın (Büyütme düğmesini kullanarak).
   6. Arka odak düzlemini netlemeye getirmek için kontrol panelindeki Netleme düğmesini dikkatlice çevirin. Arka odak düzlemi, diyafram kenarı gözle görülür şekilde keskin olduğunda odaklanır.
   7. FluCam'in hassasiyetini en düşük seviyeye indirin ve merkezi kırınım noktasını FluCam'in merkezine taşıyın.
   8. Kontrol panelindeki Yoğunluk düğmesini kullanarak merkezi noktanın boyutunu en aza indirin.
   9. TEM UI'deki objektif diyafram açıklığını geri çekin ve görüntüleme moduna geri dönün.
   10. Ayarları Veri Toplama ön ayarına kaydetmek için analiz yazılımındaki Al düğmesine tıklayın.
3. Kullanılan dedektör için en uygun olan Veri Toplama ön ayarında elektron doz hızını ayarlayın:
   1. Izgara üzerinde boş bir alana gidin (örneğin, kırık karbon folyo içeren bir ızgara karesi)
   2. Elektron doz oranını ölçmek için analiz yazılımındaki Dozu Ölç düğmesine tıklayın.
   3. En uygun doz oranını elde etmek için SPOT boyutunu değiştirin. Bu protokolde kullanılan doğrudan elektron dedektörü söz konusu olduğunda, yüksek çözünürlüklü veri toplama için tipik olarak ^{4-5 e-}/piksel/sn doz hızı kullanılır. Bu genellikle SPOT boyutu 4-6'ya karşılık gelir.
   4. Yukarıda açıklandığı gibi yeni SPOT boyutu ayarında paralel aydınlatmayı kontrol edin ve ayarlayın.
   5. Doğrudan elektron dedektörü^33'te EER modunu kullanmak için Kesirler altında EER seçeneğini belirleyin.
   6. Ayarları Veri Toplama ön ayarına kaydetmek için analiz yazılımındaki Al düğmesine tıklayın.
   7. Otomatik netleme hazır ayarına geçin ve netleme için aydınlatma ayarlarını kaydetmek üzere Get düğmesine basın. Pozlama süresini manuel olarak 1 s ve binning modu 2 olarak değiştirin.
   8. Thon Rings hazır ayarına geçin ve bu hazır ayarın aydınlatma ayarlarını kaydetmek için Get düğmesine basın. Pozlama süresini manuel olarak 1-2 sn ve binning modu 2 olarak değiştirin.
   9. Sıfır Kayıp hazır ayarına geçin ve bu hazır ayarın aydınlatma ayarlarını kaydetmek için Get düğmesine basın. Pozlama süresini manuel olarak 0,5 sn ve ciltleme modu 4 olarak değiştirin.
4. Hazırlık sekmesindeki Görüntü Kaydırma Kalibrasyonu görevini kullanarak analiz yazılımı kılavuzunda açıklandığı gibi ayarlanan optik ayarlar arasındaki görüntü kaymalarını kalibre edin (Ek Şekil 1).

Tablo 1: Bir enerji filtresi ve doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 200 kV kriyo-TEM kullanılarak yüksek çözünürlüklü veri toplama için tipik görüntüleme ayarları. Otomatik veri toplamanın ayarlanmasında kullanılan her optik ön ayar için ayarlar gösterilir (Protokol'ün 3. bölümü). Bu ayarlar bu çalışmada kullanılan 200 kV TEM mikroskobu ve direkt elektron dedektörüne özgüdür. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

4. Izgara haritalama ve veri toplama için en iyi kriyo-EM ızgaralarının seçimi

1. Atlas sekmesini seçin ve yeni bir oturum açmak için Yeni Oturum düğmesine tıklayın.
2. Oturum adı ve veri depolama konumu gibi ayrıntıları doldurun ve Otomatik Yükleyici envanterindeki tüm ızgaraların listesini gösteren yeni bir Filtreleme görev penceresi açmak için Uygula düğmesine tıklayın. İsteğe bağlı olarak, kılavuzların Adlarını düzenleyin.
3. İlgili kılavuz numarasının yanındaki onay kutusunu işaretleyerek ilgilendiğiniz kılavuzları seçin.
4. Seçilen tüm ızgaraların tam otomatik atlas koleksiyonunu başlatmak için Başlat düğmesine tıklayın.
5. Koleksiyon tamamlandığında, alınan atlasları incelemek için ızgara etiketlerine tıklayın.
   NOT: Tek tek ızgara kareleri, her atlastaki göreli gri tonlama değer değerlendirmesine dayanan bağıl buz kalınlıklarına göre sınıflandırılır. Sınıflandırılmış ızgara kareleri, veri toplama alanlarının seçimine rehberlik etmek için kullanılabilecek farklı renk şemalarında gösterilir. Bir Vitrobot Mk IV ile üretilen bir ızgara tipik olarak tüm ızgara üzerinde bir buz kalınlığı gradyanı gösterecektir, bu da veri toplama için ideal buz kalınlığını belirlemeye yardımcı olabilir. Optimal bir ızgara mümkün olduğunca az transfer buzu kirliliği içermeli ve yeterince kırılmamış ve çatlaksız ızgara kareleri sergilemelidir (Şekil 3). Uygun buz dağılımına sahip ızgaralar, buzdaki parçacıkların dağılımını yüksek büyütmede (yani, bireysel parçacıkların yoğunluğu ve oryantasyonları) değerlendirmek için daha fazla araştırılabilir.
6. Mikroskop sütununa uygun buz dağılımına sahip seçilmiş bir ızgara eklemek için üst menüdeki Numuneyi Yükle düğmesine tıklayın.
7. Atlas sekmesini seçin, atlas görüntüsünde uygun bir ızgara karesine sağ tıklayın ve sahne alanını ızgara karesine taşımak için açılır menüden Sahneyi Buraya Taşı seçeneğini belirleyin.
8. Izgara karesini Ösentrik yüksekliğe ayarlamak için Otomatik İşlevler sekmesini seçin. Ösantrik Yükseklik ön ayarına geçin, seçilen ızgara karesinin ortasındaki Işın Eğme otomatik işlevine tıklayın ve Başlat düğmesine tıklayın.
9. Izgara Kare hazır ayarına geçin ve bir görüntü alın. Sahneyi buzlu ve kirlenmesiz veya minimum kirlenmeli bir deliğe sağ tıklayarak ve Sahneyi Buraya Taşı seçeneğiyle taşıyın.
10. Delik/Ömerkezci Yükseklik ön ayarına geçin ve bir görüntü elde edin. Sahne alanını ilgilenilen deliğin yanındaki karbon alanına sağ tıklayarak ve Sahneyi Buraya Taşı seçeneğini kullanarak taşıyın.
11. Otomatik Odaklama otomatik işlevine tıklayın ve İstenen bulanıklaştırma için değerleri 0 μm'ye ve Yinele değerini -2 μm'ye ayarlayın. Otomatik Netleme hazır ayarına geçin ve Başlat düğmesine tıklayın.
12. Hazırlık sekmesini tekrar seçin ve Delik/Ösantrik Yükseklik ön ayarına geçin. Daha önce edinilen delik görüntüsünde, delik içinde bir ilgi alanı seçin ve Sahne Alanını Buraya Taşı seçeneğini sağ tıklatıp belirleyerek sahne alanını bu konuma taşıyın.
13. Veri Toplama hazır ayarına geçin ve ışın kaydırma işleminden sonraki bekleme süresini 0,5 sn'ye ve aşama taşındıktan sonraki bekleme süresini 20 sn'ye ayarlayın. Tek tek parçacıkların daha iyi görselleştirilmesi için düşük çözünürlüklü kontrastı artırmak üzere -3 μm ile -5 μm arasında bulanıklaştırma kullanarak bir görüntü elde edin.
14. İsteğe bağlı olarak, gerektiğinde farklı buz kalınlıklarına sahip farklı deliklerdeki ve farklı ızgara karelerindeki parçacıkları görüntülemek için 4.7-4.13 adımlarını tekrarlayın.
15. Yüksek çözünürlüklü veri toplama için en uygun ızgara belirlendikten ve seçildikten sonra, seçilen ızgarayı TEM'e yüklemek için üst menüdeki Örneği Yükle düğmesini tıklatın.
    NOT: Alternatif olarak, daha fazla bilgiye ihtiyaç duyulursa ve/veya bu tarama sürecinin otomasyonu isteniyorsa, bölüm 5'i gerçekleştirin.

5. Tek parçacık analiz yazılımında veri toplama oturumu oluşturma

NOT: Altın folyo ızgaraları kullanılıyorsa, objektif astigmatizma ve koma hizalamalarının iyileştirilmesi (bölüm 6) güvenilir bir şekilde çalışmayabilir. Veri toplamayı ayarlamadan önce bir karbon folyo ızgarası veya çapraz ızgaralı EM ızgarası yüklemeniz ve bu son hizalamaları gerçekleştirmeniz önerilir.

1. EPU sekmesini seçin ve sol panelde yeni bir oturum oluşturmak için Oturum Oluşturma düğmesine tıklayın. Geçerli optik hazır ayarları kullanmak için Yeni Oturum seçeneğini veya daha önce dışa aktarılan oturum ayarlarını yüklemek için Tercihlerden Yeni seçeneğini belirleyin.
2. Oturum adını ve veri depolama konumunu girin.
   NOT: Bu konum, veri toplama oturumundaki tümleşik görüntüleri ve meta verileri, oturum adına sahip bir alt klasöre kaydetmek için kullanılacaktır. Bu veriler önemli miktarda depolama alanı kaplamasa da, EER kamera çerçeveleri her zaman bu veri deposunun kök dizininde oturum adına sahip bir dizinde depolandığından, bu verilerin DMP sunucusunun Falcon boşaltma veri depolama alanına kaydedilmesi önerilir.
3. Protokolün ilerleyen bölümlerinde veri toplama için seçilen kılavuz karelerindeki tek tek deliklerin seçimi üzerinde denetime sahip olmak için oturumun El ile türünü seçin.
4. Tek tek delikler arasındaki sahne alanı hareketlerini azaltmak, genel örnek kaymasını azaltmak ve görüntü kalitesinde bozulma olmadan veri toplama verimini artırmak amacıyla veri toplama için sapmasız görüntü kaydırmayı (AFIS) kullanmak üzere Daha hızlı alma modunu seçin.
5. Kaydedilen tümleşik görüntülerin varsayılan mrc biçimini seçin.
6. Kullanılan kılavuzu ve türünü belirtin. Bu protokol, apo-ferritin için R-1.2 / 1.3 UltraAufoil'i ve 20S proteazom için R-2 / 1 Quantifoil ızgarasını kullandı. Numune taşıyıcı altında Quantifoil'i ve Quantifoil Tipi altında R1.2/1.3 veya 2/1'i seçin.
7. İSTEĞE BAĞLI: EPU Quality Monitor'ü (EQM) kullanmak için sağ alt köşedeki Athena Giriş düğmesine tıklayın.
   1. Oturum Kurulumu'na genel bakıştaki ayarlar bölümünü etkinleştirmek için tarayıcı açılır penceresine oturum açma ayrıntılarını girin.
   2. Ayarlar bölümündeki Seç düğmesine tıklayın ve geçerli veri koleksiyonuyla ilişkilendirmek için önceden oluşturulmuş veri kümesine (Protokol bölümü 2) göz atın. Kalite İzleyiciyi Etkinleştir onay kutusunu açın.
8. Yeni bir oturum oluşturmak için Uygula düğmesine tıklayın.
   NOT: Bu eylem, sol sütun menüsünde yeni görevler açar. Oturum sırasında herhangi bir noktada, bazı ayrıntılar yanlışsa, Oturum Kurulumu görevine geri dönmek, ayrıntıları değiştirmek/güncellemek ve oturumu güncellemek için tekrar Uygula'ya tıklamak mümkündür.
9. Izgaranın toplanan atlasını göstermek için sol paneldeki Kare Seçimi görevini seçin.
10. İsteğe bağlı olarak, ızgara karelerindeki buz kalitesini daha iyi değerlendirmek üzere daha kaliteli bir görüntü görmek için atlasın herhangi bir döşemesine çift tıklayın. Izgara atlasına dönmek için resme tekrar çift tıklayın.
11. Aşağıdaki özelliklere sahip ızgara karelerini tanımlayın (Şekil 4): (i) Izgara karesindeki destek folyosu hasar görmeden sağlamdır, (ii) Folyo deliklerindeki vitreus ince buz (delikler destek karbon folyosundan daha parlak görünür), (iii) Izgara karesinde mümkün olduğunca az kristalin buz kirliliği (siyah lekeler), (iv) Izgara karesi boyunca ve bireysel folyo delikleri içinde minimum parlaklık gradyanı.
    NOT: Seçilen ön ayarlarla ve iyi bir ızgara ile, bu çalışmada kullanılan 200 kV kriyo TEM, ~ 200-300 film / s hızında görüntü alabilir. Bunu akılda tutarak, gerektiği kadar kare seçin veya mevcut mikroskop süresine göre kare seçim görevine geri dönerek daha sonra daha fazlasını ekleyin. Referans olarak, apo-ferritinin 1.6 şçözünürlüğünü elde etmek için 3000 film toplandı.
12. Tam atlas veya yüksek kaliteli döşeme görüntülerinde veri toplamak için ızgara karelerini seçin
    1. İlgilendiğiniz bir ızgara karesine sağ tıklayın ve bağlam menüsünde Seç seçeneğini belirleyin
    2. Alternatif olarak, klavyedeki Ctrl tuşunu basılı tutun ve istediğiniz ızgara karelerine sol tıklayın
    3. Tersine, sağ tıklayın ve Shift tuşunu seçin veya basılı tutun ve kareleri kaldırmak için sol tıklayın
    NOT: Sonraki adımlar, veri toplamanın yüksek çözünürlüklü bir yeniden yapılandırmayla sonuçlanmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. İnce bir buz tabakası ile ızgara karesindeki deliklerin seçimine başlayın. Bu ızgara karesine sağ tıklayın ve Delik Seçimi görevine başlamak için Delikleri Seç seçeneğini belirleyin.
13. Seçilen ızgara karelerindeki delikleri seçmek için sol paneldeki Delik Seçimi görevini seçin.
14. Otomatik olarak seçilen ilk ızgara karesine geçmek, Ösantrik yüksekliği ayarlamak ve folyo deliklerini bulmak için ızgara kare görüntüsü elde etmek için Otomatik Ösantrik düğmesine tıklayın.
15. Görüntüdeki folyo deliklerini bulmak için Delikleri Bul düğmesine tıklayın.
    NOT: Delik bulma işlemi iyi çalışmadıysa (yani, görüntüde atlanan delikler veya yanlış boyutlandırılmış delikler varsa), Oturum Kurulumu görevinin Quantifoil Türü girişine doğru değerlerin girilip girilmediğini kontrol edin ve delikleri yeniden bulun. Delikler hala doğru bulunamıyorsa, delik çapını ve mesafesini manuel olarak ayarlamak ve delikleri tekrar bulmak için Delik Boyutunu Ölç düğmesine tıklayın.
16. Izgara çubuklarının yakınındaki deliklerin seçimini kaldırmak için ızgara çubuğu düğmesinin yakınındaki Delikleri Kaldır düğmesine tıklayın.
17. Buz filtresinin parlaklık histogramındaki sınırları (yazılım penceresinin sağ alt köşesinde) ayarlayarak Şekil 4'te gösterildiği gibi çok kalın buzlu tüm delikleri (sol sınır çizgisini kullanarak) ve tüm boş delikleri (sağ sınır çizgisini kullanarak) kaldırın.
    NOT: İyileştirme için, belirli yoğunluk değerleri Uygula düğmesinin yanındaki ilgili metin kutularına da girilebilir.
18. İsteğe bağlı olarak, delik seçimini manuel olarak hassaslaştırmak için Seçim Fırçası'nı kullanın: İstenmeyen deliklerin seçimini kaldırmak için fırçayı sol tıklayıp sürükleyin. Folyo deliklerini yeniden seçebilmek için Ctrl tuşunu basılı tutun ve sol tıklayın. Shift tuşunu basılı tutun ve fırça boyutunu ayarlamak için fare tekerleğiyle kaydırın.
19. Veri toplama boyunca tekrar tekrar kullanılacak bir veri toplama şablonunu ayarlamak ve test etmek için bir delik seçin: Kılavuz kare görüntüdeki bir deliğe sağ tıklayın ve Sahne Alanını Konuma Taşı seçeneğini belirleyin.
20. Sol paneldeki Şablon Tanımı görevini seçin.
21. Delik/Ömerkezci ön ayarını seçin ve bir görüntü elde etmek için Al düğmesine tıklayın.
22. Görüntüdeki bir deliği ortalamak için Delik Bul ve Ortala düğmesine tıklayın.
23. Görüntü Kaydırmadan Sonra Gecikme değerlerini 0,5 sn'ye (varsayılan) ve Sahne Alanı Kaymasından Sonra Gecikme değerlerini 20 sn'ye ayarlayın.
    NOT: Paralel ışın çapı bu çalışmada kullanılan 200 kV kriyo-TEM sistemine sabitlendiğinden ve tipik olarak 50-μm diyafram açıklığına sahip 1.6-1.7 μm'ye karşılık geldiğinden, R-1.2/1.3 ızgaraları kullanılarak delik başına sadece 1 görüntü ve R-2/1 veya R-2/2 ızgaraları kullanılarak delik başına 2 görüntü (zıt kenarlara yakın) elde edilebilir. Ekrandaki set edinme alanlarının boyutunun gerçek ışın çapına karşılık gelmediğini lütfen unutmayın. Görüntü ölçek çubuğu, uygun bir yerleşim mesafesini tahmin etmek için kullanılabilir.
24. Alım Alanı Ekle düğmesini seçin ve yüksek büyütmeli görüntü alımının alınacağı ortalanmış delikteki konumu seçmek için resme tıklayın.
25. Otomatik Netleme Alanı Ekle düğmesini seçin ve görüntü otomatik netlemenin gerçekleştirileceği ortalanmış deliğin yanındaki destek folyosundaki konumu seçmek için görüntüye tıklayın.
    NOT: Odaklama için ışın boyutu 1,6-1,7 μm'dir ve karbon üzerindeki komşu deliklerden eşit olarak yerleştirilmelidir.
26. Yazılım penceresinin üst bölümündeki Bulanıklaştırma Listesi'nde bir dizi bulanıklaştırma değeri ayarlamak için yeşil alma alanına tıklayın. Aşağıdaki Şablon Yürütme görevinin test çalışmasında parçacıkların görselleştirilmesini geliştirmek için en yüksek bulanıklaştırmayı ilk olarak girin.
27. Aynı alanda otomatik netlemeye özgü ayarları yapmak için mavi otomatik netleme alanına tıklayın:
    1. Her AFIS kümesinin başında otomatik netleme için Ortaladıktan Sonra seçeneğini belirleyin.
    2. Daha hızlı otomatik odaklama ve daha az sahne alanı sürüklenmesi için Hedef Lens seçeneğini belirleyin.
28. Şablon Yürütme görevini seçin ve Yürüt düğmesine tıklayın.
    1. Veri toplama prosedürünün bireysel adımlarını gözlemleyin (deliği ortalayın, seçilen alanda otomatik odaklama ve ayarlanan alanlarda görüntü yakalama) ve son yüksek büyütmeli görüntüde görüntülenen parçacıkların kalitesini kontrol edin.
    2. FFT görüntüsünü kontrol etmek ve Thon halkalarının birden fazla salınım gösterip göstermediğini görsel olarak değerlendirmek ve FFT görüntüsünde yüksek çözünürlüğe uzanıp uzanmadığını görsel olarak değerlendirmek için yüksek büyütmeli görüntü penceresinin sağ alt köşesindeki FFT düğmesine tıklayın.
29. Şablon yürütme başarıyla tamamlanırsa, veri toplamanın bu ilk ızgara karesinde kullanılan ayarlara göre seçilen diğer tüm ızgara karelerinde otomatik olarak ayarlanmasını sağlamak için Delik Seçimi görevindeki Tüm Kareleri Hazırla düğmesine tıklayın.

6. Veri toplamaya başlamadan önce son mikroskop hizalamaları

NOT: En iyi yüksek çözünürlüklü sonuçları elde etmek için, en hassas hizalamalar, veri toplama yazılımındaki Veri Toplama moduyla tam olarak aynı ayarlarda ve gerçek veri alımına başlamadan hemen önce yapılmalıdır. Bu hizalamalar, ızgaranın ince destek karbonuna sahip, herhangi bir ızgara çubuğundan yeterince uzak ve Ösentrik yükseklikte hizalanmış bir konumda yapılmalıdır.

1. Şablon Yürütme görevini seçin, yeni bir görüntü edinin ve sahne alanıyla birlikte sağ tıklayarak karbon folyo üzerinde temiz bir alana gidin ve Sahneyi Buraya Taşı menü seçeneğini seçin.
2. Otomatik İşlevler sekmesini seçin ve İstenen bulanıklaştırmayı 0 μm'ye ve Yinele'yi -2 μm'ye ayarlayın. Otomatik Netleme hazır ayarına geçin ve Otomatik Odaklama işlevini çalıştırmak için Başlat düğmesine tıklayın.
3. Floresan ekranı aşağı indirin ve TEM kullanıcı arayüzünde Doğrudan Hizalamalar menüsünü açın.
4. En iyi sonuçlar için, deneyimli kullanıcılar pivot noktası hizalamalarını doğrulayabilir: Doğrudan Hizalamalar menüsünde nBeam Tilt pp X görevini seçin ve kontrol panellerindeki Çok İşlevli düğmeleri kullanarak zıplayan kirişleri maksimum üst üste bindirin. np Beam Tilt pp Y görevi için bu işlemi tekrarlayın.
5. Enerji filtresi giriş açıklığını gösteren yeşil bir daire göstermek için floresan ekran kamera menüsündeki EF düğmesine tıklayın ve ışını yeşil dairenin üzerine ortalayın.
   NOT: Devam etmeden önce Turbo pompanın durdurulduğundan emin olun; Ondan gelen titreşimler, görünür thon halkalarının sayısını azaltır ve sıklıkla otomatik işlevlerin başarısız olmasına neden olur.
6. Yazılım penceresine geri dönün ve menü çubuğunda Otomatik İşlevler sekmesini seçin.
7. Otomatik Damgalama görevini seçin, Thon Ring hazır ayarına geçin ve Başlat düğmesine basın. (i) çekilen görüntülerin karbon üzerinde olduğundan, (ii) Thon-halkalarının açıkça görülebildiğinden ve (iii) hesaplanan CTF uyumunun (noktalı çizgiler) Thon-ring minima'ya iyi yerleştirildiğinden emin olmak için süreci gözlemleyin (Ek Şekil 2).
8. Otomatik Haberleşme görevini seçin ve Başlat düğmesine basın. Çekilen görüntülerin karbon üzerinde olduğundan ve Thon halkalarının açıkça görülebildiğinden ve hesaplanan uyumların (noktalı çizgiler) Thon-ring minima'ya iyi yerleştirildiğinden emin olmak için süreci gözlemleyin. Fare kaydırma tekerleğini kullanarak her bir Thon-ring görüntüsünü yakınlaştırın (Ek Şekil 3).
   NOT: Mikroskopta bir enerji filtresi varsa, filtre yarığını sıfır kayıplı zirveye ortalamak ve enerji filtresinin prizmasındaki bozulmaları düzeltmek için hizalama sırasının bir parçası olarak enerji filtresi ayarı yapılmalıdır (adım 6.9-6.14). Bu hizalamalar, kırık bir ızgara karesinin içinde olduğu gibi ızgaranın boş bir alanında yapılmalıdır.
9. Sherpa UI'yi açın ve Enerji Filtresi uygulamasını seçin (Ek Şekil 4).
10. Ayarlar penceresinde kamerayı EF-Falcon, bin 4x, pozlama süresi 0,2 s olarak ayarlayın.
11. Sıfır kayıplı enerji filtresi yarığını ortalamak için Sıfır Kayıp seçeneğindeki Orta düğmesine tıklayın.
12. İzokromatisite seçeneğindeki Ayarla düğmesine tıklayın (Ek Şekil 4).
13. Geometrik ve Kromatik Bozulmalar seçeneğindeki Ayar Büyütme ve Ayar Bozulmalarına tıklayın (Ek Şekil 5, Ek Şekil 6)
14. Sonuçlar belirtilen belirtimler dahilinde değilse ve çıktı raporunda kırmızı renkle gösteriliyorsa, adım 6.11'deki hizalamaları yineleyin.
    NOT: Doğrudan elektron dedektörü kazanç referansı aylar boyunca sabit kalabilse de, boş alanların görüntüleri eşit yoğunluk göstermiyorsa, ancak çizgiler veya diğer farklı özellikler gösteriyorsa, Falcon 4 Reference Image Manager kullanılarak yeni bir kazanç referansı alınmalıdır. Alternatif olarak, böyle bir görüntünün Hızlı Fourier Dönüşümünü (FFT) hesaplayın ve hiçbir çizginin görünmediğinden emin olun.
15. Yazılım penceresinde, Hazırlık sekmesini seçin ve Veri Toplama hazır ayarına geçin.
16. Doz ayarını 40 e^-/Ų olarak ayarlayın ve Doz Oranını Ölç düğmesine tıklayın.
17. EPU sekmesine gidin, Otomatik Edinme görevini seçin ve isteğe bağlı olarak Otomatik Sıfır Kayıp işlevini kontrol edin; Tam otomatik veri toplamaya başlamak için Çalıştırmayı Başlat düğmesine tıklayın.

7. Veri toplama sırasında veri kalitesinin izlenmesi ve optimizasyonu

NOT: Veri toplama devam ederken, toplanan veriler veri yönetim portalı üzerinden AYÇ kullanılarak izlenebilir. EQM, hareket düzeltme ve CTF belirleme işlemlerini anında gerçekleştirir ve sonuçları portalda görüntüler. Kullanıcı daha sonra bireysel satın alımların kalitesini değerlendirebilir, çeşitli kalite göstergelerindeki grafiklere bakabilir, istenmeyen alımları filtreleyebilir ve verileri anında veya toplu iş olarak son depolarına aktarabilir.

1. Analiz yazılımının verileri bir web tarayıcısı kullanarak yerleştirdiği veri kümesine gidin.
2. Veri kümesine genel bakışta, edinme kartları hareket düzeltme ve CTF belirleme hakkındaki bilgileri grafik biçiminde görüntüler. Daha fazla bilgi almak için tek tek kartlara tıklayın.
3. DataViz panelini, tam veri kümesinden toplama başına bulanıklaştırma, astigmatizma ve CTF güven aralığını gösteren toplu grafikleri gösterecek şekilde etkinleştirin (Ek Şekil 7).
4. Yalnızca istenen bulanıklaştırma aralığında bulunan, sıfıra yakın astigmatizması olan verileri seçmek için panelin üstündeki filtreleri kullanın ve CTF belirtilen (hedef) çözünürlüğe kadar belirlenebilir. Filtreler ayarlandıktan sonra, veri kümesine genel bakış penceresinde yalnızca seçilen verileri görüntülemek için Uygula düğmesine basın.
5. Elde edilen görüntülerin çoğu belirlenen ölçütler dahilinde olduğunda, veri toplama oturumunun tamamlanmaya devam etmesine izin verin. Elde edilen görüntülerin yalnızca çok küçük bir kısmı belirlenen ölçütleri karşılıyorsa, analiz yazılımı ayarlarını yeniden yapılandırın, numunedeki başka bir alana gidin (analiz yazılımında Next Grid Square düğmesine basın) veya veri toplamayı durdurun.

Sonuçlar

Veri yönetimi portalı, birden fazla deneysel iş akışından toplanan görüntülerin, verilerin ve meta verilerin tek bir yazılım platformunda verimli ve yapılandırılmış bir şekilde depolanmasını sağlar. Oluşturulan bir projedeki her tanımlı deneme, olası deneyler ve tüm kullanım örnekleri için maksimum esneklik ve kullanılabilirlik sağlamak amacıyla herhangi bir kısıtlama olmaksızın örnek bilgileri, toplanan verileri ve ilgili meta verileri yakalamak için müşteri tanımlı adımları içeren bir iş akışından oluşur (Şekil 1, Şekil 2). Veri yönetimi portalı ayrıca, bir projeyle birlikte ilişkilendirilebilen ve raporların ve yayınların analizi ve oluşturulması için mümkün olduğunca eksiksiz bir kayıt sağlayabilen, ara sonuçlarla görüntü işleme de dahil olmak üzere iş akışı adımlarını göstermek için bir laboratuvar notu işlevine sahiptir.

Şekil 1: Veri yönetimi platformundaki verilerin ve meta verilerin olası organizasyonuna örnek. Her proje, kriyo-EM veya kütle-spektroskopi gibi çoklu deneylerden oluşabilir (yani Protokol adım 2.3). Her deneme, her biri birden çok yapılandırılabilir adımdan (ör. Protokol adım 2.7) oluşan birden çok kullanıcı tanımlı iş akışı (ör. Protokol adım 2.5) içerebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Veri yönetimi platformunda açık bir proje iş akışında görüntüleme. Şekilde, iş akışında açılan adımla ilişkili meta veriler ve notlar gösterilmektedir. Simgeleri olan sol çubuk, veri yönetimi platformunun farklı seçeneklerine ve menülerine hızlı erişim sağlar. Sol panelde kaydedilen İş Akışlarının bir listesi ("Exp2_ApoF_EFTEM_Grid7 yalnızca bir kaydedilmiş iş akışı gösterilir") ve yeni bir İş Akışı eklemek için mavi bir düğme bulunur. Orta panel, burada SPA iş akışı için gösterildiği gibi, açılan İş Akışındaki bireysel adımları gösterir. Sağ üstteki mavi düğme, açılan iş akışına ek bir adım ekleyebilir. Sağ panelde, kaydedilen Meta Veriler veya iş akışının kullanıcı girişli Notları için metin, tablo ve görüntüler içerebilen alan bulunur. Metin için farklı biçimlendirme seçenekleri mevcuttur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Vitrobot gibi geleneksel dalma dondurma cihazlarıyla üretilen Cryo-EM ızgaraları tipik olarak ızgara yüzeyi üzerinde bir buz kalınlığı gradyanı gösterecektir. Bazı ızgaralar, manuel kullanımdan ve/veya bir otomatik ızgara halkası taşıyıcısına kırpıldıktan sonra da hasar görebilir (bükülebilir). Şekil 3 , Atlas'a genel bakış'ta gösterildiği gibi farklı ızgara örneklerini göstermektedir. Kalın buz veya hasarlı ızgaralar daha fazla araştırma dışında tutulmalıdır.

Şekil 3: Atlas'a genel bakış'ta görüldüğü gibi farklı ızgaraların galerisi . (A) Kalın buzlu kötü bir ızgara, (B) kötü buz ve buz kirliliği olan bükülmüş bir ızgara, (C) iyi buz gradyanına sahip kabul edilebilir bir ızgara, (D) iyi ince buzlu ve küçük buz gradyanlı tipik bir ızgara. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hasarsız ve optimum buz kalınlığı olan ızgara karelerinin seçimi, yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin toplanması için kritik öneme sahiptir. Buz kalınlığı, tek tek ızgara kareleri düzeyinde bile değişebilir ve bu nedenle, seçilen her ızgara karesinden yalnızca optimum derecede ince buza sahip deliklerin seçilmesi önemlidir. Şekil 4 , ortasında sağlam folyo ve ince buz bulunan uygun bir ızgara karesini göstermektedir. Gösterilen ızgara karesi, seçilen tüm ızgara karelerinde ince buzlu deliklerin otomatik seçimi için bir filtre ayarlamak için iyidir, çünkü bir dizi farklı buz kalınlığının yanı sıra buzsuz boş delikler içerir, bu da Delik Seçimi görevinde buz filtresinde uygun bir yoğunluk aralığı ayarlamak için son derece yararlıdır.

Şekil 4: Merkezdeki boş ızgara karelerinden ve ızgara çubuklarının yakınındaki kalın buzdan buz kalınlığı gradyanına sahip örnek bir ızgara karesi. Buz kalitesi filtresi, ızgara karesinde (yeşil kaplamalı delikler) buna göre seçilen ideal buz kalınlığına sahip deliklerin içindeki yoğunluk aralığını seçmek için kullanılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Açıklanan protokolü kullanan kıyaslama sonuçları, Kikkawa grubu^11'den fare apo-ferritin (apoF) örneği kullanılarak elde edilmiştir. ApoF, çok kararlı bir oktahedral kafes oluşturan oldukça α helisel bir proteindir. Yüksek stabilite ve yüksek simetri, apoF'yi yüksek çözünürlüklü kriyo-EM görüntüleme ve görüntü işleme için en uygun örnek haline getirir. Bu nedenle ApoF, kriyo-EM cihazlarının performansını değerlendirmek için standart bir örnek haline gelmiştir^11,12,13. 15 mg / mL saflaştırılmış apoF örneği içeren dondurulmuş bir aliquot buz üzerinde çözüldü ve 10 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüjleme ile berraklaştırıldı. Süpernatant, 20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl ile 5 mg / mL'ye seyreltildi. Seyreltilmiş numunenin 3 μL'si, 30 s için parıltılı deşarjlı bir R-1.2 / 1.3, 300 örgü altın ızgara üzerine uygulandı. Daha sonra ızgaralar, sıvı azotla soğutulan sıvı etan'a dalmadan önce 5 s boyunca lekelendi. Dalma dondurma, %100 nem ve 4 °C'de tam otomatik vitrifikasyon sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm ızgaralar otomatik ızgaralarda kırpıldı ve 200 kV Cryo-TEM'e yüklendi. Yaklaşık 3000 film, 300 film / s veriminde toplandı. Veriler, aşağıdaki değişikliklerle^11'de açıklanan yöntemler kullanılarak işlenmiştir: i) Relion 3.1 yerine Relion 4-beta sürümü kullanılmıştır, ii) referans olarak önceki apoF rekonstrüksiyonlarının 2D sınıf ortalamaları kullanılarak otomatik parçacık toplama işlemi yapılmıştır ve iii) ilk 3D model, önceki apoF rekonstrüksiyonundan 15-şçözünürlüğe düşük geçirilmiştir. Kullanılan AFIS prosedürü^34'ün, rapor edilen çözünürlüklerde 3B haritaları yeniden oluşturmak için veri kalitesini sınırlamayan ışın eğimi kaynaklı faz kaymalarını verimli ve güvenilir bir şekilde en aza indirdiği kanıtlandığından, bu veri kümesi için optik gruplama yapılmamıştır. Bayes parlatma ve CTF iyileştirmesinden sonra 3D iyileştirme, 1.68 şçözünürlüklü haritaya yol açtı. Çözünürlük, Ewald küre düzeltmesi ile daha da geliştirildi ve 1.63 şçözünürlüklü bir harita elde edildi. Veri toplama ve işleme parametrelerine genel bakış Tablo 2'de gösterilmiştir ve yeniden yapılandırılmış nihai yoğunluk haritası Ek Şekil 8'de gösterilen Fourier Kabuk Korelasyonu (FSC) eğrisi ile Şekil 5'te gösterilmiştir.

Tablo 2: Apo-ferritinin 3D rekonstrüksiyonu için kullanılan veri toplama ve görüntü işleme parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Resim 5: Apo-ferritinin kriyo-EM rekonstrüksiyonu . (Sol panel) 1.6 şçözünürlükte yeniden yapılandırılmış apoF kriyo-EM haritasının 3D gösterimi. (Sağ panel) Yeniden yapılandırılmış haritanın bireysel amino asit yan zincirleri düzeyinde ayrıntılı görünümü. Amino asit yan zincirlerinin yoğunluğu iyi çözülmüştür ve atomik model bu harita içinde açık bir şekilde inşa edilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SPA rekonstrüksiyonlarında enerji filtresi kullanmanın etkileri ve faydaları, T. acidophilum'dan izole edilen prokaryotik 20S proteazom kullanılarak değerlendirildi. Prokaryotik 20S proteazom, proteazom kompleksinin kararlı katalitik çekirdeğini D7 simetrisi ile temsil ettiği için standart bir kriyo-EM örneği olarak da kullanılmıştır. Izgaralar, saflaştırılmış T. acidophilum 20S proteazom örneğinin 4.5 μL'si parıltılı deşarjlı 200 mesh R 2/1 bakır ızgara üzerine eklenerek hazırlandı. Numuneler, 4 °C'ye ve %100 neme ayarlanmış tam otomatik bir vitrifikasyon sistemi kullanılarak sıvı etan/propan karışımında, 20 leke kuvveti ve 4,5 sn'lik leke süresi ile vitrifiye edildi.

Enerji filtresinin farklı bir yarık genişliği kullanılarak benzer ızgara karelerine sahip aynı kriyo-EM ızgarasından üç farklı veri kümesi toplanmıştır: i) yarık tamamen açık (yarık eklenmemiş), ii) 20 eV yarık ve iii) 10 eV yarık. Izgara kareleri, analiz yazılımındaki bir buz kalitesi filtresi kullanılarak seçildi. Veri toplama ve veri işleme için diğer tüm parametreler aynı tutuldu. Veri kümeleri, toplam 4000 filmle 15 saat boyunca toplandı ve Laplacian-of-Gauss parçacık toplama algoritmasının, tam veri kümelerinden referans tabanlı parçacık toplama için ilk 2D sınıf ortalamalarını üretmek için kullanıldığı modifikasyonu ile Relion 3.1 kullanılarak^11'de açıklanan yöntemler kullanılarak işlendi. Rastgele seçilen parçacıkların aynı sayısı (102.200) seçildi ve her veri kümesinin son yinelemesi ve 3B yeniden yapılandırılması için kullanıldı. Veri işleme değişkenleri, Ek Şekil 9'da gösterilen FSC eğrisi ile Şekil 6'da gösterilen nihai yeniden yapılandırılmış EM yoğunluk haritasını elde etmek için aşağıdaki tabloda (Tablo 3) açıklanmıştır. Bu veri kümeleri için optik gruplama ve Ewald küre düzeltmesi de yapılmadı.

Tablo 3: T. acidophilum 20S proteazomunun 3D rekonstrüksiyonu için kullanılan veri toplama ve görüntü işleme parametreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 4: Farklı enerji yarık genişliğine sahip veri kümeleri kullanılarak T. acidophilum 20S proteazomunun kriyo-EM rekonstrüksiyonları için elde edilen çözünürlük ve B-faktörünün özeti. Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 6: Enerji filtrelemenin kriyo-EM görüntüleri üzerindeki etkisi. (A) 10 eV yarık ile veya yarık olmadan toplanan farklı bulanıklaştırma değerlerinde kriyo-EM görüntüleri. (B) Parçalanmış alt birimlere sahip 20S proteazom kriyo-EM haritasına genel bakış. (C) Takılı bir atom modeli ile 20S proteazom haritasında yakınlaştırma görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Analiz yazılımındaki farklı optik ön ayarlar (kırmızı elipsler) arasındaki görüntü kaymalarını hizalamak için görüntü kaymalarının kalibrasyonu, 100x ila 165.000x arasındaki tam büyütme aralığında görülebilen altıgen buz kristalini kullanarak, görevi (sarı elips). (Üstte) Veri Toplama ve Delik/Ösentrik Yükseklik ön ayarları arasında kalibrasyon, Delik/Ösantrik Yükseklik ve Izgara Kare ön ayarları arasında (orta) kalibrasyon, Izgara Kare ve Atlas ön ayarları arasında (alt) kalibrasyon. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Analiz yazılımında otomatik damgalama fonksiyonu (sarı elips). (Sol resim) Elde edilen görüntü. (Doğru görüntü) Elde edilen görüntünün Fourier aktarımı, eşmerkezli Thon halkalarını ve radyal ışınlarda gösterilen CTF uyumlarını göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Koma hizalaması için analiz yazılımındaki Autocoma fonksiyonunun kullanıcı arayüzü (sarı elips). Görüntü paneli, farklı ışın eğimlerinde elde edilen Fourier transfer görüntülerini ve komanın hesaplanmasında kullanılan CTF uyumlarını gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: Enerji Filtresi ayarının kullanıcı arayüzü. Spesifikasyonlar dahilindeki tüm parametrelerle (yeşil metinle gösterilmiştir) enerji filtresi izokromasitesinin iyi bir ayarlama raporu örneği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5: Enerji Filtresi ayarının kullanıcı arayüzü. Spesifikasyonlar içindeki tüm parametrelerle (yeşil metinle gösterilmiştir) enerji filtresi büyütme bozulmalarının iyi ayar raporu örneği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 6: Enerji Filtresi ayarının kullanıcı arayüzü. Enerji filtresi kromatik bozulmalarının spesifikasyonlar dahilindeki tüm parametrelerle (yeşil metinde gösterilmiştir) iyi ayarlanması örneği. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 7: EPU Quality Monitor'ün DataViz paneli, toplanan bir kriyo-EM veri kümesindeki veri kalitesine genel bir bakış. Toplanan tüm görüntülerden/filmlerden toplanan verileri içeren grafikler, CTF uyum güveni (mavi), bulanıklaştırma (turuncu) ve astigmatizma (yeşil) gibi seçilen kritik kalite göstergelerinin değerlerini (nokta grafikleri) ve dağılımını (çubuk grafikler) gösterir. Toplanan görüntülerin/filmlerin bir alt kümesi, DataViz panelinin üst kısmındaki parametre filtreleri ayarlanarak seçilebilir. Filtreler uygulandıktan sonra, seçilen görüntüler/filmler Relion veya CryoSpark gibi başka bir görüntü işleme paketinde daha fazla işlenmek üzere dışa aktarılabilir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 8: Relion 4-beta tarafından bildirildiği gibi, apoF'nin 1.6 şçözünürlüğe nihai rekonstrüksiyonunun FSC eğrisi. Mavi eğri, birbirini dışlayan iki yarı veri kümesinden bağımsız olarak rafine edilmiş iki 3D rekonstrüksiyondan maskelenmiş 3D haritaların FSC'sini gösterir. 0.143'teki altın standart FSC'ye göre, tam veri kümesinden yeniden oluşturulan son 3D haritanın çözünürlüğü 1.6 Å'ye karşılık gelir. Turuncu eğri, rastgele fazlarla maskelenmiş 3D rekonstrüksiyonların FSC'sini gösterir. FSC eğrisinin hızlı düşüşü, kullanılan maskenin ~2 şçözünürlüğün ötesinde orijinal yeniden yapılandırılmış haritaların (mavi eğri) gözlemlenen FSC'sine katkıda bulunmadığını göstermektedir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 9: Relion 3.1 tarafından bildirildiği gibi, enerji filtresinin farklı yarık genişliklerini kullanarak T. acidophilum 20S proteazomunun son rekonstrüksiyonunun FSC eğrileri. Mavi eğriler, sırasıyla her veri kümesinin iki yarım veri kümesinden bağımsız olarak rafine edilmiş iki rekonstrüksiyondan maskelenmiş 3B haritaların FSC'sini gösterir. 0,143'teki altın standart FSC, ilgili tam veri kümelerinden yeniden oluşturulan son 3B haritaların elde edilen çözünürlüklerini gösterir (sırasıyla 2,3 Å, 2,2 şve 2,1 şçözünürlük). Kırmızı eğriler, rastgele fazlara sahip maskelenmiş haritaların FSC'sini gösterir. Kırmızı FSC eğrilerinin hızlı düşüşü, kullanılan maskenin ~3 şçözünürlüğün ötesinde orijinal yeniden yapılandırılmış haritaların FSC'sine katkıda bulunmadığını gösterir. Yeşil eğriler, yeniden yapılandırılmış 3D hacmin tamamındaki gürültüden etkilenen ve bu nedenle maskelenmiş 3D haritaların FSC'sinden daha erken düşen maskesiz 3D haritaların FSC'sini gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Verilerin kullanılabilirliği: Kriyo-EM yoğunluk haritaları EM Veri Bankası'na katılım numaraları altında yatırılmıştır: apoferritin: EMD 14173, EMPIAR-10973. 20S proteazom: EMD 14467, EMPIAR-10976.

Tartışmalar

Açıklanan protokol, kullanılan TEM mikroskobunun optiklerinin iyi hizalanmış bir durumda olduğunu varsayar. Bu Protokolde kullanılan 200 kV TEM için, bu tür sütun hizalamaları, mikroskop kurulumundan veya herhangi bir önemli servis müdahalesinden sonra deneyimli bir servis mühendisi tarafından yapılır, doğrulanır ve kaydedilir. Bu hizalama ayarları mikroskop kullanıcı arayüzünde herhangi bir zamanda geri çağrılabilir. Kullanıcılar, kritik parametreleri yeniden ayarlamak için mikroskop kullanıcı arabirimindeki Doğrudan Hizalama yordamlarını kullanabilir. Top eğimi ve top kaydırma gibi bazı hizalamalar sabittir ve kullanıcılar tarafından günlük olarak ayarlanması gerekmez. Mikroskop süpervizörü tarafından tabanca eğimi ve vites değiştirmenin kontrolleri ve yeniden hizalanması (gerekirse) yılda iki kez tavsiye edilir. Öte yandan, bazı hizalamalar kritiktir ve yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi her veri toplamadan önce hizalanmalıdır (objektif astigmatizm ve komasız hizalama gibi). Analiz yazılımındaki Autocoma işlevi yakınsamazsa, ışın eğimli pivot noktalarının ve/veya dönme merkezinin hizalaması doğrulanmalı ve ayarlanmalı ve C2 diyafram açıklığının doğru ortalanması onaylanmalıdır. Daha sonra, koma düzeltmesi için objektif damgalayıcılar da kullanıldığından, Autostigmate işlevi çalıştırılmalıdır. Bu hizalamalar, hem Autostigmate hem de Autocomafunctions ilk yinelemelerinde başarılı olana kadar yinelenmelidir. Gerekirse, başka bir alan seçilebilir (örneğin, buzsuz karbon folyoyu destekleyebilir), görüntü bulanıklaştırma ayarlanabilir veya elde edilen görüntülerdeki sinyal-gürültü oranını optimize etmek için görüntü yakalama süresi artırılabilir ve elde edilen görüntülerin Fourier dönüşümünde birden fazla Thon halkasının görünürlüğü sağlanabilir.

Modern kriyo-EM mikroskopları, özellikle düşük simetriye sahip proteinler için yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için veri kümesi başına genellikle 1 TB'ı aşan çok miktarda veri üretir. Cryo-EM verileri ve sonuçları da tipik olarak her bilimsel projede yapı-işlev ilişkilerini tam olarak anlamak için ortogonal yöntemlerden elde edilen veriler ve sonuçlarla tamamlanır. Toplanan verilerin organizasyonu, bir görüntü işleme boru hattına aktarılması ve bunun sonucunda ortaya çıkan kriyo-EM rekonstrüksiyonunun ortak çalışanlar arasında paylaşılması, yerel BT altyapılarını kurmak için kriyo-EM metodolojisinin yeni uygulayıcılarına ek gereksinimler getirmektedir. Athena gibi veri yönetimi yazılımları, kayıtlı bir kullanıcı tarafından işletilen herhangi bir bağlı cihaz veya yazılım tarafından elde edilen verilerin merkezi olarak depolanmasını kolaylaştırır. Depolanan verilere ve meta verilere, oturum açma kimlik bilgilerine ve Deneme kurulumundaki veri paylaşımı tanımlarına bağlı olarak farklı erişim haklarına (sahip, ortak çalışan veya görüntüleyici olarak) sahip projede farklı rollere sahip olabilen birden çok kullanıcı tarafından basit bir web tarayıcısı arabirimi kullanılarak erişilebilir. Deneysel iş akışlarının bu şekilde dijitalleştirilmesi, gereksiz çoğaltma olmadan ortak çalışanlar arasında veri ve meta veri paylaşımı için araçlar sağlar ve kullanılan iş akışlarının üretkenliğini ve izlenebilirliğini artırır. Veri yönetimi yazılımında projelerin, deneylerin ve iş akışlarının genel ve özelleştirilebilir bir yapısının uygulanması evrenseldir ve tamamlayıcı yöntemler kullanılarak ortogonal deneylerin tek bir proje veritabanına özelleştirilmesine ve entegre edilmesine olanak tanır.

Bir kriyo-EM ızgarasında veri toplama alanlarının seçimi, yüksek çözünürlüklü veri kümelerinin başarılı bir şekilde elde edilmesi için kritik öneme sahiptir. Vitrobot (tam otomatik bir vitrifikasyon sistemi) gibi geleneksel dalma dondurma cihazlarıyla üretilen Cryo-EM ızgaraları, tipik olarak ızgara yüzeyi üzerinde bir buz kalınlığı gradyanı gösterecektir (Şekil 4). Izgara farklı buz kalınlıklarına sahip alanlar içerdiğinden bu yararlı olabilir; Bununla birlikte, veri toplama için ideal buz kalınlığına sahip alanlar, yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi tanımlanmalıdır. Optimum bir kriyo-EM ızgarası, mümkün olduğunca az transfer buzu kirliliği içermeli ve sağlam delikli destek folyosu ile yeterli ızgara karesi içermelidir. Çatlakları veya kırık alanları olan ızgara kareleri hakkında veri toplanması önerilmez, çünkü toplanan görüntüler, sağlam destek folyosu olan ızgara karelerine kıyasla, bir elektron ışını tarafından aydınlatıldığında önemli ölçüde daha güçlü genel sürüklenmeden etkilenecektir. Kristalin buzun fazlalığı, folyo deliklerinin çoğunu tıkayabilir ve / veya otomatik odaklamaya müdahale edebilir ve bu tür ızgara karelerinden de kaçınılmalıdır. İnce buzlu ızgara kareleri genellikle Atlas ön ayarı kullanılarak çekilen bir görüntüde görülebilen geniş vitreus alanları ve birçok parlak folyo deliği sergiler. Izgara çubuklarına yakın daha kalın buz oluşumu beklenmeli ve ızgara karesinin bu alanlarındaki folyo delikleri Delik Seçimi prosedürü sırasında hariç tutulduğundan kritik değildir. Bir ızgara karesinde birkaç boş deliğin varlığı, çevredeki deliklerdeki vitreus buzunun son derece ince olduğunu ve hasarlı parçacıklar içerebileceğini veya hiç parçacık içermediğini gösterebilir. Genel olarak, hangi alanların yüksek çözünürlüklü veri toplama için en iyi koşullara sahip olduğunu anlamak ve ideal parçacık yoğunluğu ve oryantasyon dağılımını sergilemek için ilk tarama ve değerlendirme için ızgaradaki farklı bölgelerde çeşitli buz kalınlıklarına sahip ızgara karelerini seçmek akıllıca olacaktır. Bu çalışmada kullanılan apoF ve 20S proteazom örnekleri için, gözlemlenebilir en ince buza sahip alanlar, bu örneklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için en iyi koşulları içerir.

Veri toplama yazılımını kullanarak seçilen tüm ızgara karelerinde otomatik olarak delikler seçerken, veri toplama için aşırı kalın, aşırı ince veya beklenmedik şekilde vitreus olmayan karelerin seçilmediğinden emin olmak ve kontrol etmek için her ızgara karesindeki temsili bir delikte Şablon Yürütme görevi gerçekleştirilmesi önerilir. Veri toplama sırasında, toplanan görüntülerin görüntü sürüklenmesi ve CTF uyumu gibi temel kalite göstergeleri AYÇ kullanılarak izlenebilir. Veri toplama daha sonra düşük kaliteli görüntüler veren alanlar atlanarak optimize edilebilir. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü CTF uyumlarına sahip görüntüler, tercih edilen birkaç yönde parçacıklar veya çok ince bir buz tabakasında denatüre edilmiş parçacıklar içeren görüntüleri içerebilir. Toplanan görüntülerden gerçek zamanlı parçacık toplama ve 2D sınıflandırma, görüntülenen parçacıklardaki yapısal verilerin kalitesi hakkında ek bilgi sağlayacak ve buzdaki bozulmamış parçacıkların tercih edilen yönelimlerini veya (kısmen) denatüre parçacıkların tutarsız yapısını ortaya çıkaracaktır. Bu nedenle, sınıf ortalamalarının hesaplanması, daha önce uygulanmış ve diğer yazılım paketlerinde gösterildiği gibi veri toplama için uygun bölgelerin daha da iyileştirilmesine yardımcı olabilir^23,28.

Büyütme, elektron doz hızı ve defokus aralığı gibi veri toplama için görüntüleme ayarlarının seçimi, hedef çözünürlük, proteinin boyutu, numune konsantrasyonu, istenen mikroskop verimi gibi çeşitli kriterlere bağlıdır. Bu deneylerde kullanılan doğrudan elektron dedektörü kamerası için, paralel aydınlatmayı korumak için uygun bir SPOT boyutu ve yoğunluğu seçilerek elektron doz hızı ^{4-5 e-}/pix/s aralığında seçilmiştir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, veri toplama sırasında deliklerin ortalanması için görüntüde yeterli sinyal-gürültü oranını sağlamak üzere Delik/Ösentrik Yükseklik ön ayarında farklı bir SPOT boyutu kullanılabilir. Büyütme, piksel boyutu kriyo-EM rekonstrüksiyonu için hedef çözünürlükten en az 2-3 kat daha küçük olacak şekilde seçilmelidir. Bununla birlikte, daha yüksek büyütme (yani daha küçük piksel boyutu) kullanılır, görüntülerde daha küçük görüş alanı yakalanır ve görüntü başına daha az parçacık vardır, bu da sonuçta 3D haritaları yüksek çözünürlükte yeniden oluşturmak için yeterli parçacık içeren görüntüleri toplamak için daha uzun veri toplama süresine yol açar. apoF örneği için, görüntülerdeki yüksek partikül yoğunluğu için yeterli numune konsantrasyonuna sahip olduğumuz ve rekonstrüksiyonun 2 şaltı çözünürlüğünü hedeflediğimiz için 0,43 şpiksel boyutunu kullandık. 20S proteazom örneği için, elde edilen görüntülerde daha geniş bir görüş alanını kaplamak için 0,68 şpiksel boyutunu kullandık. Tipik olarak 200 kV TEM mikroskoplar için, kriyo-EM görüntüleri 0,8 ila 2,0 μm arasındaki bulanıklaştırma aralığında elde edilir. Bununla birlikte, enerji filtresini kullanan geliştirilmiş kontrast ve sinyal-gürültü oranıyla, daha küçük sapmalar ve buna bağlı olarak CTF zarf işlevinin bozulmasının azalması nedeniyle elde edilen görüntülerdeki yüksek çözünürlüklü bilgileri daha iyi korumak için veri alımları odaklanmaya çok daha yakın yapılabilir. Ayrıca, enerji filtresi kullanılarak görüntü kontrastı zaten yeterince geliştirilirken diyafram açıklığı ek görüntü sapmalarına neden olabileceğinden, objektif bir diyafram açıklığı da kullanmıyoruz. apoF ve 20S proteazom örnekleri için 0,5 μm, 0,7μm ve 0,9 μm bulanıklaştırma ayarlarını kullandık. Daha küçük proteinler için (<200 kDa), parçacıkların kontrastını iyileştirmek ve ~2,5 şçözünürlüklü 3D haritalara (yayınlanmamış sonuçlar) yol açan 3D rekonstrüksiyonun 3D iyileştirme adımında daha kolay parçacık toplamayı ve ilk kaba hizalamayı kolaylaştırmak için -0,5 μm, -0,7 μm ve -0,9 μm'lik defokus ayarlarını kullandık.

Bir enerji filtresiyle görüntülemenin, üst düzey 300-kV TEM mikroskoplarında toplanan kriyo-EM görüntülerinde sinyal-gürültü oranını (SNR) geliştirdiğini daha önce göstermiştik¹¹. Aslında, elektronlar bir numuneden geçtiğinde, iki ana etkileşim türü meydana gelir: i) Elastik olarak dağılmış elektronlar enerjilerini korur ve faz kontrast mekanizması aracılığıyla saçılmamış olay ışınına müdahale ederek görüntü oluşumuna katkıda bulunur ii) elastik olarak dağılmış elektronlar numunede bir miktar enerji kaybeder ve esas olarak görüntülerdeki gürültüye katkıda bulunur. Bu nedenle, SNR, gelen ışından daha düşük enerjiye ve elastik olarak dağılmış elektronlara sahip olan elastik olarak dağılmış elektronları dar bir enerji yarığı kullanarak filtreleyerek önemli ölçüde geliştirilebilir. Bununla birlikte, yüksek çözünürlüklü kriyoEM veri kümelerinin uzun (12+ saat) otomatik veri alımı boyunca çok dar (10 eV veya daha küçük) yarıklar kullanabilmek için Selectris veya Selectris-X gibi yeterince kararlı bir enerji filtresi kullanmak çok önemlidir.

300 kV TEM mikroskoplarla aynı koşullarda 200 kV TEM mikroskoplarla elde edilen kriyo-EM görüntüleri, CTF zarf fonksiyonlarının daha hızlı bozulması nedeniyle yüksek çözünürlükte (özellikle <4 Å) daha küçük SNR sergiler. Sonuç olarak, 200 kV TEM'ler kullanıldığında belirli bir çözünürlüğe ulaşmak için daha fazla sayıda parçacık (ve dolayısıyla daha fazla sayıda toplanan görüntü) gereklidir. Ek olarak, alan derinliği (2-3 şçözünürlük aralığında 10-25 nm) 200 kV görüntülerde yaklaşık% 20 daha küçüktür 35, yani buz tabakasındaki daha az parçacık (tipik olarak 20-50 nm kalınlığında) tamamen odakta olacak ve^3D yeniden yapılandırma prosedürünün sonraki aşamalarında her parçacık için bağımsız olarak bulanıklaştırma değerleri rafine edilmedikçe, hesaplanan bir 3D rekonstrüksiyonun tüm yüksek çözünürlüklü özelliklerine yapıcı bir şekilde katkıda bulunacaktır. Daha büyük parçacıklar için (ikosahedral viryonlar veya diğer makromoleküler montajlar gibi), parçacık boyutu yüksek çözünürlüklerde alan derinliğini aşabilir ve standart 3D rekonstrüksiyon algoritmalarında Ewald küresinin düzlemsel yaklaşımı nedeniyle faz hatalarına neden olabilir³⁶. Bu hatalar, yaygın kriyo-EM görüntü işleme paketlerinde zaten uygulanmakta olan gelişmiş algoritmalarla rafine edilebilir^37,28,39. Ewald küresi 200 kV veride 300 kV veriden daha büyük eğriliğe sahip olduğundan, Ewald küre düzeltmesi nispeten daha düşük çözünürlüklerde ve / veya 200 kV TEM'ler kullanıldığında nispeten daha küçük makromoleküler montajlar için gereklidir. Öte yandan, 200 kV görüntüler, 200-300 keV elektron ortalama serbest yoldan (220-280 nm) önemli ölçüde daha ince olan ince buzdaki (20-50 nm) parçacıkların daha yüksek kontrastını sergiler. Daha yüksek kontrast, özellikle yapısı henüz bilinmeyen ve 3B referans modeli henüz iyi kurulmamış olan daha küçük proteinlerin zayıf bir şekilde saçılması için bireysel parçacıkların doğru küresel hizalamasını iyileştirmeye yardımcı olur.

Burada, 20S proteazom örneğinde, 200 kV TEM mikroskobu kullanıldığında görüntü kontrastı ve kalitesinin bir enerji filtresi ile benzer şekilde iyileştirilebileceğini gösterdik. Aynı sayıda parçacık kullanılarak, 20 eV yarık kullanılarak toplanan veriler, yalnızca 2.34 şçözünürlüğe yeniden yapılandırılan tamamen açık enerji yarığı ile toplanan verilere kıyasla, 2.26 şçözünürlüğe yeniden yapılandırıldı. En iyi rekonstrüksiyon, 2.14 şçözünürlüğe yeniden yapılandırılan 10 eV yarık kullanılarak toplanan verilerden elde edildi. Bu sonuçlar, elastik olarak dağılmış elektronların filtrelenmesinin, toplanan görüntülerde SNR'yi arttırdığı ve Tablo 4'te özetlendiği gibi, verilen parçacık sayısından kriyo-EM rekonstrüksiyonlarında daha yüksek çözünürlüğü kolaylaştırdığı teorik tahminiyle uyumludur. Bu sonuçlar, enerji filtreli veri kümelerinde daha yüksek görüntü kalitesini gösteren bu veri kümelerinden hesaplanan B faktörleri tarafından daha da doğrulanmıştır.

Bu nedenle, 300 kV TEM mikroskoplarının kriyo-EM rekonstrüksiyonlarında en yüksek verimi ve mümkün olan en yüksek çözünürlüğü sağlarken, 200 kV TEM mikroskoplarının da yüksek çözünürlüklü kriyo-EM rekonstrüksiyonları için yüksek kaliteli veri setleri sağladığı sonucuna varabiliriz. Burada, elde edilen görüntülerin kalitesinin ve dolayısıyla genel yapı süresinin, bir enerji filtresi ve bir doğrudan elektron dedektörü ile donatılmış 200 kV TEM kullanılarak daha da geliştirilebileceğini gösterdik. Sunulan Protokol, bu kurulumu kullanarak yüksek çözünürlüklü kriyo-EM verilerinin rutin olarak nasıl elde edileceğine dair gerekli tüm adımları açıklamakta ve yapısal biyoloji ve yapı tabanlı ilaç tasarımındaki temel yapı-işlev ilişkilerini anlamak için gerekli olan makromoleküler 3D yapıların ince yapısal ayrıntılarını ortaya koymaktadır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoGrid rings	Thermo Fisher Scientific	1036173	Package of 100x AutoGrid rings for the standard EM grids.
C-Clip	Thermo Fisher Scientific	1036171	Package of 100 clips that secure the standard EM grids inside the AutoGrid rings.
Data Management Platform	Thermo Fisher Scientific	1160939	Part of the Glacios base configuraiton; includes Athena Software
EPU Quality Monitor	Thermo Fisher Scientific	1179770
EPU Software	Thermo Fisher Scientific	1025080	Part of the Glacios base configuration
Ethane 3.5	Westfalen	A06010110	Ethane gas used for making liquid ethane (puritiy at least N35, i.e. 99.95% vol)
Falcon 4 200kV	Thermo Fisher Scientific	1166936	Direct electron detector
Glacios	Thermo Fisher Scientific	1149551	200 kV TEM
GloQube Plus Glow Discharge System for TEM Grids and surface modification	Quorum	N/A	also available via Thermo Fisher Scientific (PN 1160602)
QuantiFoil grids	Quantifoil	N/A	R-2/1, 300 mesh; carbon foil grid
Relion	MRC Laboratory of Molecular Biology	N/A	open source software: https://relion.readthedocs.io/en/release-3.1/
Selectris with Falcon 4 for 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191753	Energy filter
Selectris X with Falcon 4 for 200 kV	Thermo Fisher Scientific	1191755	Energy filter
UltrAuFoil grids	Quantifoil	N/A	R-1.2/1.2, 300 mesh; gold foil grids
Vitrobot Mk. IV	Thermo Fisher Scientific	1086439	Automated vitrification system
Whatman 595 filter paper	Thermo Fisher Scientific	AA00420S