Hücre Dışı Vezikül Analizi için Donma-Kırık Elektron Mikroskobu

Özet

Bu yazıda, kanserli ürotelyal hücrelerden kaynaklanan hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izolasyonu ve donma-kırılması için bir protokol sunulmaktadır. Dondurarak kırılma tekniği, EV'lerin çapını ve şeklini ve benzersiz bir özellik olarak EV membranlarının iç organizasyonunu ortaya çıkardı. Bunlar, EV'lerin alıcı membranlarla nasıl etkileşime girdiğini anlamada büyük önem taşımaktadır.

Özet

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hücrelerden hücre dışı boşluğa salınan membranla sınırlı yapılardır ve hücreler arası iletişimde rol oynarlar. EV'ler, mikro-parçacıklar (MV'ler), eksozomlar ve apoptotik cisimler olmak üzere üç vezikül popülasyonundan oluşur. EV'lerin sınırlayıcı zarı, alıcı hücrelerle etkileşimlerde çok önemlidir, bu da biyolojik olarak aktif moleküllerin alıcı hücrelere aktarılmasına yol açabilir ve sonuç olarak davranışlarını etkileyebilir. Donma-kırık elektron mikroskobu tekniği, biyolojik membranların iç organizasyonunu incelemek için kullanılır. Burada, kültürlenmiş kanserli ürotelyal hücrelerden MV izolasyonu ve MV'lerin donma-kırılması için hızlı donma, kırılma, replikaların yapılması ve temizlenmesi ve transmisyon elektron mikroskobu ile analiz edilmesi adımlarında bir protokol sunulmaktadır. Sonuçlar, izolasyon protokolünün, MV'lerin şekline ve boyutuna karşılık gelen homojen bir EV popülasyonu verdiğini göstermektedir. Bu nedenle, dondurarak kırılma, MV'lerin çapını, şeklini ve membran proteinlerinin dağılımını karakterize etmek için tercih edilen tekniktir. Sunulan protokol diğer EV'ler popülasyonları için geçerlidir.

Giriş

Hücre dışı veziküller (EV'ler), hücrelerden hücre dışı boşluğa salınan membran sınırlı veziküllerdir. EV'lerin üç ana popülasyonu, kökenleri, büyüklükleri ve moleküler bileşimleri ^1,2,3 bakımından farklılık gösteren eksozomlar^, mikro-parçacıklar (MV'ler) ve apoptotik cisimlerdir. EV'lerin bileşimi, donör hücrenin moleküler profilini ve fizyolojik durumunu (yani, sağlıklı veya hastalıklı) ^{yansıtır4,5}. Bu, EV'lere insan hastalıklarının teşhisi, prognozu ve tedavisinde muazzam bir potansiyel verir ve kişiselleştirilmiş tıpta kullanım için umut verici tıbbi uygulamalara sahiptirler ^6,7,8.

EV'ler hücreler arası iletişimin aracılarıdır. Alıcı hücredeki biyolojik süreçlere müdahale eden ve davranışını değiştirebilen biyolojik olarak aktif proteinler, lipitler ve RNA'lar içerirler ^9,10. Bununla birlikte, EV sınırlayıcı membranın bileşimi, alıcı hücre zarı ile etkileşim için çok önemlidir.

EV'lerin kaynakları vücut sıvıları ve şartlandırılmış kültür ortamıdır. Bir EV popülasyonunu izole etmek için uygun bir izolasyon tekniği kullanılmalıdır. Örneğin, 10.000 × g'daki santrifüjleme , MV'lerde zenginleştirilmiş bir fraksiyon verirken, 100.000 ≥ g'lık × merkezkaç kuvvetleri, eksozomlarda zenginleştirilmiş bir fraksiyon^{verir 11,12}. EV'lerin izole fraksiyonu saflık, boyut ve şekil açısından doğrulanmalıdır. Bu amaçla, Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği 2018, üç sınıf yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği önerdi: elektron mikroskobu, atomik kuvvet mikroskobu ve ışık mikroskobu tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi¹³. Bu tekniklerin hiçbiri EV membran iç kısmı hakkında bilgi sağlayamaz.

Dondurarak kırılmış elektron mikroskobu, donmuş numunelerin iç yapılarını ortaya çıkarmak için kırılması, özellikle de membranın iç kısmının bir görünümünü vermesi tekniğidir. Numune hazırlama adımları (1) hızlı dondurma, (2) kırılma, (3) replikanın yapılması ve (4) replikanın temizlenmesi^14'tür. 1. adımda, numune (isteğe bağlı olarak) kimyasal olarak sabitlenir, gliserol ile kriyo-korumalı ve sıvı freonda dondurulur. 2. adımda, dondurulmuş numune, membran çift katmanının içini açığa çıkaran bir dondurarak kırılma ünitesinde kırılır. 3. adımda, açıkta kalan kırık yüzler, kopyalar üretmek için platin (Pt) ve karbon (C) ile gölgelenir. 4. adımda, organik madde çıkarılır. Replika, transmisyon elektron mikroskobunda (TEM) analiz edilir. Mikrografların doğru yorumlanması için, doğru yönelimleri için kılavuz ilkelere uyulmalıdır^14,15. Kısaca, mikrograftaki gölgelerin yönü, mikrografı yönlendirmek (yani, Pt gölgelemesinin yönünü belirlemek için) ve sonuç olarak dışbükey ve içbükey şekilleri belirlemek için bir referanstır (Şekil 1). Membran çift katmanının kırık yüzleri olarak adlandırılan iki iç görünüm, membranın donma-kırılma yoluyla bölünmesinin bir sonucu olarak görülebilir: protoplazmik yüz (P-yüzü) ve ekzoplazmik yüz (E-yüz). P-yüzü, hücre protoplazmasına bitişik membran broşürünü temsil ederken, E-yüzü, hücre dışı boşluğa bitişik membran broşürünü temsil eder. İntegral membran proteinleri ve bunların birliktelikleri çıkıntılı membran içi parçacıklar olarak görülür^14,15.

Burada amaç, MV'leri boyut, şekil ve sınırlayıcı membranlarının yapısı açısından karakterize etmek için dondurarak kırılma tekniğini uygulamaktır. Burada, insan invaziv mesane kanserli ürotelyal hücrelerden kaynaklanan MV'lerin izolasyonu ve dondurarak kırılması için bir protokol sunuyoruz.

Protokol

1. Kanserli ürotelyal hücrelerin kültürlenmesi ve EV'lerin izolasyonu

NOT: İnsan invaziv mesane kanseri ürotelyal (T24) hücre hattından EV'leri elde etmek için bir protokol sunulmuştur. Bununla birlikte, kültürleme koşullarının diğer hücre tiplerini kullanmak için optimize edilmesi gerekir.

1. Üç şişede 3 × 10⁴ hücre/cm2 yoğunluğa sahip Plaka^T24 hücreleri (75^cm2'lik büyüyen yüzey) ve hücrelerin 37 ° C'de 3 gün boyunca bir CO 2 inkübatöründe kültürlenmesi ve% 5 CO₂ ile başlar (Şekil 2A).
   1. T24 hücreleri için% 5 fetal sığır serumu (FBS), 4 mM Glutamax, 100 mg / mL streptomisin ve 100 U / mL penisilin ile desteklenmiş 1: 1 (v / v) A-DMEM ve F12 karışımında bir kültür ortamı kullanın.
      NOT: Aşağıdaki izolasyon, MV'lerde zenginleştirilmiş EV'ler verir. İzolasyona başlamadan önce, canlılığı ve birleşmeyi doğrulamak için hücreleri bir ışık mikroskobu ile inceleyin (Şekil 2B). T24 hücreleri% 70 birleştiğinde EV'leri şartlandırılmış kültür ortamından toplamaya başlayın.
2. Kültür ortamını MV'lerle şişelerden (T75) bir pipetle konik santrifüj tüplerine toplayın (Şekil 2C). 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın (Şekil 2D).
3. Süpernatantı pipetle birlikte yeni bir santrifüj tüpüne dikkatlice toplayın (Şekil 2E).
4. Süpernatantı 4 ° C'de 20 dakika boyunca 2.000 × g'de santrifüj yapın.
5. Süpernatantı pipetle birlikte dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne toplayın.
6. 4 °C'de 40 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj. Tüpün dibinde beyazımsı bir pelet olup olmadığına bakın.
   NOT: Gerekirse, gerekli g-kuvvetine ulaşmak için santrifüj rotorunu değiştirin. EV peleti, santrifüj tüpünün dibinde beyaz bir pelet olarak görülür (Şekil 2F); pipetleme sırasında peleti kaybetmemek için yerini işaretleyin (Şekil 2G).
7. Süpernatantı bir pipetle dikkatlice atın. Pelet'e 1,5 mL PBS ekleyin ve MV'leri içeren peleti yeniden askıya alın. süspansiyonu yeni bir santrifüj tüpüne koyun.
8. 4 ° C'de 40 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj yapın ve tüpün dibinde beyaz bir pelet olup olmadığına bakın.
   NOT: EV peleti, santrifüj tüpünün dibinde beyaz bir yama olarak görülür; pipetleme sırasında peleti kaybetmemek için yerini işaretleyin.
9. Süpernatantı bir pipetle dikkatlice atın. Fiksatif,% 2.5 glutaraldehiti 0.1 M sodyum kakodilat tamponuna (pH 7.2) yavaşça ekleyin. 4 °C'de 20 dakika bekletin (Şekil 2H).
   DİKKAT: Glutaraldehit ve sodyum kakodilat toksiktir. Bir duman başlığında çalışın, koruyucu eldiven giyin ve uygun şekilde atın.
10. Fiksatifi bir pipetle dikkatlice çıkarın. Pelet üzerine yıkama tamponu (0,1 M sodyum kakodilat tamponu) ekleyin. Peleti yeniden askıya almadan 4 ° C'de 10 dakika bekletin.

2. EV'lerin dondurulması

NOT: Donmadan önce, önce kriyonumuneleri gliserol ile koruyun.

1. 0.1 M sodyum kakodilat tamponu hazırlayın. Yıkama tamponunu çıkarın ve 0.1 M kakodilat tamponuna 50 μL% 30 gliserol ekleyin. Çözeltiyi homojen hale getirmek için EV'leri nazikçe yeniden askıya alın. 4 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
2. Bakır taşıyıcıları ultrasonik banyoda merkezi bir çukurla kloroform ile 5 dakika boyunca temizleyin (Şekil 3A). Birden fazla numune kullanıyorsanız bunları hava ile kurutun ve renklerle işaretleyin (Şekil 3B). Kullanana kadar, taşıyıcıları kuru ve temiz bir yerde saklayın (örneğin, Petri kabındaki lens kağıdında). Taşıyıcılara çıplak elle dokunmayın.
   1. Pipetler, çözeltiler, filtre kağıdı, cımbız, stereomikroskop, freon ve sıvı azotlu (LN₂) bir Dewar şişesi, metal bir çubuk ve kriyovyaller hazırlayın. LN₂ ile soğutun.
      DİKKAT: Koruyucu ekipman giyin ve LN₂ ve soğutulmuş freon kullanırken buna göre çalışın.
3. Donmadan önce EV'leri tekrar askıya alın. Hava kabarcıkları oluşumundan kaçının.
   NOT: 2.4-2.7 arasındaki adımları hızla uygulayın.
4. Bir stereomikroskop altında çalışın (Şekil 3C). Numunenin 1.5-1.7 μL'sini bakır taşıyıcının merkezi çukuruna aktarın ve numuneyi kenardan dökmezken bakır taşıyıcı kenarından daha yükseğe ulaşan dışbükey bir damla yapın (Şekil 3D). Aşırı dökülme durumunda, taşıyıcının dış halkasını kurutmak için filtre kağıdı kullanın.
5. Katılaşmış freonu tekrar sıvılaştırmak için metal bir çubukla karıştırın (Şekil 3E).
6. Bakır taşıyıcının dış halkasını cımbızla tutun ve 8 s boyunca cımbızı hafifçe sallayarak soğutulmuş freonun içine daldırın (Şekil 3F). 8 saniye sonra, taşıyıcıyı LN₂ ile dolu başka bir Dewar şişesine hızlı bir şekilde aktarın.
7. Numuneleri LN_2'de kırmaya veya saklamaya hemen devam edin. İkinci durumda, bir kriyovalı işaretleyin ve şişe ve cımbız uçlarını LN_2'ye batırarak soğutun (Şekil 3G). LN 2 altında, dondurulmuş bakır taşıyıcıları şişeye toplayın, kapatın ve donma kırılmasına kadar LN₂ kabında (Şekil 3H) saklayın.

3. EV'lerin kırılması ve kopyaların yapılması

NOT: Dondurarak kırma ünitesini üreticinin kullanım talimatlarına göre hazırlayın. (Şekil 4A). Ünitenin haznesini temizleyin. Platin (Pt/C) ve karbon (C) tabancalarını sırasıyla 45° ve 90° açılarda konumlandırın (Şekil 4B).

1. Ünite vakum sistemini çalıştırın. 6,6 × 10−² Pa (5 × 10⁻⁴ Torr) basınca ulaşıldığında, ünite haznesini -150 ° C'ye soğutun.
2. Dondurulmuş numuneli bakır taşıyıcıları kuru cımbız kullanarak dondurarak kırma ünitesine aktarın (Şekil 4C). Numunenin çözülmesini ve buz kristallerinin birikmesini önlemek için kriyotransfer kullanın veya hızlı çalışın. Taşıyıcıları numune tablasına sabitleyin.
3. Vakum tekrar 6,6 × 10−^{2 Pa'ya} (5 × 10⁻⁴ Torr) ulaşana kadar bekleyin ve ardından bıçak sıcaklığını -100 ° C'ye ayarlayın (Şekil 4D).
4. Vakum 1,0 × 10−^{3 Pa'ya} (8 × 10⁻⁶ Torr) ulaşana kadar bekleyin.
5. Dürbünle numuneyi gözlemleyin ve bıçağa dikkatlice yaklaşın (Şekil 4E).
6. Bıçağın motorlu hareketini (Şekil 4F) ve numunenin yüzeyi pürüzsüz olana kadar kesiti açarak numuneyi kesitlemeye başlayın (Şekil 4G).
7. Kırılma için, bıçağın motorlu hareketini kapatın ve bıçağın yavaş manuel kontrolüne devam edin, böylece numuneyi kırın (Şekil 4H). Kırık yüzeyi gölgelenmeye kadar buz kristalleri ve döküntüler oluşturmaktan korumak için, bıçağı kırık numunenin üzerine getirin.
8. Pt gölgelemesini 45°'de sürdürün (Şekil 4I, J).
   1. Bir kronometre hazırlayın ve/veya donma kırma ünitesindeki kuvars kristal monitörü açın, bu da numune üzerindeki Pt kalınlığının denetlenmesini sağlar. Kuvars kristal monitörde ölçülen Pt tabakasının önerilen kalınlığı 2,5 nm'dir, bu da belirli bir yüksek gerilim ve akımda 4 s gölgelemeye karşılık gelir (yani, Pt gölgeleme hızı 0,63 nm / s'dir).
   2. Gölgelemeye başlamadan önce, bıçağı numuneden uzağa taşıyın. Pt / C tabancasına (1.600 V) yüksek gerilim uygulayın ve akımı 60 mA'ya yükseltin. Pt kıvılcımları görünmeli ve örneği gölgelemeye başlamalıdır. Bu noktada, 4 s geri sayımı başlatın ve / veya kuvars kristal monitörde Pt konumunu gözlemleyin ve bulun.
      NOT: C tabakasının önerilen kalınlığı 2,5 nm'dir, bu da belirli bir yüksek gerilim ve akımda 10 s gölgelemeye karşılık gelir.
   3. İstenilen Pt kalınlığı elde edildiğinde akımı ve yüksek gerilimi kapatın.
9. C gölgelemesini 90°'de sürdürün (yani, C gölgeleme hızı 0,25 nm/sn'dir).
   1. C tabancasına (1.900 V) yüksek gerilim uygulayın, akımı 90 mA'ya yükseltin ve C kıvılcımları görünmeli ve numuneyi gölgelemeye başlamalıdır; o anda, 10 s geri sayımına başlayın. İstenilen C kalınlığı elde edildiğinde akımı ve yüksek gerilimi kapatın.

4. Replikaların temizlenmesi ve replika analizi

1. Numune tablasındaki bakır taşıyıcıları kullanın ve cımbızla porselen 12 delikli bir plakada oda sıcaklığında damıtılmış suya aktarın (Şekil 4K). Kopyalar su yüzeyinde yüzerken, taşıyıcılar batar (Şekil 4L).
2. Kopyaları damıtılmış sudan bir tel halkayla sodyum hipoklorit içeren bir kuyuya aktarın. Bir duman davlumbazında oda sıcaklığında gece boyunca örtün ve bırakın.
   DİKKAT: Sodyum hipoklorit toksiktir. Bir duman başlığında çalışın, koruyucu eldiven giyin ve uygun şekilde atın.
3. Kopyaları ddH₂O'ya aktarın ve 30 dakika boyunca yıkayın. 3 kez tekrarlayın.
4. Kopyaları bir tel döngü ile bir ağ bakır TEM ızgarasına aktarın (örneğin, kare veya petek 100+ ağ). Izgaraları 2 saat boyunca hava ile kurutun ve mikroskopiye kadar ızgara saklama kutusunda saklayın.
   NOT: Genel olarak, ızgaralar karanlık, kuru, oda sıcaklığı koşullarında aylarca saklanabilir.
5. Kopyaları görüntülemek ve mikrograflar elde etmek için bir TEM mikroskobu kullanın.
   1. Bunu yapmak için, bir kopya ile bir TEM ızgarası takın ve üreticinin kullanım kılavuzlarına göre TEM görüntülemeyi başlatın. 80 kV veya 100 kV'ta çalışın.
6. Numuneyi inceleyin ve TEM'deki bir kamera ile daha düşük ve daha yüksek büyütmelerde mikrograflar elde edin.
7. MV'lerin mikrograflarını analiz edin. OG çaplarının ölçümleri için Fiji/ImageJ yazılımı^16'yı kullanın. MV'lerin çapı, Hallett ve ^ark.17'ye göre mikrograflardaki ölçümün 4/π katıdır.

Sonuçlar

MV'ler, diferansiyel santrifüjlemelerden sonra kanser ürotelyal T24 hücrelerinin şartlandırılmış ortamından izole edildi. Protokolü takiben, EV fraksiyonu ilk olarak beyaz bir pelet olarak görüldüğünde 10.000 × g'de santrifüjlemeden sonra tespit edildi (Şekil 2G).

Daha sonra, EV'ler yukarıdaki protokole göre işlendi ve TEM altında incelendi. Pt / C gölgelemesi, temizleme adımı sırasında sıklıkla daha küçük parçalara ayrılan nispeten büyük kopyalar üretti (Şekil 4L). Büyük kopyalar ve bunların daha küçük parçaları TEM ızgarasında toplandı ve mikroskop altında karşılaştırıldı. Sonuçlar, boyutlarından bağımsız olarak replika yüzeylerinin kalitesinde hiçbir fark göstermedi ve bu nedenle hepsi kullanılabilir. Düşük büyütme incelemeleri, kopyanın i) homojen bir yüzey (arka plan), ii) içbükey ve dışbükey küresel profiller (veziküller) ve iii) hasarlı yüzey bölgeleri (artefaktlar; Şekil 5A). Tipik eserler kopmalar, kıvrımlar ve düzensiz karartma gölgeleri (yani, numune üzerindeki buz-kristal birikintilerinin kopyaları) olarak görülüyordu. Ayrıca, numunenin saflığını doğrulayan hiçbir hücre kalıntısı veya hücresel organel görülmediğine dikkat etmek de önemlidir (Şekil 5B).

İzole veziküller genellikle üç veya daha fazla küme halinde toplandı veya ayrı ayrı dağıtıldı (Şekil 5B). Veziküller küreseldi, bu da izolasyon, fiksasyon ve donma sırasında ultrayapının iyi korunduğunu gösteriyor (Şekil 5C). Ara sıra görülen "yassı bilye" ve uzatılmış veziküller (Şekil 5C), muhtemelen preparatın eserleriydi ve vezikül çapının sonraki ölçümlerine dahil edilmedi. Görünür profillerin çapı 238.5 nm (±8.0 nm, n = 190) idi ve Hallett ve ^ark.17 tarafından önerilen düzeltme faktörünü dikkate alarak, ortalama vezikül çapı 304 nm (±10 nm; Şekil 5D). Boyut, 100 nm ile 1000 nm arasındaki MV'lerin çap aralığıyla ilişkilidir ve kullanılan izolasyon protokolünün etkinliğini kanıtlar. Veziküllerin görüntüleri, çap tayini ile birlikte, izolattaki EV'lerin MV'lerle zenginleştirildiğini kesin olarak doğruladı.

Replikaların analizi, OG sınırlayıcı membranların P-yüzü ve E-yüzünün organizasyonunu ortaya koymuştur. MV'ler kırık düzlemini yansıtan içbükey ve dışbükey yuvarlak şekiller (Şekil 5C,E,F) olarak gözlendi. Dışbükey şekiller E-yüzleri temsil eder (yani, zarların kırık ekzoplazmik broşürü; Şekil 5E). EV'lerin ekzoplazmik yüzleri pürüzsüz, düzgün bir görünüme sahipti. İçbükey şekiller P-yüzlerine karşılık gelir (Şekil 5F). P-yüzlerinde, düz membranlar içinde birkaç çıkıntılı membran içi partikül görüldü (Şekil 5C, F). Bu, kanser ürotelyal T24 hücrelerinden izole edilen MV'lerin sadece düşük miktarda membran proteini içerdiği anlamına gelir.

Şekil 1: Donma-kırılma sonrası membran tayininin şematik sunumu . (A) Mikro-parçacıklar plazma membranından hücre dışı boşluğa tomurcuklanır. (B) Mikro-parçacık, broşürleri bölen ve kırık yüzler olarak adlandırılan broşürlerin iç görünümlerini açığa çıkaran donma fraksiyonuna kadar P- ve E- membran broşürü ile sınırlıdır. (C) Pt / C gölgelemesinden sonra, iki kırık yüz ayırt edilebilir: sitoplazmaya bakan dışbükey bir şekle sahip protoplazmik yüz (P-yüzü) ve hücre dışı boşluğa bakan içbükey bir şekle sahip ekzoplazmik bir yüz (E-yüz). Şekil 1 , Biorender.com kullanılarak oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: EV'lerin izolasyonu. (A) Bir CO 2 inkübatöründe yetiştirilen_T24 hücreleri, MV izolasyonundan önce canlılıklarını ve birleşimlerini doğrulamak için (B) bir ışık mikroskobu ile incelenir. (C) Hücre kültürü ortamı toplanır ve (D) süpernatant her toplandığında 300 × g ve 2.000 × g (E)'de ardışık olarak santrifüj edilir. (F,G) 10.000 × g'da santrifüjlemeden sonra, bir peleti gösteren beyaz bir yama görünür ve işaretlenir. Süpernatant çıkarılır ve (H) fiksatif pelet üzerine tekrar askıya alınmadan dikkatlice eklenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: EV'lerin dondurulması . (A) Merkezi bir çukura sahip hava ile kurutulmuş temiz bakır taşıyıcılar, işlenmeden önce (B) işaretlenmiştir. Mikro-parçacıklar, homojen bir numune almak için gliserol içinde yeniden askıya alınır ve (C) bir stereomikroskop altında bir cooper taşıyıcısının merkezi bir çukuruna eklenir. (D) Numunenin bir hacmi, merkezi çukurda dışbükey bir damla oluşturacak şekilde eklenmelidir. (E) Donmadan hemen önce, freonu sıvılaştırmak için LN₂ soğutmalı freonu metal bir çubukla karıştırın. (F) Numuneyi freona batırarak dondurun ve ardından (G) LN_2'ye aktarın. (H) Dondurulmuş numuneye sahip taşıyıcılar kriyovyallere toplanabilir ve bir LN₂ Dewar kabında saklanabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Resim 4: Donma-kırma ve replika yapma. (A) Donma-kırma ünitesi. Ünite odasının (B) içinde bir platin (Pt) ve karbon (C) elektron tabancası, bir bıçak ve numune tablosu bulunur. (C) Kırılmaya başlamak için, numune ile taşıyıcılar numune tablasına aktarılır, (D) dondurarak kırma ünitesi soğutulur ve bir vakum oluşturulur. (E) Kesitleme, bıçağın motorlu (F) hareketi ile yapılır, ancak kırılma tercihen manuel olarak yapılır. (G) Kesitlemeden önce numune ve (H) kırılmadan sonra numune. (I) Kırılmadan hemen sonra, kopya yapılır. (J) Bu işlem sırasında, Pt numune üzerinde gölgelenir. Platin gölgeleme, odada parlak bir ışık (kıvılcımlar) olarak görülür. (K) Numune taşıyıcılar, suyla doldurulmuş bir porselen içinde toplanır. (L) Temizleme adımı sırasında sodyum hipoklorit çözeltisinde yüzen replika (ok). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Dondurularak kırılmış ve Pt/C gölgeli MV'lerin elektron mikrografları. (A) Donarak kırılmış ve gölgelenmiş EV peletine genel bakış (i) daha düşük büyütmede. Homojen yüzey arka plandır (ii), parlak alanlar kopyalardaki yırtılmalardır (iii), daha karanlık alanlar kopyaların kıvrımlarıdır (yıldız işareti) ve düzensiz karartma gölgeleri buz kristallerinden (iki yıldız) kaynaklanır. (B) İçbükey ve dışbükey yüzeyli yuvarlak şekilli EV'lerin kümesi. (C) EV'lerin yüksek büyütmesi. EV membranlarının P-yüzünü sergileyen dışbükey kırıklarda, membran içi parçacıklar (oklar) ve pürüzsüz bir yüzeyin yamaları (ok uçları) görülür. Uzun (yıldız) ve düz top şekillerine (iki yıldız) sahip hücre dışı veziküller bulunur. (D) İzole ürotelyal MV'lerin ortalama çapı, Hallett ve ark.17 tarafından önerilen boyut ölçümlerine göre 304 nm ± ¹⁰ nm'dir. Veriler ortalama ± SEM. (E,F) MV'lerin E-yüzü ve P-yüzü olarak sunulmuştur. Gösterge: oklar = P-yüzündeki membran içi parçacıklar, çevrelenmiş oklar = Pt / C gölgeleme yönü. Ölçek çubukları: A = 10 μm, B-F = 400 nm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

MV'lerin veya izole EV'lerin diğer popülasyonlarının karakterizasyonu, "omik" çalışmaları veya fonksiyonel çalışmalar^11,18 gibi aşağı akış analizlerine başlamadan önce başlamak için birincil öneme sahiptir. Burada, insan invaziv mesane kanseri ürotelyal T24 hücrelerinden EV'ler santrifüjleme ile izole edildi ve dondurucu-kırık elektron mikroskobu ile analiz için sağlanan protokolü takiben, izole fraksiyonun MVs^11,13'te zenginleştirildiğini gösterdik. MV'lerin izolatı hücre kalıntılarından veya organellerden yoksundu ve bu da başarılı bir izolasyon ve saflaştırma protokolünü doğruladı.

Protokolün kritik adımları olan kimyasal fiksasyon ve donma kombinasyonu, EVs^12'nin küresel şeklini korudu. Bununla birlikte, EV çapını dondurarak kırarak değerlendirirken önlemler alınması gerekmektedir¹⁷. Kırık numuneden rastgele geçtiğinden, MV membranları ekvatoral ve ekvator olmayan düzlemlerine ayrılır. Dondurularak kırılmış ve gölgelenmiş örneklerin görüntülerini analiz etmek için titiz bir yöntem sağlamak için, Hallett ve ark. ortalama vezikül çapının, görüntü^17'deki veziküler çapın gerçek boyutunun 4 / π katı olduğunu göstermiştir. Bunu hesaba katarak, T24 hücrelerinden EV'lerin, MV'nin 100-1000 nm¹⁹ teorik boyut dağılım aralığına uyan 304 nm çapa sahip olduğu hesaplandı.

Donma-kırılma, EV'leri görselleştirmek için en yaygın kullanılan TEM tekniği olan negatif boyamayı destekleyebilir. Negatif boyama ile, numune genellikle kimyasal olarak sabitlenir, kurutulur ve bir TEM ızgarasına bağlanır ve uranil çözeltisi ile kontrast oluşturur. Destekleyici medya olmadan, EV'ler çökme eğilimindedir, bu da onlara fincan şeklinde bir görünüm verir. Donma-kırılma yoluyla, MV'lerin hücre dışı boşluklarda ve vücut sıvılarında şekillerini yansıtan küreler olduğunu gösteriyoruz¹². Bu sayede, sonuçlarımız kriyo-ultra ince bölüm^20'deki EV'lerin gözlemleriyle de uyumludur.

Dondurarak kırılma tekniğinin önemli bir avantajı, EV'lerin alıcı membranlara nasıl hedeflendiğini ve onlarla nasıl etkileşime girdiğini anlamada kilit bir faktör olan sınırlayıcı membranın iç organizasyonunu çözme gücüdür. Burada, MV'lerin membranlarını analiz ettik, ancak donma-kırılma, diğer EV'lerin popülasyonlarının membran organizasyonunu ortaya çıkarabilir. MV'ler plazma membran tomurcuklanması ile oluşur; bu nedenle plazma membran proteinleri ve protein kümelerinin MV membranında bulunması beklenir. Sonuçlarımız, T24 hücrelerinden MV'lerin membran içi parçacıklar içerdiğini ve integral membran proteinleri sunduğunu destekledi. E-yüz ve P-yüzü arasındaki partikül dağılımına dayanarak, MV'lerde gözlenen parçacıkların, ürotelyal hücreye özgü^21,24 olan transmembran proteinleri üroplakinler olmasını beklemek mantıklıdır. Gözlenen parçacıklar seyrekti, bu da ürotelyal karsinogenez^21,22,23 sırasında üroplakinlerde bir azalma bildiren önceki çalışmalara göre. Bununla birlikte, MV membranlarının protein bileşimini daha fazla araştırmak için, dondurarak kırık replikası immün etiketleme (FRIL) tekniğinin kullanılması önerilir. FRIL, sunulan dondurucu kırık tekniğinin bir yükseltmesidir ve antikor tanıma^24,25 ile replikalardaki proteinlerin kimliğini ortaya çıkarmaya adanmıştır. Özetlemek gerekirse, donma-kırılma tekniği, EV sınırlayıcı membranın karakterizasyonunun yanı sıra izole edilmiş EV fraksiyonlarının şekli, boyutu ve saflığı için uygun bir elektron mikroskobu tekniğidir. Sunulan protokol, izole EV'lerin diğer popülasyonlarının değerlendirilmesi için de kullanılabilir; Bu nedenle, donma-kırma tekniği, EV sınırlayıcı membranların organizasyonunu araştıran çalışmalar için Uluslararası Hücre Dışı Veziküller Derneği kılavuzlarına dahil edilmeyi hak etmektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-DMEM	ThermoFisher Scientific, USA	12491015
Balzers freeze-fracture device	Balzers AG, Liechtenstein	Balzers BAF 200
Centrifuge	Eppendorf, Germany	model 5810R
CO2 incubator HeraCell	Heraues, Germany
Copper carriers	Balzers	BB 113 142-2	100+ mesh
Copper grids	SPI, United States	2010C
Culture flask T75	TPP, Switzerland		growing surface 75 cm2
F12 (HAM)	Sigma-Aldrich, Germany	21765029
FBS	Gibco, Life Technologies, USA	10500064
Glazed Porcelain Plate 6 Well	Fischer Sientific, United States	50-949-072
Glycerol	Kemika, Croatia	711901	final concentration 30 % (v/v)
Glutaradehyde	Serva, Germany	23114.01	final concentration 2.5 % (v/v)
GlutaMAX	Gibco, Life Technologies	35050-079	final concentration 4 mM
Penicillin	Gibco, Life Technologies	15140163	final concentration 100 U/ml
Phase-contast inverted microscope	Nikon, Japan	model Eclipse
Rotor	Eppendorf, Germany	A 4-44
Rotor	Eppendorf, Germany	F-34-6-38
Serological pipetts	TPP, Switzerland		50mL volume
Sodium hypochloride solution in water	Carlo Erba, Italy	481181
Stereomicroscope	Leica, Germany
Streptomycin	Gibco, Life Technologies	35050038	final concentration 100 mg/mL
Transmission electron microscope	Philips, The Netherlands	model CM100	working at 80 kV
Tweezers	SPI, United States