Biyomimetik Kalp Kapağı Broşürleri Üretmek için 3D Baskı ve Elektrospinning'i Birleştirme

Özet

Sunulan yöntem, üç boyutlu (3D) iskelelerde (örneğin, kalp kapağı broşürleri) biyomimetik lif yapılarının mühendisliği için yenilikçi bir yol sunmaktadır. Şekil ve boyutları belirlemek için 3D baskılı, iletken geometriler kullanıldı. Fiber oryantasyonu ve özellikleri her katman için ayrı ayrı ayarlandı. Tek bir kurulumda birden fazla numune üretilebilir.

Özet

Elektrospinning, kardiyovasküler doku mühendisliğinde yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelmiştir, çünkü ayarlanabilir özelliklere sahip (mikro) lifli iskeleler oluşturma imkanı sunmaktadır. Bu çalışmanın amacı, iletken 3D baskılı toplayıcılar kullanılarak insan kalp kapak broşürlerinin mimari lif özelliklerini taklit eden çok katmanlı iskeleler oluşturmaktır.

Aort kapak çıkıntılarının modelleri, ticari bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur. İletken polilaktik asit, 3D baskılı broşür şablonlarını üretmek için kullanıldı. Bu cusp negatifleri, özel olarak tasarlanmış, dönen bir elektrospinning mandreline entegre edildi. İnsan kalp kapakçıklarının lif oryantasyonunu taklit ederek kollektör üzerine üç kat poliüretan döndürüldü. Yüzey ve lif yapısı taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile değerlendirildi. Floresan boya uygulaması ayrıca çok katmanlı lif yapısının mikroskobik olarak görselleştirilmesine izin verdi. İskelelerin biyomekanik özelliklerini değerlendirmek için çekme testi yapıldı.

Elektrospinning makinesi için gerekli parçaların 3D baskısı, düşük bir bütçe için kısa sürede mümkün oldu. Bu protokolü takiben oluşturulan aort kapak çıkıntıları üç katmanlıydı, fiber çapı 4.1 ± 1.6 μm. SEM görüntüleme, liflerin eşit dağılımını ortaya koydu. Floresan mikroskobu, farklı hizalanmış liflere sahip ayrı katmanları ortaya çıkardı ve her katman tam olarak istenen lif konfigürasyonuna ulaştı. Üretilen iskeleler, özellikle hizalama yönü boyunca yüksek çekme mukavemeti gösterdi. Farklı toplayıcıların yazdırma dosyaları Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5 olarak kullanılabilir.

Son derece uzmanlaşmış bir kurulum ve iş akışı protokolü ile, karmaşık fiber yapılara sahip dokuları birden fazla katman üzerinde taklit etmek mümkündür. Doğrudan 3D baskılı toplayıcılar üzerinde dönmek, düşük üretim maliyetleriyle 3D şekillerin üretiminde önemli ölçüde esneklik sağlar.

Giriş

Kardiyovasküler hastalık batı ülkelerinde önde gelen ölüm nedenidir ¹. Bu alanda kapsamlı araştırmalar yapılmakla birlikte, dejeneratif kalp kapak hastalığının yükünün önümüzdeki yıllarda daha da artacağı tahmin edilmektedir². Cerrahi veya girişimsel kalp kapağı replasmanı terapötik bir seçenek olarak mümkündür. Bu noktada, her ikisi de bireysel dezavantajları olan mekanik ve biyoprotez kalp kapakçıkları mevcuttur. Mekanik kapaklar trombojeniktir ve ömür boyu antikoagülasyon gerektirir. Biyolojik kapaklar antikoagülasyon gerektirmese de, yeniden yapılanma eksikliği, yüksek oranda kireçlenme ve eşlik eden bozulma^{gösterirler 3}.

Doku mühendisliği kalp kapakçıkları, vücuda in vivo yeniden modellemeye izin veren mikrofibröz bir iskele sokarak bu dezavantajları ele alabilir. Elektrospinning (ESP), desellülarizasyon, mikro kalıplama, sprey, daldırma kat ve 3D biyobaskı gibi çeşitli yöntemler mevcuttur. Bu yöntemler, belirli özellikler oluşturmak, daha ucuz ve daha hızlı olmak veya sadece alternatif eksikliği nedeniyle seçilebilir. Yöntemler ve malzemeler daha karmaşık yapılar oluşturmak için birleştirilebilir⁴. Örneğin, ESP, doku mühendisliğinde iskeleler oluşturmak için standart bir teknik olmuştur, farklı malzemelerin kombinasyonuna ve lif çaplarının, lif yönelimlerinin ve gözenekliliklerinin ayarlanmasına izin verir⁴. Ayrıca, çeşitli son işlem teknikleri, optimize edilmiş doku yeniden modellemesine, gelişmiş hemouyumluluğa ve elektrospun iskelelerinin ayarlanabilir biyolojik bozunmasına izin verir ^5,6,7.

Temel ESP, fiber hizalama derecesi ve elde edilen fiber çapları⁸ üzerinde doğrudan etkisi olan statik veya döner toplayıcılar kullanır. Üretim kısıtlamaları nedeniyle, klasik ESP döner kolektörleri dönen tamburlardan, disklerden, tellerden veya metal çubuklardan oluşur. 3D baskının tanıtılması, geleneksel üretim teknikleriyle sınırlı olmayan daha kişiselleştirilmiş koleksiyoncu geometrilerinin oluşturulmasına izin verir. Bu kişiselleştirme özellikle kalp kapağı broşürleri gibi 3D yapıların oluşturulması için yararlıdır.

İnsan kalp kapak broşürlerinin doğal üç katmanlı (fibroza, spongiosa, ventricularis) mimarisi, dokuların kalp döngüsü sırasında maruz kaldıkları mekanik kuvvetlere ve kesme stresine verdikleri tepkidir ^9,10. Lamina fibrozanın lifleri çevresel olarak yönlendirilirken, lamina spongiosa lifleri rastgele hizalanır ve lamina ventrikülaris radyal olarak hizalanır. Bu nedenle, karşılık gelen lif yönelimlerine sahip üçlü bir katmanın, bu valflerin özelliklerini doku mühendisliği yapılmış bir iskelede taklit etmesi önerilmektedir.

İş akışı protokolü, 3D baskı ve elektrospinning kullanarak üç katmanlı, 3D kalp kapağı broşürleri üretmek için yenilikçi bir yöntem açıklar. Ek olarak, her katmanda doğru fiber oryantasyonunu sağlamak için bir kalite kontrol adımı sunulmaktadır.

Protokol

1. Hazırlık çalışmaları

1. 3D baskı
   NOT: Aşağıdaki adımlar, bu makaleyle birlikte Ek Dosya 1, Ek Dosya 2, Ek Dosya 3, Ek Dosya 4 ve Ek Dosya 5 olarak sağlanan "Standart Üçgen Dili " (STL) dosyalarının indirilmesini gerektirir. Kollektör parçaları STL dosyaları olarak sağlanır. Bağlantı flanşı, toplayıcının bireysel kurulumlara uyacak şekilde ayarlanmasına izin vermek için "Ürün model verilerinin değişimi için STandard" (STEP) dosyası olarak sağlanır. Ayrıca, ek Dosya 6 olarak geleneksel üretim için merkezi metal çubuklar için teknik bir çizim sağlanmıştır.
   1. Dilimleme yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve aktif yazıcı kafasını iletken olmayan polilaktik asit (PLA) ve 0,4 mm'lik bir nozul için yapılandırın.
      NOT: Dilimleme yazılımı, filament ve nozul çapı mevcut 3D yazıcıya bağlı olarak değişebilir.
   2. STL dosyalarını Specimen_mount_A (Ek Dosya 3) ve Speciment_mount_B (Ek Dosya 4) dilimleme yazılımına yükleyin.
   3. Modelleri döndürün, böylece üçgen yüzeyler yapı plakasına yerleştirilir.
   4. Tüm parçaları işaretleyin, sağ tıklayın ve Seçili Modelleri Çarp'ı seçin. Kopya Sayısı istemine 1 girin ve Tamam'ı tıklatın. Yapı plakasına toplam dört model yerleştirin.
   5. Dilim kalınlığını 0,1 mm'ye, duvar kalınlığını 1 mm'ye, dolgu yoğunluğunu %40'a ayarlayın ve Destek Oluştur kutusunun işaretini kaldırın.
   6. Dilimle düğmesini tıklatın | Yazdırma dosyasını bir USB sürücüsüne kaydetmek için Çıkarılabilir'e Kaydet.
   7. İletken olmayan PLA'yı yazıcıya yükleyin ve yazdırma dosyasını başlatın.
   8. Baskı tamamlandıktan sonra, modelleri yapı plakasından çıkarın ve alt köşelerde bükülme olup olmadığını kontrol edin.
   9. Dilimleme yazılımında, malzeme parametrelerini saklayın ve modelleri Collector_Flange (Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 5) ve Leaflet_Template (Ek Dosya 2) ile değiştirin.
   10. Flanşı döndürün, böylece düz dairesel yüzey yapı plakasına karşı olur. Ek olarak, broşür şablonunu döndürün, böylece kare yüzey doğrudan yapı plakasına yerleştirilir.
   11. Flanşı işaretleyin ve modeli adım 1.1.4'teki gibi çarpın. Yapı plakasındaki flanş modelinin 1 kopyasını ve 1 orijinalini almak için Tip 1.
   12. Broşür modelini işaretleyin ve 1.1.4'te açıklanan adımları izleyerek toplam dokuz broşür modeli almak için 8 ile çarpın.
   13. Dilim kalınlığını 0,1 mm'ye, duvar kalınlığını 1 mm'ye, dolgu yoğunluğunu %80'e ayarlayın ve Destek Oluştur kutusunun işaretini kaldırın.
   14. Dilimle düğmesini tıklatın | Yeni yazdırma dosyasını bir USB sürücüsüne kaydetmek için Çıkarılabilir'e Kaydet.
   15. İletken PLA'yı yazıcıya yükleyin ve yazdırma işlemini başlatın.
   16. Baskıyı tamamladıktan sonra, modelleri yapı plakasından çıkarın. Broşürün altındaki tek tek filament liflerini, broşür modellerinde mevcutsa (hiçbir destek yapısı kullanılmadığından) bir tel kesici ile dikkatlice çıkarın.
2. İplik eğirme çözümü
   DİKKAT: Tetrahidrofuran (THF) ve dimetilformamid (DMF), solunmaması veya cilde temas etmemesi gereken zararlı çözücülerdir. Solvente dayanıklı eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanırken bunları kullanırken kesinlikle tavsiye edilir. Onları kullanırken, son derece uçucu oldukları için bir egzoz kaputunun altında çalışın.
   1. Egzoz davlumbazının altına bir ölçek yerleştirin ve üzerine 200 mL'lik bir vidalı kapaklı cam şişe yerleştirin. Ölçeği daral.
   2. Cam şişeye 50 mL DMF ve 50 mL THF dökün. Çözücülerin ağırlığına dikkat edin.
   3. Şişenin içine manyetik bir çubuk yerleştirin, şişeyi manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin ve açın.
   4. Belirtilen ağırlığı 0,15 (= %15 w/v) ile çarpın ve karşılık gelen miktarda poliüretanı (PU) çözücü karışımını içeren cam şişeye yavaşça aktarın (DIN 1310).
   5. Şişeyi kapatın ve homojen bir çözelti elde etmek için oda sıcaklığında en az 12 saat karıştırın.

2. Elektrospinning kurulumu

1. Meclis
   NOT: Sunulan toplayıcı ile oluşturulan broşür iskeleleri nispeten küçük olduğundan, isteğe bağlı olarak büyük çaplı bir tambur mandrel (D: 110 mm) kullanılması önerilir. Bu, mikroskobik, biyouyumluluk ve biyomekanik değerlendirme için faydalı olacak daha büyük, çok katmanlı iskelelerin oluşturulmasına izin verir.
   1. 3D baskılı parçaları ve altı adet M3 x 15 vidayı kullanarak kolektörü monte edin.
   2. Metal çubukları flanşlardan birine sabitlemek için üç vida kullanın.
   3. Metal çubuklar arasında bir Specimen_mount_B kaydırın. Şablonların boşluklarının flanşın ters yönünde olduğundan emin olun.
   4. Specimen_mount_B üç yuvasını kalp kapağı broşür şablonlarıyla doldurun.
   5. Specimen_mount_A üste yerleştirin ve boşlukları şablonlarla doldurun.
   6. Başka bir Specimen_mount_A kaydırın ve boşlukları şablonlarla doldurun.
   7. İkinci Specimen_mount_B en üste koyarak şablonları düzeltin.
   8. İkinci flanşı üstüne yerleştirin ve sabitlemek için M3 vidalarını kullanın.
      NOT: Broşür şablonlarının hepsinin aynı yöne (broşürün düz kenarının metal çubuklara paralel olarak) yönlendirildiğinden emin olun.
   9. Birleştirilmiş broşür toplayıcıyı elektrospinning kurulumuna yerleştirin ve flanşları motor eksenine (yani M6 vidaları ve kanat somunları) sıkıca sabitleyin (Şekil 1).
      DİKKAT: İletken PLA normal PLA'dan daha kırılgan olduğundan, yapışmayı önlemek için malzemeye baskı uygulayan cıvataları sabitlerken 1,4 Nm'de bir tork anahtarı kullanın.
   10. Kollektörden 30 cm uzağa bir iğne tutucu yerleştirin.
   11. İğne tutucusunda düz bir uçla 14 gauge (G) bir iğneyi sabitleyin ve toplayıcının ekseninin yüksekliğine sabitleyin.
   12. İğnenin Luer kilit portuna esnek, solvente dayanıklı (örneğin, politetrafloroetilen (PTFE)) bir tüp bağlayın.
       NOT: DMF ve THF birçok plastiği çözer. Bu çözücülerle çalışırken çözücüye dayanıklı malzemelerin, örneğin metal ve cam aletlerin kullanılması gerekir. Plastik aletler gerektiğinde (örneğin, şırınga veya boru), çözücüye dayanıklı malzemeler kullandığınızdan emin olun.
   13. Polimer dolgulu şırınganın daha sonra bağlanması için tüpü şırınga pompasına yönlendirin.
2. Güç kaynağı ünitesinin (PSU) bağlantısı
   DİKKAT: Kurulum sırasında, güç kaynağının ana güç kaynağıyla bağlantısının kesildiğinden emin olun.
   1. Güç kaynağının anot ve katotuna iki ekranlı, yüksek voltajlı kablo bağlayın.
   2. Bir timsah klipsi kullanarak, katoda (- kutup) bağlı kabloyu 14 G iğnesine bağlayın. Klips ve iğne arasındaki bağlantıyı kontrol edin. Ardından, yüksek voltajlı kabloyu yönlendirin, böylece paraziti önlemek için eğirme alanının dışına çıkar.
   3. Bir timsah klipsi ve ikinci yüksek voltaj kablosu kullanarak toplayıcıyı anoda (+ kutup) bağlayın. Kollektörün flanşında temas oluşturmak için sıyrılmış kablo kullanarak bir kontak halkası veya kayar kontak kullanın.
3. Şırınganın hazırlanması
   NOT: Bu adım, eğirme işlemi başlamadan hemen önce gerçekleştirilmelidir.
   1. 20 mL'lik bir Luer-lock şırıngasını adım 1.2'de hazırlanan eğirme çözeltisiyle doldurun.
   2. Şırıngayı çözücüye dayanıklı tüpe bağlayın ve iğnenin ucunda bir damlacık görünene kadar çözeltiyi manuel olarak boru sistemine itin.
   3. Şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin. Pompayı açtıktan sonra, aşağıdaki parametreleri girin: çap: 19.129 mm; hacim: 5 mL; hız 3 mL / s.

3. Elektrospinning işlemi

1. Motor test çalışması
   NOT: Toplayıcının 3B baskı kullanarak üretilmesi, toplayıcının merkez dışı hareketine neden olabilir. Bu nedenle, daha düşük devir hızlarına sahip, ancak yüksek voltaj içermeyen bir test çalışması şiddetle tavsiye edilir.
   1. Bilgisayardaki simgeyi çift tıklatarak motor kontrol yazılımını açın.
   2. Bağlan düğmesine tıklayarak motor kontrolüne bağlanın .
   3. Bağlandıktan sonra, Profil hızı çalışma modunu seçin ve ekranın sol üst köşesinde bulunan İşlem sekmesine tıklayın.
   4. Kırmızı çizgiyle çerçevelenmiş Hızlı durdurma düğmesinin altındaki Profil hızı sekmesini seçin. Aşağıdaki ayarları yazın: Hedef hız: 200 rpm; profil ivmeleme: 100; profil yavaşlaması: 200; hızlı durak: 5000.
      NOT: Dönme yönü iğne tarafında yukarı doğru olmalıdır, bu da "hedef hız" alanındaki işareti "+" dan "-" ye değiştirerek ayarlanabilir.
   5. Test çalışmasını başlatın ve toplayıcıda herhangi bir dengesizlik olup olmadığını denetleyin. Toplayıcı sorunsuz çalışıyorsa, protokole devam edin. Aksi takdirde, motoru durdurun ve toplayıcıyı adım 2.1.9'da açıklandığı gibi yeniden ayarlayın.
   6. Etkin düğmeyi tıklatarak motoru durdurun ve Hedef hızı 2.000 rpm olarak değiştirin.
2. Üretim süreci
   NOT: Elektrospinning, çevresel parametrelere yüksek bağımlılığı olan bir işlemdir. 21-24 °C arasındaki bir sıcaklıkta %15-20 bağıl nem arasında optimum elektrospinning sonuçları elde edildi.
   1. Birinci Katman
      NOT: Kurulum aşamasında, iğnenin ucunda kurutulmuş bir PU damlacığı oluşmuş olabilir. Gerekirse uzun, iletken olmayan bir alet kullanarak damlacığı çıkarın.
      1. Motor kontrol yazılımında, motoru açmak için Çalıştırmayı Etkinleştir düğmesine tıklayın.
      2. Yüksek voltajlı güç kaynağını açın ve hem anot hem de katot için voltajı ayarlayın: eksi kutup (iğne): 18 kV; artı kutup (kollektör): 1,5 kV.
      3. Şırınga pompasını 3 mL/s akış hızında çalıştırın.
      4. Bir zamanlayıcıyı 20 dakikaya ayarlayın.
      5. Terzi konisinin oluşumu için iğne ucunu gözlemleyin. İğne ucundaki koninin şekline bağlı olarak, katottaki voltajı, kararlı bir terzi konisi kurulana kadar ±100 V'luk artışlarla ayarlayın.
         NOT: Damla asılıysa, voltaj çok düşüktür. Bununla birlikte, kararsız akış, voltajın çok yüksek ayarlandığını gösterebilir.
      6. Cusp şablonlarının liflerle yeterince kaplanması için 20 dakika bekleyin.
      7. Şırınga pompasını kapatın.
      8. Güç düğmesini çevirerek PSU'yu kapatın.
      9. Motor kontrol yazılımındaki Anahtarı etkinleştir düğmesini tıklatarak motoru durdurun.
         DİKKAT: Sistemdeki hareketli parçaların yaralanmasını önlemek için, test odasını açmak için toplayıcı tamamen durana kadar bekleyin.
   2. İkinci Katman
      1. Motor kontrol yazılımında, giriş alanı Hedef hızını 10 rpm'ye değiştirin.
      2. 3.2.1.1-3.2.1.9 arasındaki adımları yineleyin.
   3. Üçüncü Katman
      NOT: İskeleler tamamen kurumadan önce, mekanik strese karşı son derece hassastırlar. 3.2.3.2-3.2.3.6 adımlarını uygularken çok dikkatli olun. Bu adımlar sırasında iskelelere / liflere dokunmaktan kaçının, çünkü iskele işe yaramaz hale gelebilir.
      1. Kollektör flanşlarını motor eksenine bağlayan vidaları dikkatlice açın ve broşür toplayıcıyı (Şekil 2B) elektrospinning cihazından çıkarın.
      2. Bir neşter kullanarak, elektrospun liflerini her bir broşür şablonunun dış konturu boyunca kesin (Şekil 2C).
      3. Kollektörün bir tarafındaki flanşı çıkarın.
      4. 3B baskılı ekleri dışarı çekin ve broşür şablonlarını iletken olmayan üçgen tutuculardan ayırın.
      5. Tüm broşür şablonlarını 90° döndürün ve toplayıcıyı yeniden birleştirin.
      6. Kollektörü elektrospinning kurulumuna takın ve sıkıca sabitleyin.
      7. Yine, eğirme işlemine devam etmeden önce herhangi bir balanssızlık olup olmadığını kontrol edin.
      8. Motor kontrol yazılımında, giriş alanı Hedef hızını 2.000 rpm'ye değiştirin.
      9. 3.2.1.1-3.2.1.9 arasındaki adımları yineleyin.
         NOT: Elektrospinning işlemini bitirdikten sonra, borunun tıkanmasını önlemek için borunun ve iğnenin saf DMF ile yıkanması şiddetle tavsiye edilir.
   4. Floresan boyalı iskeleler (opsiyonel)
      NOT: Floresan boyalar, lifleri geleneksel bir floresan mikroskobu altında görünür kılmak için kullanılır. Bu sadece yöntemi uygularken ve yeni ayarlar uygulandıktan sonra kalite kontrol için gereklidir. Floresan boyaların kullanılması, yerleşik ayarları kullanarak iskele üretilirken önerilmez.
      1. Adım 1.2'de hazırlanan eğirme çözeltisini ayrı şişelerde üç eşit parçaya bölün.
      2. Bir ölçek kullanarak, polimer çözeltisinin her gramı (ağırlıkça% 0.1) için 1 mg floresan boya ölçün. Üç floresan boyanın tümü için de tekrarlayın (yani, Floresein, Teksas Kırmızısı, 4',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]).
      3. Boyayı eğirme çözeltisine ekleyin, şişe kapağını kapatın ve 2-3 saat veya homojenizasyona kadar karıştırın.
         NOT: Floresan boyaların solmasını önlemek için, eğirme çözeltisini mümkün olduğunca ışıktan koruyun, yani manyetik karıştırıcının üzerine opak bir kapak yerleştirerek. Floresan boyalı iskeleler için süreç, adım 3.2.1-3.2.3'te açıklanan standart prosese çok benzer.
      4. Adım 3.2.1'de, standart şırıngayı ilk floresan boyayı içeren eğirme çözeltisiyle doldurulmuş bir şırınga ile değiştirin.
      5. Adım 3.2.2'de, şu anda kullanılan boru ve iğneyi yenileriyle veya temizlenmiş olanlarla değiştirin. Daha sonra, şırınga pompasına ikinci floresan boyayı içeren eğirme çözeltisi ile bir şırınga yerleştirin.
      6. Adım 3.2.3'te yine, boruyu ve iğneyi yenileriyle veya temizlenmiş olanlarla değiştirin ve şırıngayı üçüncü floresan boyayı içeren eğirme çözeltisi ile doldurulmuş bir iğneyle değiştirin.
         NOT: Üretim sürecinde gecikmeyi önlemek için, üç set boru ve iğne kullanmak faydalıdır. Alternatif olarak, tüp ve iğne, sistemde floresan boya içeren hiçbir eğirme çözeltisi kalmayıncaya kadar katmanların üretimi arasında THF ve DMF ile iyice yıkanabilir.

4. Son işleme ve numune alımı

1. Son işlem iskeleleri
   1. Kollektörü elektrospinning cihazından çıkarın.
   2. Bir neşter kullanarak, adım 3.2.3.2'de açıklandığı gibi her şablonu tabanında serbest bırakın.
   3. Yukarıda açıklandığı gibi toplayıcıyı açın ve şablonları tabandan aşağıya doğru bir tepsiye yerleştirin.
   4. Tepsiyi gece boyunca 40 °C'de bir kurutma kabinine yerleştirin.
   5. Numuneler tamamen kuruduktan sonra, fazla lifleri çıkarmak için broşür şablonunun kenarlarını dikkatlice kesmek için bir neşter kullanın.
   6. Daha sonra, şablonun broşür iskelesini dikkatlice soyun ve daha fazla işlem için bir tepsiye yerleştirin.

Sonuçlar

Bu protokol, kalp kapakçıklarının kardiyovasküler doku mühendisliğinde kullanılmak üzere tasarlanmış üç katmanlı bir broşür iskelesinin geliştirilmesini amaçlamaktadır. Doğal insan kalp kapağındaki üç katmanın kollajen konfigürasyonunu taklit eder. Her katman, toplam çapı 4.1 ± 1.6 μm olan liflerden oluşur (Şekil 1).

Resim 1: Lif özellikleri. Liflerin analizi: Toplam lif sayısı; μm cinsinden çap: ortalama, mod, standart sapma, minimum çap, maksimum çap. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Broşür şablonları Ø 24 mm aort kapak protezine uyacak şekilde tasarlanmıştır (Şekil 2C). Kuruduktan sonra, broşür iskeleleri 3D kalp kapağı ucunun şeklini korudu (Şekil 3A).

Resim 2: Elektrospinning kurulumu. (A) Döner kurulumda monte edilmiş 3D baskılı kolektör; (B) 3D yazdırılabilir toplayıcının CAD render'ı; (C) B'de gösterilen kalp kapağı broşürünün negatif CAD gösterimi; üçgen yakınlaştırılmış kısmı gösterir. Kısaltma: CAD = bilgisayar destekli tasarım. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hizalanmış ve hizalanmamış tabakaları değerlendirmek için SEM görüntüleme kullanıldı (TEMP F3512-21). Fotoğraflar bir iskele üzerinde üç farklı yerde 100x, 500x ve 2.000x büyütmede çekildi. Hizalanmış fiber iskeleler pürüzsüz bir yüzeye ve çevresel yönde sıkı bir oryantasyona sahip olarak ortaya çıkar (Şekil 3B). 2.000x görüntünün fiber oryantasyonuna göre görsel analizi, liflerin birincil hizalamasını doğrular (Şekil 3C). Hizalanmamış fiber iskeleler, hizalanmış liflere kıyasla benzer şekilde pürüzsüz bir yüzey gösterir. Lif oryantasyonu düzensizdir ve lifler arasında birçok belirgin kesişim vardır (Şekil 3D). Daha sonraki görsel analizler, birincil yönelim görünür olmayan liflerin hizalanmadığını doğrular (Şekil 3E).

Resim 3: Elektrospun broşürü ve SEM görüntüleme. (A) Elektrospun çok katmanlı broşür ve 3D baskılı broşür toplayıcı; (B) Hizalanmamış liflerin SEM görüntüsü (büyütme 1.000x); (C) Hizalanmamış liflerin lif oryantasyon analizi; (D) Hizalanmış liflerin SEM görüntüsü (büyütme 1.000x); (E) Hizalanmış liflerin lif oryantasyon analizi. Ölçek çubukları = 10 mm (A), 100 μm (B, D). Kısaltma: SEM = taramalı elektron mikroskobu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Floresan boyalı çok katmanlı iskelelerin görüntülenmesinde farklı lif yönelimlerine sahip üç ayrı katman ortaya çıkarılmıştır (Şekil 4D). Alt tabaka (Şekil 4A; mavi), lifler arasında çok az kesişme noktası olan yatay yönde hizalanmış lifleri gösterir. Orta tabaka (Şekil 4B; yeşil), birincil lif oryantasyonu olmayan hizalanmamış lifleri gösterir. Üst katman (Şekil 4C; kırmızı) dik yönde hizalanmış lifleri gösterir. Üst ve alt katmanların görsel analizi, eğirme işlemi sırasında toplayıcının 90° dönüşüne uygun olarak iki katman arasında ortalama 89°'lik bir açı ortaya koymaktadır (Şekil 4E).

Şekil 4: Çok katmanlı iskelenin floresan mikroskopisi. (A) Sol alttan sağ üste doğru birincil yönelimli ilk katmanın floresan görüntüsü; (B) Hizalanmamış lif yönelimli ikinci katmanın floresan görüntüsü; (C) Üçüncü katmanın sağ alttan sol üste doğru birincil yönelimli floresan görüntüsü; (D) Her üç katmanın da tek bir iskelede birleştirilen floresan görüntüsü; (E) Her üç katman için de lif oryantasyon analizi (Katman 1: mavi; Katman 2: yeşil; Katman 3: kırmızı); büyütme = 400x (A-D); ölçek çubukları = 100 μm (A-D). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kalınlık ölçümü 21 numune üzerinde yapıldı (Şekil 5A) (TEMP F3510-21). Tüm örnekler aynı parametreler uygulanarak oluşturuldu. Sıcaklık ve nem sırasıyla 20.3 °C ile 26.1 °C ve %35 ve %55 nem arasında farklılık gösterebilir. Sonuçlar, kalınlıkta dakikada ~ 2.65 μm kalınlığında nispeten doğrusal bir artış gösterdi.

Başka bir deney, eşleşen parametreler altında 60 dakikalık eğirmeden sonra sonuçların tutarlılığını göstermiştir (Şekil 5B). Nem ve sıcaklık sırasıyla% 35 ve% 50 nem ve 20.3 ° C ila 26.1 ° C arasında değişebilir. Sonuçlar 126 ila 181 μm kalınlığında iskelelerdi. Ortalama kalınlık 151.11 ± 13.17 μm idi. Kalınlıktaki artış ortalama olarak dakikada ~ 2.52 μm idi.

Şekil 5: Kalınlık ölçümü. (A) İskelelerin her zaman döndürülen kalınlık sayısı; n = 21; Korelasyon katsayısı (r) = 0.653; p** = 0,00132; (B) 60 dakika sonra numunelerin kalınlığı; n = 13; kırmızı çizgi: ortalama. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hizalanmış ve hizalanmamış fiber iskeleler için çekme testleri, çevresel yön boyunca ve ona dik olmak üzere iki yönde gerçekleştirilmiştir. Her harç 15 örnekten oluşuyordu. Örnekler DIN 53504:2017-03'e göre uçak iskelelerinden alınmıştır. Kalınlık, her numunede üç farklı noktada ölçüldü ve mm kare başına maksimum kuvvet değerlerini hesaplamak için kullanıldı.

Kalınlık değerleri 0,03 ile 0,2 mm arasında değişmektedir. Nihai çekme dayanımının karşılaştırılması, hizalanmış fiber iskelelerin oryantasyonları arasında anlamlı bir fark (p < 0.001) ortaya koymuştur (Şekil 6A). İskeleler çevresel yönelim boyunca maksimum 12.26 ± 2.59 N/^mm2 mukavemete ulaştı. Çekme dayanımı dik yönde 3.86 ± 1.08 N/^mm2'ye düşürüldü.

Hizalanmamış fiber iskeleler, farklı yönler için nihai çekme mukavemetinde hiçbir fark göstermez (F1: 7.19 ± 1.75 N/mm 2, F2: 7.54 ± 1.59 N/mm²; p = 0.60). Hizalanmış fiber iskeleler için kopma anındaki uzamanın karşılaştırmalı analizi, yönler arasındaki distensibilitede anlamlı farklılıklar (p < 0.001) ortaya koymuştur (Şekil 6B). Genişletilebilirlik çevresel yönde %187,01 ± %39,37'ye ulaşırken, dikey yönde %107,16 ± %30,04'e ulaşmıştır.

Buna karşılık, hizalanmamış fiber paspaslar için kopma sırasındaki uzama, her iki yönde de eşit genişletilebilirlik ortaya koymuştur (F1: 269.74 ± % 24.78; F2: 285,01 ± %25,58; p = 0,69). Temsili gerilme-gerinim eğrileri, çekme kuvvetinin uygulandığı yöne bağlı olarak malzemenin davranışında büyük farklılıklar gösterir. Hizalanmamış fiber paspaslar doğrusal elastik davranış gösterirken, hizalanmış fiber paspaslar eksenel yönde doğrusal olmayan bir davranış gösterdi.

Şekil 6: Hizalanmış ve hizalanmamış liflerin çekme testleri. (A) Çevresel ve eksenel yönlerde hizalanmış ve hizalanmamış elyaf paspaslar için nihai çekme mukavemeti; n = 15; (B) Hizalanmış ve hizalanmamış fiber paspaslar için çevresel ve eksenel yönlerde kopmada uzama; n = 15; (C) Sırasıyla eksenel ve çevresel yönlerde çekilen, hizalanmış ve hizalanmamış iskelelerin temsili gerilme gerilim eğrileri. (***p < 0,001). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

					Üretim Metrikleri
	Ad		Malzeme		Miktar	Toplam Süre	Toplam Ağırlık [g]	Maliyet [kg başına €]	Toplam Maliyet
1	Specimen_Mount_A		Düzenli PLA		2	18:19	159	51.33 €	8.16 €
2	Specimen_Mount_B		Düzenli PLA		2	19:42	161	51.33 €	8.26 €
3	Kollektör Flanşı		İletken PLA		2	10:40	95	99,98 €	9.50 €
4	Leaflet_Inlet		İletken PLA		9	05:32	31	99,98 €	3.10 €
	Toplam								29.02 €

Tablo 1: Üretim metrikleri. 3B yazdırılmış parçalar için miktarı, üretim süresini, gereken malzeme miktarını ve maliyetleri belirten tablo. Kısaltma: PLA = polilaktik asit.

Ek Dosya 1: Uyarlanabilir toplayıcı flanşı. Toplayıcı flanşını uyarlamak ve yazdırmak için adım dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2: Broşür şablonu. Broşür şablonunu yazdırmak için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 3: Örnek montaj A. Örnek montaj A. Baskı için STL dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4: Örnek montaj B. Numune montajı B. Baskı için STL dosyası Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5: Toplayıcı flanşı. Toplayıcı flanşını yazdırmak için STL dosyası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 6: Metal çubuğun bağlanması. Bağlantı metal çubukları inşa etmek için teknik çizim. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Açıklanan protokol, (kardiyovasküler) doku mühendisliği alanında iki yenilik sunmaktadır: elektrospinning için tamamen 3D baskılı hayaletlerin düşük maliyetli üretimi ve uyarlanabilir, çok katmanlı kalp kapağı broşürleri üretmek için çok yönlü bir toplayıcının kullanılması.

Son zamanlarda, 3D baskı, biyoreaktörler veya üretim ve test kurulumları gibi laboratuvar ekipmanlarının üretimi için değerli bir araç haline gelmiştir^11,12. Bu nedenle, bu çalışmada sunulan elektrospinning kurulumunun kısa sürede ve uygun bir bütçeyle üretilmesi mümkün olmuştur (Tablo 1). Bu, 3D baskı¹³ kullanarak elektrospinning kurulumlarının düşük maliyetli üretimi için önceki bulgularla aynı doğrultuda kalmaktadır.

Dahası, yazarların bilgisinin en iyisine göre, kalp kapağı broşürleri için bir elektrospinning toplayıcı oluşturmak için iletken bir 3D baskı malzemesi ilk kez kullanıldı. Şimdiye kadar, 3D baskılı kolektörler ya metal lazer sinterleme¹⁴ ile üretildi ya da iletken olmayan polimer baskı ve ardından iletken kaplama¹⁵ ile son işlem kullanıldı. Bu yeni yaklaşımın aksine, bu prosedürler daha pahalı oldukları, çok daha uzun sürdükleri veya daha fazla el emeği gerektirdikleri için önemli bir dezavantaja sahiptir.

Elektrospinning, oluşturulan liflerin morfolojisini etkileyen çok sayıda değişkene bağlıdır. Piyasada farklı ticari elektrospinning kurulumları mevcut olmasına rağmen, birçok araştırma grubu kendi özel ihtiyaçlarını karşılamak için son derece kişiselleştirilmiş kurulumlar kullanmaktadır¹⁶. Bunu dikkate alarak, bu protokolde açıklanan değerlerin (voltaj, mesafe ve dönme hızı) bireysel kurulumlar için uyarlanması gerekebilir ve sabit değerler yerine bir başlangıç noktası olarak görülmelidir. Ayrıca, çevresel parametrelerin elektrospinning sonuçları üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceği bilinmektedir^17,18. Bu nedenle, elektrospinning makinesinde en azından sıcaklık ve nemin kontrol edilmesi şiddetle tavsiye edilir. 21-24 °C arasındaki bir sıcaklıkta %15-20 bağıl nem arasında optimum elektrospinning sonuçları elde edildi. Bu protokolü takip etmek için aşağıdaki ekipman gereklidir: yaklaşık 300 g ağırlığındaki bir kolektörü 2.000 rpm'lik bir devir hızına hızlandırabilen bir motor, 1-3 mL/s'lik küçük hacimli akış hızlarına uygun bir şırınga pompası ve ±20 kV doğru akım (DC) yeteneğine sahip çift kutuplu bir güç kaynağı ünitesi.

Önceki çalışmalara paralel olarak, elektrospun iskelelerinin fibröz yapısını floresan mikroskopi¹⁹ ile görselleştirmek mümkün olmuştur. İskelenin çok katmanlı yapısını, değişen lif yönelimleri de dahil olmak üzere başarılı bir şekilde göstermek mümkündü. Özellikle çok katmanlı veya çok sayıda malzeme ile çalışırken, floresan boyaların tanıtılması, sıkı kalite kontrolü için standart bir prosedür olarak düşünülmelidir. Parametrelerdeki veya iş akışı protokolündeki değişikliklerden sonra sonuçların görsel değerlendirmesini geliştirebilir. İn vivo veya in vitro değerlendirmede kullanılacak iskelelerde boya uygulaması önerilemez. Bu, yerleşik analitik yöntemlerle etkileşimi önlemek için önemlidir.

Doğal kalp kapağı morfolojisini taklit etmek, kalp kapağı protezi olarak kullanılmak üzere doku mühendisliği yapılmış bir replikanın üretilmesi açısından büyük önem taşımaktadır (Şekil 4B). Spesifik valf geometrisinin in vivo tadilat²⁰ üzerinde yüksek bir etkiye sahip olduğu gösterilmiştir. Bu bağlamda, elektrospinning için broşür geometrisinin 3D baskısı, yinelemelerin uygulanması kolay ve hızlı olduğu için avantajlıdır. Kişiselleştirilmiş kapak geometrilerinin üretimi bile düşünülebilir ve daha sonra, örneğin öğretim amacıyla, kalp kapağı anormalliklerinin bireysel ve kişiselleştirilmiş 3D modellerinin geliştirilmesi mümkündür.

Doku mühendisliği kalp kapağı özelliklerinin daha da iyileştirilmesi, mevcut araştırma çabalarının merkezinde yer almaktadır, çünkü birkaç araştırma grubu, tanımlanmış lif yönelimlerine sahip çok katmanlı iskeleler geliştirmek için çalışmıştır. Masoumi ve ark. kalıplanmış bir poligliserol sebatat tabakasından ve elektrospun polikaprolakton (PCL) fiber paspaslardan imal edilmiş kompozit iskeleler²¹. Böylece, bir mikrofabrikasyon poligliserol sebatat tabakası ile ayrılmış iki yönelimli elektrospun katmanından üçlü bir tabaka oluşturulabilir. Bununla birlikte, eldeki iskelelerin aksine, ne 3D şeklindeydiler ne de orta katmanı (spongiosa) yeterince taklit ediyorlardı. Biyoesinlenmiş doku mühendisliği kalp kapağı üretmeye yönelik başka bir yaklaşım Jana ve ^ark.22,23 tarafından takip edilmiştir. PCL bazlı elektrospinning için alüminyum toplayıcılar kullanarak yönlendirilmiş elyaflara sahip üç katmanlı iskeleleri başarıyla ürettiler. Yine, bu iskeleler de morfolojik kusurlar sundu, çünkü sadece 2D bir görünüme sahiplerdi ve son iskele sözcüler tarafından istila edildi.

Protokol, 3D, üç katmanlı kalp kapağı broşürlerinin nasıl üretildiği hakkında ayrıntılı bilgi verse de, gerçek bir kalp kapağı protezi oluşturmak için gereken birkaç adım daha vardır. Burada anlatılan broşürler için 24 mm çapında stent önerilir. Kullanılan stentin tamamlayıcısı olan broşürler, dikiş için ek destek yapıları ile sağlanabilir. Maksimum esneklik sağlamak için, burada gösterilen broşürler belirli bir stent tasarımına göre kişiselleştirilmemiştir. Bu, CAD yazılımını kullanarak şablonu değiştirerek yapılabilir.

Kalp kapağı doku mühendisliği için kullanılmasına rağmen, sunulan yöntem ortopedi²⁴, üroloji²⁵, kulak burun boğaz²⁶ ve diğerlerinde elektrospinning kurulumları için kolayca uygulanabilir olacaktır. Sofistike ve / veya kişiselleştirilmiş 3D yapıların üretimi, diğer 3D baskılı koleksiyoncuların uygulanmasıyla mümkündür. Kollektörün malzemesi değişmiş olmasına rağmen, elektrospinning prensibi bozulmadan kalır²⁷. Bu nedenle, farklı polimerlerin kullanımı teorik olarak mümkündür, ancak elektrospinning parametrelerinin ayarlanması gerekli olabilir.

Genel olarak, sunulan protokol, çok katmanlı kalp kapağı broşürleri üretmenin kolay ve uygun maliyetli bir yolunu açıklamaktadır. 3D baskı uygulaması, toplayıcının ve kesici uçların hızlı adaptasyonuna ve modifikasyonuna izin verir. Bu, örneğin metal toplayıcıların karmaşık bir üretim süreci olmadan hastaya özgü protezlerin üretilmesini sağlar. Aynı koşullar altında tek bir çalıştırmada birden fazla örnek oluşturulabilir. Bu nedenle, numuneler üzerinde, gerçek vanayı inşa etmek için (neredeyse) aynı olanlara sahip olma avantajıyla malzeme tahribatlı testler yapılabilir. Bu çalışmada baskı dosyalarının Ek Dosyalar olarak yer alması, çok katmanlı kalp kapağı iskelelerinin ilerlemesini desteklemeyi amaçlamaktadır. Bu yeni elektrospinning tekniği, rejeneratif tıbbın diğer alanları için de yüksek bir potansiyele sahiptir, çünkü modifiye edilmiş koleksiyoncular ve diğer 3D baskılı, eğirme şablonlarının uygulanması kolaydır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BTC-FR2.5TN.D09	ZwickRoell GmbH & Co. KG		Traction engine (Tensile tests)
C5-E Motor Controller	Nanotec Electronic GmbH & Co. KG		Motor controll unit
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA	iseg Spezialelectronik GmbH		Power Supply Unit Anode
CH1: CPN 30 kV | 0.3 mA	iseg Spezialelektronik GmbH		Power Supply Unit Kathode
Conductive Composite PLA	ProtoPasta		Conductive PLA
Cura 4.7.1	Ultimaker BV		Slicing Software Ultimaker, step 1.1.2
DAPI Stock Solution c = 0.1 mg/mL	Sigma-Aldrich Chemie GmbH		DAPI
Disposable Scalpel No. 23	FEATHER		Scalpel
Fluorescein (C.I. 45350) M 376.28 g/mol	Carl Roth GmbH + Co. KG		Fluorescein
Fume Hood as per DIN 12924 Class 2	Köttermann GmbH		Fume Hood
Leica Applicatin Suite X 3.5.5.19976	Leica Microsystems GmbH		Software for Confocal Laser Scanning Microscope
Luerlock Syringe 20 mL	BD Plastipak		Luerlock Syringe
Metal needle plane 2.50/2.00 x 20 mm	Unimed S.A.		Needle with plane tip
Montage-complet-tubes; inner diameter x outer diameter: 1/16" x 1/8", length 1.000 mm	Bohlender GmbH	F740-28	Solvent resistant tubes
N,N-Dimethylformamide ≥99.8%	Sigma-Aldrich Chemie GmbH		Dimethylformamide
Pellethane 2363 80AE	Velox GmbH Hamburg		Polyurethane
PLA	Ultimaker BV		PLA
Plug&Drive Studio (1.0.4)	Nanotec Electronic GmbH & Co. KG		Motor operation software
SEM Evo LS 10	Zeiss MicroImaging GmbH		Scanning Electron Microscope
SHT 31-D	Adafruit Industries		Temperature and Humidity Sensor
SolidWorks 2020 CAD Software	Dassault Systèmes		Commercial CAD Software
Sulforhodamine 101 50 mg	Sigma - Aldrich	S 7635	Texas Red
Syringe Pump Model: Fusion 100	Chemyx Inc.		Syringe Pump
TCS SP8 inverted CEL BMi8	Leica Microsystems GmbH		Confocal Laser Scanning Microscope
testXpert V11.02	ZwickRoell GmbH & Co. KG		Software Tensile Test
Tetrahydrofuran ≥99.9%	Sigma-Aldrich Chemie GmbH		Tetrahydrofuran
Type 1511530000202 #980361	Binder Labortechnik GmbH		Heating Cabinet
Ultimaker 3 Extended	Ultimaker BV		3D Printer