İnsan Dişinden Organoidlerin Mekanik Araştırma ve Rejeneratif Terapiye Doğru Güçlü Bir Araç Olarak Kurulması

Özet

İnsan dişinden başlayarak epitelyal organoid kültürlerin geliştirilmesi için bir protokol sunuyoruz. Organoidler sağlam bir şekilde genişletilebilir ve ameloblast farklılaşma kapasiteleri de dahil olmak üzere dişin epitel kök hücrelerini özetler. Eşsiz organoid model, insan diş (kök hücre) biyolojisini diş rejeneratif yaklaşımlar için perspektiflerle incelemek için umut verici bir araç sağlar.

Özet

Dişler hayatta sadece gıda çiğnemesi ve konuşma için değil, aynı zamanda psikolojik iyi oluş için de kilit öneme sahiptir. İnsan diş gelişimi ve biyolojisi hakkında bilgi azdır. Özellikle, dişin epitel kök hücreleri ve işlevleri hakkında fazla bir şey bilinmemektedir. İnsan diş dokusundan (yani, çıkarılan bilgelik dişlerinden izole edilmiş diş folikülü) başlayan yeni bir organoid model geliştirmeyi başardık. Organoidler sağlam ve uzun süreli genişletilebilir olup, önerilen insan dişi epitel kök hücre bölmesini belirteç ekspresyonu ve fonksiyonel aktivite açısından özetler. Özellikle, organoidler, amelogenez sırasında in vivo olarak meydana gelen bir ameloblast farklılaşma sürecini ortaya çıkarabilir. Bu eşsiz organoid model, sadece insan diş gelişimini değil, aynı zamanda diş patolojisini de incelemek için güçlü bir araç sağlayacak ve diş rejeneratif tedavisine giden yolu açabilir. Kayıp dişlerin bu yeni organoid modele dayanan biyolojik bir dişle değiştirilmesi, sentetik malzemelerin mevcut standart implantasyonuna çekici bir alternatif olabilir.

Giriş

Dişlerin gıda çiğneme, konuşma ve psikolojik iyi oluşta (benlik imajı) önemli rolleri vardır. İnsan dişi, değişen yoğunluk ve sertlikte yüksek mineralize dokulardan oluşur¹. Diş kronunun ana bileşeni olan diş minesi, insan vücudundaki en yüksek mineralize dokudur. Emaye oluşumu sırasında (amelogenez), dişler geliştiğinde, diş epitel kök hücreleri (DESC'ler) emaye oluşturan hücrelere (ameloblastlar) farklılaşır. Bir kez oluştuktan sonra, diş erüpsiyonunun başlangıcında ameloblastların apoptotik kaybı nedeniyle emaye nadiren onarılır veya yenilenir¹. Travma veya bakteriyel hastalığın neden olduğu hasarlı emaye dokusunun re....

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler Etik Kurul Araştırma UZ/KU Leuven (13/0104U) tarafından onaylanmıştır. Çekilen üçüncü azı dişleri (yirmilik dişler) hastaların bilgilendirilmiş onamından sonra elde edildi.

1. Hazırlıklar

1. 48 delikli bir kültür plakasını, 37 ° C'de% 1.9'luk bir CO₂ inkübatöründe 15-20 saat boyunca önceden ısıtın.
2. Bir Matrigel aliquot'u sıvılaştırın (büyüme faktörü azaltılmış; fenol kırmızısız; ayrıca bazal membran matrisi olarak adlandırılır; BMM) adım 2.1'den önce en az 2 saat boyunca buz üzerinde (4 ° C).
   NOT: BMM'nin donma/çözülme döngülerinden kaçının. BMM'yi buz üzerinde 1....

Sonuçlar

Diş organoid gelişimi
Bilgelik diş çekimini takiben edinilen insan DF dokusundan organoid kültürler oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz (Şekil 1A). İzole DF enzimatik ve mekanik olarak ayrışır. Elde edilen hücreler, optimal organoid gelişim ve büyüme için ampirik olarak tanımlanmış ortamlarda BMM içinde kültürlenir (diş organoid ortamı; TOM)¹⁹.

Organoidler tipik olarak DF hücre .......

Tartışmalar

Bu protokol, insan dişinden başlayarak organoidlerin verimli ve tekrarlanabilir oluşumunu tanımlar. Bildiğimiz kadarıyla bu, insan diş dokusundan başlayarak akım kavramı (epitelyal) organoidlerin kurulması için ilk metodolojidir. Organoidler uzun süreli genişletilebilir ve daha önce DF^7'nin ERM bölmesinde bildirilen DESC'leri çoğaltan bir diş epitelyal sap fenotipi gösterir. Ayrıca, organoidler, bir ameloblast farklılaşma sürecinin ortaya çıkması da dahil olmak üzere fo.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120.086
15 mL Centrifuge tube	Corning	430052
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M-6250
48-well flat bottom plates	Corning	3548
50 mL Centrifuge tube	Corning	430290
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Agarose	Lonza	50004
Albumin Bovine (cell culture grade)	Serva	47330.03
AMELX antibody	Santa Cruz	sc-365284
Amphotericin B	Gibco	15200018
B27 (without vitamin A)	Gibco	12587-010
Cassette	VWR	7202191
Catalase from bovine liver	Sigma-Aldrich	C100
CD44 antibody	Abcam	ab34485
Cell strainer, 40 µm	Falcon	352340
Cholera Toxin	Sigma-Aldrich	C8052
Citric acid	Sigma-Aldrich	C0759
CK14 antibody	Thermo Fisher Scientific	MA5-11599
Collagenase IV	Gibco	17104-019
Cover glass	VWR	6310146
Cryobox	Thermo Scientific	5100-0001
Cryovial	Thermo Fisher Scientific	375353
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMEM 1:1 F12 without Fe	Invitrogen	074-90715A
DMEM powder high glucose	Gibco	52100039
Dnase	Sigma-Aldrich	D5025-15KU
Donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663 - 10ML
Embedding workstation, 220 to 240 Vac	Thermo Fisher Scientific	12587976
Ethanol absolute, ≥99.8% (EtOH)	Fisher Chemical	E/0650DF/15
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F7524
FGF10	Peprotech	100-26
FGF2 (= basic FGF)	R&D Systems	234-FSE-025
FGF8	Peprotech	AF-100-25
GenElute Mammaliam Total RNA Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	RTN350-1KT	Includes 1% β-mercaptoethanol dissolved in lysis buffer
Glass Pasteur pipette	Niko Mechanisms	170-40050
Glycine	VWR	101194M
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
IGF-1	PeproTech	100-11
InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)	Sigma-Aldrich	688001
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I6634
ITGA6 antibody	Sigma-Aldrich	HPA012696
L-Glutamine	Gibco	25030024
Matrigel (growth factor-reduced; phenol red-free)	Corning	15505739
Microscope slide	Thermo Fisher Scientific	J1800AMNZ
Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 μm	Millipore	SLGV033R
Minimum essential medium eagle (αMEM)	Sigma-Aldrich	M4526
mouse IgG (Alexa 555) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A-31570
N2	Gibco	17502-048
N-acetyl L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	120-10C
P63 antibody	Abcam	ab124762
Pap Pen	Sigma-Aldrich	Z377821-1EA	Marking pen
Paraformaldehyde (PFA), 16%	Merck	8.18715
Penicillin G sodium salt	Sigma-Aldrich	P3032
Penicillin-streptomycin (Pen/Strep)	Gibco	15140-122
Petri dish	Corning	353002
Phosphate buffered saline (PBS)	Gibco	10010-015
Pipette (P20, P200, P1000)	Eppendorf or others	2231300006
Plastic transfer pipette (3.5 mL)	Sarstedt	86.1171.001
Rabbit IgG (Alexa 488) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific	A21206
RSPO1	PeproTech	120-38
SB202190 (p38i)	Biotechne (Tocris)	1264
Scalpel (surgical blade)	Swann-Morton	207
SHH	R&D Systems	464-SH-200
Silicone molds (Heating block)	VWR	720-1918
Sodium Chloride (NaCl)	BDH	102415K
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)	Merck	106329
Sodium-pyruvate (C3H3NaO3)	Sigma-Aldrich	P-5280
SOX2 antibody	Abcam	ab92494
StepOnePlus	Thermo Fisher Scientific		Real-Time PCR System
Stericup-GP, 0.22 µm	Millipore	SCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm	Millipore	SCGP00525
Sterile 1000 μL pipette tips with filter	Greiner	740288
Sterile 20 μL pipette tips with filter	Greiner	774288
Sterile 200 μL pipette tips with and without filter	Greiner	739288
Sterile H2O	Fresenius	B230531
Streptomycin sulfate salt	Sigma-Aldrich	S6501
Superscript III first-strand synthesis supermix	Invitrogen	11752-050	Reverse transcription kit
Tissue processor	Thermo Scientific	12505356
Transferrin	Serva	36760.01
Triton X-100	Sigma	T8787-50ML
TrypLE express	Gibco	12605-010
Vectashield mounting medium+DAPI	Labconsult NV	H-1200	Antifade mounting medium with DAPI
WNT3a	Biotechne (Tocris)	5036-WN-500
Xylenes, 99%, for biochemistry and histology	VWR	2,89,75,325