Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

Özet

Floresan olarak etiketlenmiş glikozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımı ile ilişkilidir ve eksize edilmiş organlarda ve hücre kültürlerinde glikoz alımının yüksek verimli taranması için kullanılabilir.

Özet

Dünya çapında devam eden diyabet salgını, glikoz alımını etkileyen çevresel, beslenme, endokrin, genetik ve epigenetik faktörlerin tanımlanmasına olan talebi artırmaktadır. Hücre içi floresan ölçümü, in vitro hücrelerde floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) alımını test etmek veya glikoz tüketen dokuları in vivo olarak görüntülemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlil, seçilen bir zaman noktasında glikoz alımını değerlendirir. Hücre içi analiz, FD-glikoz metabolizmasının, katabolik ve anabolik reaksiyonlara ve sinyalleşmeye katılan endojen glikozunkinden daha yavaş olduğunu varsayar. Bununla birlikte, dinamik glikoz metabolizması, farklı faktörlere yanıt olarak glikoz alımının kinetik ölçümlerini gerektiren alım mekanizmalarını da değiştirir. Bu makalede, hücre dışı FD-glukoz tükenmesini ölçmek için bir yöntem açıklanmakta ve hücre ve dokularda hücre içi FD-glukoz alımı ile korelasyonunu ex vivo olarak doğrulamaktadır. Hücre dışı glikoz tükenmesi, yüksek verimli kinetik ve doza bağımlı çalışmaların yanı sıra glisemik aktiviteye sahip bileşikleri ve dokuya özgü etkilerini tanımlamak için potansiyel olarak uygulanabilir.

Giriş

Glikoz alımını ölçme talebi, glikoz metabolizmasına bağlı çok sayıda hastalıkta salgın bir artışı ele alma konusundaki kritik ihtiyaçla birlikte artmaktadır. Dejeneratif metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmalar, nörolojik ve bilişsel bozukluklar¹, enflamatuar² ve bulaşıcı hastalıklar³, kanser ^4,5 ve yaşlanma⁶, enerji ve depolanması için glikoz metabolizmasına, anabolik süreçlere, proteine ve gen modifikasyonuna, sinyalleşmeye, genlerin düzenlenmesine ve nükleik asitlerin sentezi ve replikasyonuna bağlıdır

Protokol

Hayvan çalışmaları, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (OSU, protokol 2007A0262-R4).

NOT: Tüm prosedürler, üfleyici açık ve ışıklar kapalı olarak sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.

1. Malzemelerin hazırlanması

NOT: Tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Sınıf II biyogüvenlik kabininde Tablo 1'e göre Ortam 1, santrifüjleme Ortamı 2 ve floresan 2-deoksi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-il) amino]-D-glikoz (2-NBDG veya FD-glikoz) depolama ve çalış....

Sonuçlar

İnsülin stimülasyonu olan ve olmayan farklı FD-glukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak 3T3-L1 preadipositlerde hücre içi alım ve hücre dışı glukoz tükenmesi ölçüldü (Şekil 2). Şekil 2A , insülin varlığında önemli ölçüde artmış olan FD-glukozun hücre içi alımında doza bağlı bir artış göstermektedir. Aynı hücrelerde hücre dışı FD-glukozdaki eşzamanlı azalma, insülin stimülasyonunun insülin stimülasyonu olmayan ör.......

Tartışmalar

Hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin hücre kültüründe normalize hücre içi glukoz alımı ile doğrudan karşılaştırılması, hücre dışı glikoz tükenmesinin glikoz alım değerlendirmesi için vekil bir ölçüm olabileceğini düşündüren yüksek bir korelasyon göstermiştir. Hücre dışı FD-glukoz ölçümü çok çeşitli FD glukoz konsantrasyonlarını kullanabilir, ayrıca 0.5-2.5 μg FD-glukoz / mL'nin optimal aralığı sağladığı görülmektedir. Hücre dışı FD-glukoz, hücre içi FD-glu.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture