Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

Özet

Floresan olarak etiketlenmiş glikozun hücre dışı tükenmesi, glikoz alımı ile ilişkilidir ve eksize edilmiş organlarda ve hücre kültürlerinde glikoz alımının yüksek verimli taranması için kullanılabilir.

Özet

Dünya çapında devam eden diyabet salgını, glikoz alımını etkileyen çevresel, beslenme, endokrin, genetik ve epigenetik faktörlerin tanımlanmasına olan talebi artırmaktadır. Hücre içi floresan ölçümü, in vitro hücrelerde floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) alımını test etmek veya glikoz tüketen dokuları in vivo olarak görüntülemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu tahlil, seçilen bir zaman noktasında glikoz alımını değerlendirir. Hücre içi analiz, FD-glikoz metabolizmasının, katabolik ve anabolik reaksiyonlara ve sinyalleşmeye katılan endojen glikozunkinden daha yavaş olduğunu varsayar. Bununla birlikte, dinamik glikoz metabolizması, farklı faktörlere yanıt olarak glikoz alımının kinetik ölçümlerini gerektiren alım mekanizmalarını da değiştirir. Bu makalede, hücre dışı FD-glukoz tükenmesini ölçmek için bir yöntem açıklanmakta ve hücre ve dokularda hücre içi FD-glukoz alımı ile korelasyonunu ex vivo olarak doğrulamaktadır. Hücre dışı glikoz tükenmesi, yüksek verimli kinetik ve doza bağımlı çalışmaların yanı sıra glisemik aktiviteye sahip bileşikleri ve dokuya özgü etkilerini tanımlamak için potansiyel olarak uygulanabilir.

Giriş

Glikoz alımını ölçme talebi, glikoz metabolizmasına bağlı çok sayıda hastalıkta salgın bir artışı ele alma konusundaki kritik ihtiyaçla birlikte artmaktadır. Dejeneratif metabolik hastalıkların altında yatan mekanizmalar, nörolojik ve bilişsel bozukluklar¹, enflamatuar² ve bulaşıcı hastalıklar³, kanser ^4,5 ve yaşlanma⁶, enerji ve depolanması için glikoz metabolizmasına, anabolik süreçlere, proteine ve gen modifikasyonuna, sinyalleşmeye, genlerin düzenlenmesine ve nükleik asitlerin sentezi ve replikasyonuna bağlıdır 7,8,9 . Diabetes mellitus (DM), glukoz alım regülasyonunun arızalanması ile doğrudan ilişkilidir. DM, tip-1, -2 ve -3 diabetes mellitus, gestasyonel diyabet, gençlerin olgunluk başlangıçlı diyabeti ve bu hastalığın çevresel ve / veya genetik faktörlerin neden olduğu diğer türleri gibi kronik hastalıkların bir spektrumudur. 2016 yılında, diyabetle ilgili ilk DSÖ Küresel raporu, en yaygın DM ile yaşayan yetişkinlerin sayısının 1980'den bu yana neredeyse dört katına çıkarak 422 milyon yetişkine¹⁰ ulaştığını ve bu DM hastalarının sayısının son birkaç on yıldır katlanarak arttığını göstermiştir. Sadece 2019 yılında, 1,5 milyon ölüm tahmini doğrudan DM^10'dan kaynaklandı. Bu dramatik yükseliş, tip-2 DM'deki artıştan ve aşırı kilolu ve obezite 10 dahil olmak üzere onu yönlendiren koşullardan^{kaynaklanmaktadır}. COVID-19 pandemisi, DM'li hastalarda mortalitede genel popülasyona kıyasla iki kat artış olduğunu ortaya koymuştur ve bu da glukoz metabolizmasının immün savunmadaki derin ancak tam olarak anlaşılmamış rolünü düşündürmektedir³. DM, obezite ve diğer hastalıkların önlenmesi, erken teşhisi ve tedavisi, farklı dokular tarafından glikoz alımının ölçümlerinin optimizasyonunu ve glukoz alımını etkileyen çevresel 11, beslenme 12, endokrin¹³, genetik¹⁴ ve epigenetik ¹⁵ faktörün tanımlanmasını gerektirir.

Araştırmada, hücre içi ve / veya doku glukoz alımı genellikle floresan olarak etiketlenmiş glikoz (FD-glukoz) in vitro ^16,17,18 ve in vivo¹⁹ ile ölçülür. FD-glukoz, radyoaktif olarak etiketlenmiş glukoz 20, analitik kütle spektroskopisi analizi 21, metabolomik 22, nükleer manyetik rezonans yöntemleri²³ ve pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT)^5,24 kullanılarak daha hassas yöntemlere kıyasla tercih edilen bir yöntem haline gelmiştir. FD-glikoz alımından farklı olarak, daha fazla biyolojik materyal gerektiren analitik yöntemler, çok adımlı bir numune hazırlama, pahalı aletler ve karmaşık veri analizini içerebilir. Hücre kültürlerinde FD-glikoz alımının etkili ve ucuz ölçümleri, kavram kanıtı deneylerinde kullanılmıştır ve diğer yöntemlerle doğrulama gerektirebilir.

Glukoz alım çalışmaları için FD-glukoz uygulamasının temeli, endojen glukoz^25'e kıyasla FD-glukoz metabolizmasının azalmasıdır. Bununla birlikte, hem endojen glikoz hem de FD-glikoz, anabolik, katabolik ve sinyal süreçlerinde kullanılmak üzere tüm hücresel bölmeler arasında dinamik olarak dağıtılır. FD-glikozun bölümlendirilmesi ve zamana bağlı işlenmesi²⁵ , floresan ölçümlerine müdahale eder ve bu tahlilin yüksek verimli tarama deneyleri, kinetik analiz, 3D hücre kültürü, ko-kültürler ve doku eksplant deneylerinde kullanımı için ana sınırlayıcı faktörleri temsil eder. Burada, FD-glukozun hücre dışı tükenmesi ile hücre içi alımı arasında yüksek bir korelasyon olduğunu gösteren veriler sunuyoruz, bu da FD-glukozun hücre içi glikoz alımı için vekil bir ölçüm olarak hücre dışı tükenmesini düşündürmektedir. Glikozun hücre dışı tükenmesinin ölçümü, insülin ile tedavi edilen farelerde glikoz alımındaki dokuya özgü farklılıkları doğrulamak için ve bu yöntemin bir ilke kanıtı sağlamak için deneysel bir ilaç¹⁸ uygulanmıştır.

Mevcut protokol, 3T3-L1 hücrelerinde FD-glukoz alımının hücre içi ve hücre dışı (Şekil 1) ölçümlerini tanımlamaktadır. Protokol bölümleri 1-7, 48 saat boyunca hücrelerin kültürünü ve büyümesini açıklar; hücre açlığı, stimülasyon ve temel hücre dışı ölçümler; ve hücre dışı FD-glukozun stimülasyon sonrası ölçümleri ve FD-glukoz ve proteinin hücre içi ölçümleri. Protokol bölüm 8, başka bir yerde tarif edilen insülin ve amino asit bileşiği 2'nin (AAC2) varlığı ve yokluğunda ob / ob farelerinden diseke edilen dokularda FD-glukozun hücre dışı alımının ex vivo ölçümünü açıklamaktadır¹⁸.

Protokol

Hayvan çalışmaları, Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (OSU, protokol 2007A0262-R4).

NOT: Tüm prosedürler, üfleyici açık ve ışıklar kapalı olarak sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.

1. Malzemelerin hazırlanması

NOT: Tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Sınıf II biyogüvenlik kabininde Tablo 1'e göre Ortam 1, santrifüjleme Ortamı 2 ve floresan 2-deoksi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-il) amino]-D-glikoz (2-NBDG veya FD-glikoz) depolama ve çalışma çözeltileri hazırlayın. Kaputun altındaki tüm ışıkları kapatarak deney boyunca FD-glikozu ışıktan koruyun.
2. Kullanıma hazır hücre kültürü reaktifleri kullanın: Tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve glikozsuz ve fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (bundan böyle glikozsuz DMEM olarak anılacaktır).
3. 20 mL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu kullanın.
   NOT: Aşağıdaki bölümlerde, insülin stimülasyonu olan ve olmayan 3T3-L1 fibroblastlarında farklı FD-glukoz dozlarının hücre dışı tükenmesi ve hücre içi alımı karşılaştırılmıştır (Şekil 2).

2. 3T3-L1 hücre kültürü ve bakımı

1. Kültür 3T3-L1 fare fibroblastları, iki adet⁹⁶ delikli plakada 20 mL Orta 1'de seyreltilmiş 1 x 10 6 hücreyi kaplayarak kaplar. Plaka kuyu başına 100 μL hücre süspansiyonu, bu süspansiyonun homojenliğinin bozulmasını sağlayarak homojenliğin korunmasını sağlar. 37 °C'lik bir inkübatörde (% 5 CO₂ ve% 95 nem) yaklaşık% 70 -% 80 akıcılığa kadar ortam değiştirmeden hücreleri 48 saat büyütün.
2. Hücreleri 48 saat boyunca aynı ortamda kültürleyerek akıcı ve oruç tutun. İstenilen açlık katabolik durumuna bağlı olarak kuluçka süresini 24-72 saat arasında değiştirin.

3. 3T3-L1 hücrelerinin açlığı

1. 96 delikli plakalardaki hücrelerden gelen dekant ortam. Steril kağıt havlular kullanarak kalan sıvıyı emer.
2. 96 delikli plakayı kuyucuk başına 100 μL PBS ile durulayın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer.
3. Kuyu başına 100 μL glikozsuz DMEM ekleyin ve 40 dakika kuluçkaya yatırın. Hücre tipine, uyaranlara ve istenen açlık seviyesine bağlı olarak kuluçka süresini ayarlayın.
   NOT: Kuluçka zamanı, mevsime bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir.

4. Farklı konsantrasyonlarda FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması

NOT: Şekil 2'deki deney, insülin ile stimülasyonu olan ve olmayan hücre dışı ve hücreler arası ortamları incelemektedir.

1. Her stimülasyon koşulu için sekiz replikasyon (96 delikli bir plakada bir sıra) kullanın. Bu nedenle, her stimülasyon koşulu için 1 mL hazırlayın ( Tablo 2 ve aşağıda belirtilmiştir).
2. İnsülin olmadan sekiz stimülasyon koşulu kullanın: 96 delikli bir plakada 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikozsuz kontrol) FD-glukoz.
3. İnsülin ile sekiz stimülasyon koşulu kullanın (10 μg / mL, son konsantrasyon): Başka bir 96 delikli plakada 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikozsuz kontrol) FD-glukoz.
4. Stimülasyon koşullarını hazırlamak için, 1 mL çalışma stoğu çözeltisi (1:1000 seyreltme veya 5 μg / mL) elde etmek için 999 μL glikozsuz DMEM'de 1 μL 5 mg / mL FD-glikoz çalışma çözeltisini (Tablo 1) seyreltin.
   1. Bu çalışan stok çözeltisini kullanarak, ışıksız bir biyogüvenlik kabinindeki deneylerden hemen önce 2 mL tüplerde 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5g / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.1 μg / mL ve 0.05 μg / mL (Tablo 2) elde etmek için 1:2000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000, 1:50.000 ve 1:100.000 seyreltme FD-glikoz hazırlayın.
5. Adım 4.4'ü tekrarlayın ve yukarıda belirtilen koşulların her birine 1 μL insülin (10 mg / mL, son konsantrasyon) ekleyin.
   NOT: Bu numunelerdeki nihai insülin konsantrasyonu 10 μg / mL = 1.7 nmol / mL'dir. Homojenizasyonu sağlamak için, başka çözeltiler eklemeden önce tüplere insülin ekleyin.

5. Aç kalan 3T3-L1 hücrelerinin tedavisi

1. 40 dakikalık inkübasyondan sonra, glikozsuz DMEM'yi 96 delikli plakalar halinde her bir kuyucuktan boşaltın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emer.
2. Yukarıda açıklanan çeşitli arıtma koşullarından her biri bir sütun boyunca kuyucuklara 100 μL (kuyu başına) ve aynı arıtma koşulundan her iki 96 kuyucuklu plakadaki sıra boyunca kuyucuklara (sekiz kopya) 100 μL (kuyu başına) ekleyin. İnsülinli ve insülinsiz koşulları kullanan plakaları etiketleyin. Kontrol kuyularına tek başına glikozsuz DMEM ekleyin (n = 8).
3. Plakayı karanlıkta bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO₂ ve% 95 nem) 40 dakika boyunca inkübe edin.

6. Uyarılmış 3T3-L1 hücreleri için hücre dışı ve hücreler arası ölçümler

1. Hücreler 40 dakika boyunca uyarıldıktan sonra, stimülasyon ortamını her iki plakadan aynı deney düzenini koruyan yeni 96 delikli plakalara aktarın.
2. Orijinal uyarılmış 96 delikli plakalardan kalan herhangi bir çözeltiyi, steril kağıt havlular üzerindeki hücrelerle boşaltın.
3. İsteğe bağlı olarak, hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve steril kağıt havluların üzerinde kalan solüsyonu boşaltın.
4. Her bir kuyucuğa 100 μL RIPA lizis tamponu ekleyin. İsteğe bağlı olarak, proteinleri korumak için RIPA tamponuna proteaz inhibitörü ekleyin. RIPA içeren plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
5. Bir mikroplaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nm uyarma (Ex) ve emisyon (Em) dalga boylarında floresansı, önce hücre dışı FD-glikoz içeren ortamda, daha sonra 30 dakikalık inkübasyonun sonunda RIPA-lize hücrelere sahip plakayı ölçün (bkz. adım 6.4).

7. Hücre içi glikoz alımının protein bazlı normalizasyonu

NOT: Hücre içi FD-glukoz alımı hücre sayısına bağlıdır. Hücresel lizatlardaki protein seviyeleri, hücre içi FD-glikoz seviyelerinin her bir kuyucuktaki hücre sayısına normalleştirilmesine izin veren hücre sayılarıyla orantılıdır.

1. BCA protein testini üreticinin talimatlarına göre yapın (bkz. RIPA-lize hücreler içeren her kuyucuktaki protein konsantrasyonlarını sayısallaştırın.
2. 10 μL RIPA homojenatı kullanın ve 96 delikli plakalardaki ölçümlerin doğruluğunu artırmak için protein konsantrasyonlarını üçlü olarak ölçün.
3. Her 96 delikli plakadaki örneklerle birlikte analiz edilen protein standartlarına (0, 10, 20, 30, 40, 50 ve 60 μg / mL protein) dayanarak proteini sayısallaştırın.
4. 562 nm'deki absorbansı ölçün ve protein standardı için elde edilen doğrusal regresyon formülüne dayanarak her numunedeki protein konsantrasyonlarını ölçün.
5. Her bir kuyucukta floresan değeri / protein konsantrasyonu kullanarak hücre içi FD-glikoz seviyelerini normalleştirin. Hücre dışı FD-glukoz tükenmesi normalizasyon gerektirmez.
6. İsteğe bağlı olarak, ek normalleştirme (%100) için denetim örneklerinde ortalama taban çizgisi değerlerini kullanın.

8. Organlarda hücre dışı FD glukoz tükenmesinin ex-vivo ölçümü

1. Farelere, organ diseksiyonundan önce glikoz metabolizmasını uyaran bileşiklerle aşağıdaki gibi ön işlemden geçirin.
2. Dokuz haftalık Lep^ob erkek fareleri kullanın (n = 11). Deneyden önce tüm fareleri düzenli bir chow diyetiyle besleyin.
3. İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonlar için fareleri rastgele üç gruba ayırın.
   1. Kontrol Lep^ob grubundan farelere 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n = 4).
   2. İnsülin Lep^ob grubundaki farelere, vücut ağırlığının gramı (BW) başına 12 IU insan insülini içeren 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n = 3).
   3. AAC2 Lep^ob grubundaki farelere, gram vücut ağırlığı (BW) başına 0,1 nmol AAC2 içeren 0,1 mL steril PBS enjekte edin (n = 4).
4. 15 dakika sonra, fareleri% 5 izofluran inhalasyonuna maruz bırakın ve anestezi uygulanan hayvanlardan kardiyak ponksiyon yoluyla kanı ekssanguinat^{edin 26}.
5. Her hayvandan viseral epididim beyaz yağ dokusunu (200 mg), karaciğeri (200 mg) ve tüm beyni disseke edin. Doku taşıma için Sınıf II biyogüvenlik başlığı kullanın.
6. FD-glukoz (0.29 mM) çalışma solüsyonunu glikozsuz DMEM'de ışıksız bir Sınıf II Biyogüvenlik kabininde hazırlayın.
7. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, FD-glikoz çalışma çözeltisinin (0.29 mM) sırasıyla 485 ve 535 nm emisyon dalga boylarında floresansını ölçün.
8. Hasat edilen dokuları/organları PBS içeren 6 delikli bir plakada 1 dakika boyunca inkübe edin. Her doku veya organı ayrı bir kuyuda tutun.
9. 1 dakika sonra, PBS'yi emmek için her bir mendili steril bir kağıt havluya yerleştirin. Dokuları/organları 4.000 μL glikozsuz DMEM içeren ayrı bir 6 delikli plakaya aktarın ve 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
10. 2 dakika sonra, dokuları çıkarın ve 0.29 mM FD-glikoz çalışma çözeltisi (1 mL / kuyu) içeren 6 delikli bir plakanın kuyucuklarına aktarın. FD-glikoz çalışma çözeltisindeki dokuları içeren 6 delikli plakaları 37 ° C'de (% 5 CO₂ ve% 95 nem) inkübe edin.
11. Hücre dışı FD glikoz tükenmesinin kinetiğini analiz etmek için 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakikalık inkübasyondan sonra her bir kuyucuktan 100 μL FD-glikoz çalışma çözeltisi toplayın. Toplamadan önce ve sonra sallayın.
12. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nm uyarma ve emisyon dalga boylarındaki floresanı ölçmek için 100 μL FD-glikoz çalışma çözeltisini 96 delikli plakalara aktarın.
13. Floresansı, her hayvandaki her organ için 0 dakikalık değere (%100) normalleştirin (Şekil 3).

Sonuçlar

İnsülin stimülasyonu olan ve olmayan farklı FD-glukoz konsantrasyonlarına yanıt olarak 3T3-L1 preadipositlerde hücre içi alım ve hücre dışı glukoz tükenmesi ölçüldü (Şekil 2). Şekil 2A , insülin varlığında önemli ölçüde artmış olan FD-glukozun hücre içi alımında doza bağlı bir artış göstermektedir. Aynı hücrelerde hücre dışı FD-glukozdaki eşzamanlı azalma, insülin stimülasyonunun insülin stimülasyonu olmayan ör...

Tartışmalar

Hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin hücre kültüründe normalize hücre içi glukoz alımı ile doğrudan karşılaştırılması, hücre dışı glikoz tükenmesinin glikoz alım değerlendirmesi için vekil bir ölçüm olabileceğini düşündüren yüksek bir korelasyon göstermiştir. Hücre dışı FD-glukoz ölçümü çok çeşitli FD glukoz konsantrasyonlarını kullanabilir, ayrıca 0.5-2.5 μg FD-glukoz / mL'nin optimal aralığı sağladığı görülmektedir. Hücre dışı FD-glukoz, hücre içi FD-glu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture