Tortricidae Zararlı Böceklerinde Kütle Yetiştirme ve Moleküler Çalışmalar

Özet

Mevcut protokol, tortricid haşere böceklerinin laboratuvarlarda yetiştirilme yöntemini açıklamaktadır. Böceklerin cinsiyetini ayırt etme ve yüksek verimli dizileme için nükleik asitleri çıkarma prosedürleri, iki tortricid zararlısı kullanılarak oluşturulmuştur.

Özet

Genellikle tortrix veya yaprak silindiri güveleri olarak bilinen Tortricidae (Lepidoptera), ciddi tarımsal kayıplara neden olan birçok tarım ve ormancılık zararlısını içerir. Bu tür haşere güvelerinin biyolojisini anlamak için, temel teknikler yüksek talep görmüştür. Burada, kütle yetiştirme, gözlemler ve moleküler çalışmalar için yöntemler iki çay tortrix, Homona magnanima ve Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae) kullanılarak geliştirilmiştir. Böcekler dilimlenmiş yapay diyetle kitlesel olarak yetiştirildi ve biyolojik özellikleri göz önünde bulundurularak 100'den fazla kuşak boyunca akrabalık yoluyla sürdürüldü. Böceklerin çeşitli cinsiyet dimorfizmleri vardır; bu nedenle, sonraki tahlilleri önleyen gelişim aşamalarında cinsiyeti ayırt etmek zordur. Bu çalışma, tortrisid larvalarının cinsiyetinin, kadına özgü W kromozomunu görselleştirmek için testislerin veya laktik-asetik orsin boyamasının gözlemlenmesiyle belirlenebileceğini vurgulamıştır. Ayrıca, cinsiyet belirleme yöntemlerini kullanarak, bu çalışma cinsiyet tarafından belirlenen embriyolardan nükleik asit ekstraksiyonlarını ve yüksek verimli dizilemeye doğru uygulamayı mümkün kılmıştır. Bu ipuçları diğer haşere böcekleri için geçerlidir ve daha fazla morfolojik ve genetik çalışmayı kolaylaştıracaktır.

Giriş

Lepidopteran böcekleri, tanımlanan tüm canlı türlerinin %10'undan fazlasını temsil eder¹ ve bazı takson türleri bitkilerde ciddi hasara ve ciddi tarımsal kayıplara neden olur ^2,3. İpekböceği Bombyx mori^4,5 gibi model böcekler kullanılarak moleküler ve genetik çalışmalar geliştirilmiş olmasına rağmen, haşere böcekleri, kısmen ^6,7 yetiştirme ve idare etme zorlukları nedeniyle araştırılmamıştır. Bu nedenle, bu tür model olmayan haşere böceklerinin biyolojisini anlamak için temel çalışmalar ve teknikler gereklidir.

Genellikle tortrix veya yaprak silindiri güveleri olarak bilinen Tortricidae (Lepidoptera), birçok tarım ve ormancılık zararlısını içerir⁸. Böcek taksonlarından, oryantal çay tortrix Homona magnanima Diakonoff ve yaz meyvesi tortrix Adoxophyes honmai Yasuda, Doğu Asya'daki çay ağaçlarına zarar verdiği bilinen ciddi polifagot zararlılardır⁷. İki tür, maternal sekresyonlarla kaplı ince, yumuşak ve kırılgan yumurtalardan oluşan düz ve oval ölçek benzeri yumurta kümeleri (veya yumurta kütleleri) bırakır. Her ne kadar embriyogenez aşamaları böcek gelişimi ve cinsiyet tayini için çok önemli olsa da⁹, yumurtaların yapıları daha fazla analizin böceklerin biyolojisini anlamasını engellemektedir. Bu tür karmaşık yumurta kütlesini ortaya çıkaran zararlılar üzerinde daha fazla çalışma için zorlukların üstesinden gelmek önemlidir.

Burada, tortrisidlerin biyolojisini anlamak için, kitle yetiştirme yöntemleri, gözlemler ve moleküler çalışmalar A. honmai ve H. magnanima kullanılarak geliştirilmiştir. İlk olarak, kütle yetiştirme yöntemleri, her iki tortricidi de 100 nesil boyunca yetiştirilerek korur. Yumurtaların birleştirilmiş ölçek benzeri yumurta kütlesinden ayrılması, daha önce sineklerde kullanılan tekniklerden geliştirilen alkali ve organik çözücüler kullanılarak tortrisidlerin embriyogenez gözlemini kolaylaştırdı¹⁰. Ek olarak, bu çalışma, laktik-asetik orsin 11 kullanılarak lepidopteran dişilerin cinsiyet kromatininin boyama yöntemlerini geliştirerek küçük embriyoların cinsiyet ayrımcılığını ortaya^koymuştur. Bu yöntemler birleştirilerek, cinsiyete göre belirlenmiş embriyolardan yüksek kalitede ve miktarda nükleik asitler çıkarıldı, aksi takdirde kurulması zor olan⁶. Ekstrakte edilen RNA, yeni nesil dizileme için kullanıldı. Toplu olarak, burada sunulan yöntemler diğer lepidopteran böceklerine ve diğer böcek taksonlarına uygulanır.

Protokol

1. Böcek toplama ve kütle yetiştiriciliği

1. Daha önce yayınlanmış Referanslar ^8,12'yi takip eden alanlardan tortrisid böcekleri toplayın.
   NOT: H. magnanima ve A. honmai larvaları hasarlı çay yapraklarından toplanır (Şekil 1A); yetişkinler 4 W taşınabilir UV ışığı kullanılarak çekilir (365 nm dalga boyu, bakınız Malzeme Tablosu, Şekil 1B).
2. Toplanan larvaları (Şekil 1C, D) yetişkin eklozyona kadar 2-3 hafta boyunca 1/2 oz'luk bir bardakta bir yapay diyet parçası üzerinde ayrı ayrı destekleyin (Şekil 1E, F). Pupa ve yetişkinlerin cinsiyetini morfolojik özelliklerle doğrulayın (Şekil 1G, I).
3. Erkekleri ve dişileri plastik bir kutuda (30 cm x 20 cm x 5 cm) bir parafin kağıdı üzerinde yumurta kütlelerini ovipozite etmek için eşleştirin (Şekil 1J-L). Bir dişi ve iki erkeği, bir matrilin oluşturmak için bir parça parafin kağıdı ile 120 mL'lik plastik bir kaba yerleştirin.
   NOT: Parafin kağıdı üzerinde kırışıklıklar yapmak önemlidir. H. magnanima için, parafin kağıdının kasanın altında olması gerekir. Bu arada, A. honmai için, çay yapraklarının üst tarafındaki H. magnanima oviposit yumurta kütlesinden yumurta toplamak için kasa tavanına bir kağıt koyun (Şekil 1L), ancak A. honmai yaprakların alt tarafına yumurta bırakır⁸. Prosedürler diğer tortrisid türlerinde de doğrulanmıştır ve hedef türün ekolojisi ve davranışı açıklığa kavuşturulmuşsa, her iki tarafa da kağıtlar yerleştirmek daha iyidir.
4. Parafin kağıdı üzerindeki yumurta kütlelerini (yumurta kütlesi başına yaklaşık 100-200 yumurta¹², Şekil 1M) makasla kesin. Yumurtaları 5-7 gün boyunca dökülmüş kağıtla 1/2 oz bardağa koyun.
   NOT: Olgunlaşmış embriyo siyah nokta kapsülü sergiler (Şekil 1N). Embriyogenez dönemleri tortrisid türlerine çeşitli şekillerde atfedilir, ancak genellikle H. magnanima için yumurtlamadan 5 gün sonra (dpo) ve A. honmai için 4 dpo 25 ° C'de% 60 bağıl nem, 16 saat ışık / 8 saat karanlık döngüler⁷.
5. Siyah kafa kapsülleri gösteren yumurta kütlelerini 7 gün boyunca 4-8 ° C'de saklayın.
6. Kitle yetiştiriciliği için bir rende kullanarak ~ 60 g yapay diyetleri dilimleyin. Olgunlaşmış embriyolarla doldurulmuş yumurta kütlesini dilimlenmiş yapay diyete plastik bir kaba (23 cm x 16 cm x 8 cm) yerleştirin. Dilimlenmiş diyetlerle yumurta kütlesi üzerine parafin kağıtları yerleştirin (Şekil 10).
   NOT: %30'un altında bağıl nem aşırı kuru kabul edilirken, %70'in üzerinde çok nemli olduğu kabul edilir. Plastik kabın kapağında delikler oluşturmak, daha iyi havalandırma sağlamak için daha iyidir. Küçük larvaların kaçışını önlemek için delikleri pamukla doldurun.
7. Yumurtalardan yüzey kirleticilerini ortadan kaldırmak için, yumurta kütlesini sırasıyla 5 dakika boyunca% 3 formalin ve% 0.2 Benzalkonyum klorür çözeltisine batırın,¹². Bağırsak veya hücre içi bakterileri yok etmek için, normal bir yapay diyet yerine% 0.05 (w / w) Tetrasiklin hidroklorür veya% 0.06 (w / w) rifampisin ile desteklenmiş yapay bir diyet kullanın (bkz.
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır. Tutarlılık için Silk Mate 2S ve% 0.05 (w / w) Tetrasiklin hidroklorür veya% 0.06 (w / w) rifampisin yoğurmak önemlidir.
8. Pupaları plastik kaptan toplayın ve cinsiyeti morfolojik¹² özelliğe göre ayırt edin (Şekil 1G-I).
   NOT: Genel olarak, tortrisidler yavru^12'ye kadar 5-6 instar sunar. H. magnanima ve A. honmai larvaları, yavrulaşmaya kadar yumurtadan çıktıktan sonra sırasıyla 3 hafta ve 2 hafta sürer.
9. 25 °C, 16 L/8 D ile çiftleşmek için 15 erkek ve 10 dişi plastik bir kutuya (30 cm x 20 cm x 5 cm, Şekil 1K) yerleştirin. her nesil için.
   NOT: Daha sonraki analizler için yeni yumurtalanmış yumurta kütlelerinin toplanması gerekiyorsa, karanlık dönemin başlangıcını ve sonunu ayarlayın, örneğin sabah 9'dan akşam 5'e kadar. Bu durumda, H. magnanima ve A. honami genellikle 5 saat (14:00) sonra yumurtaları oviposit eder.

2. Fiksasyon, geçirgenlik ve boyama için yumurta ve fazat larvalarının yumurta kütlelerinden ayrılması

1. Yumurtaları ayırmak için yumurta kütlesini 10 dakika boyunca 1.000 μL% 1.2 sodyum hipoklorit sulu çözeltisine veya 30 dakika boyunca 1.000 μL 5 M potasyum hidroksit sulu çözeltisine batırın.
2. Ayrılmış yumurtaları, daha önce^{yayınlanan rapor} 7'yi takiben, 1.000 μL PBSt (137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4,_2.68mM KCl,_1.47 mM KH₂PO 4,% 0.05 Polioksietilen (20) Sorbitan Monolaurat [Ara-20] pH_7.4, bkz.
3. Yumurtaları 500 μL% 100 heptan ve 500 μL% 4 paraformaldehit-PBSt çözeltisi (w / v) karışımına batırın. Bir vorteks mikseri kullanarak 1.500 rpm'de 10 dakika boyunca karıştırın.
4. Yumurtaları 500 μL% 100 heptan ve 500 μL% 100 metanol karışımına batırın. 1.500 rpm'de 10 dakika boyunca karıştırın.
5. Yumurtaları 1.000 μL% 100 metanol ile iki kez yıkayın ve 4 ° C'de% 100 metanol içinde% 100 metanol içinde saklayın (Şekil 2A).
   NOT: Yumurtalar 4 °C'de en az 1 yıl saklanabilir.
6. Daha önce yayınlanan rapor^7'yi takiben hidrofilizasyon için yumurtaları sırasıyla% 99,% 70,% 50 etanol ve PBSt'ye 5 dakika bekletin.
7. Yumurtaları PBSt ile yıkayın, yumurtaları 5 dakika boyunca 1 μg / mL DAPI çözeltisine batırın ve ardından yumurtaları iki kez 1x PBS ile yıkayın. Çekirdekler parlak kırmızı bir renk sergileyene kadar heterokromatini görselleştirmek için yumurtaları %1,25 (w/w) laktik-asetik orsin çözeltisinin 20 μL'sine batırın (bkz. Malzeme Tablosu)¹¹ (bu 5-60 dakika arasında değişir) (Şekil 2B,C).
   NOT: Laktik-asetik orcein boyama dönemleri sıcaklık ve neme bağlıdır. 4x-10x büyütmeli bir mikroskop kullanarak uygun boyama olup olmadığını kontrol etmek daha iyidir.
8. Vitray yumurtaları pipet kullanarak cam bir slayta aktarın. Lekeli yumurtaları antifade reaktifi (bakınız Malzeme Tablosu) ve bir kapak camı^{7 ile kapatın}.
9. Forseps kullanarak yumurta kütlelerinden H. magnanima ve A. honmai larvalarını (yumurtlamadan 4-5 gün sonra (dpo)) farate çıkarın (Şekil 2D). Cam bir slayt üzerinde bisekt larvaları (Şekil 2E).
10. Herhangi bir dokuyu (örneğin, subözofageal ganglion, torasik gangliyon, malpighian tübül, vb.) 5 dakika boyunca 1:3 (v / v)% 99.7 asetik asit / % 100 metanol karışımı ile sabitleyin. Çekirdekler lekeleninceye kadar% 1.25 (w / w) laktik-asetik orcein çözeltisi¹¹ olanları lekeleyin (bu, sıcaklığa ve neme bağlı olarak 5-60 dakika sürebilir).
11. Mikroskop altında heterokromatinin (W kromozomu, Şekil 2F, G) varlığını (dişi) veya yokluğunu (erkek) gözlemleyerek her bir örneğin cinsiyetini belirleyin.
    NOT: Cinsiyet, cinsiyet kromatini görselleştirerek belirlenir. Her hücre, cinsiyet kromatinini^11,12 dişilerinde bir nokta olarak temsil ederken, fazat larva dokularının kalan kısmı (sabit değil) derhal hücre lizis tamponu ^12'ye (¹⁰ mM Tris-HCl, 100 mM EDTA ve% 1 SDS^, pH 8.0) veya DNA veya RNA ekstraksiyonu için fenol içeren RNA ekstraksiyon reaktiflerine daldırılmalıdır. Diseksiyonlardan önce, reaktiflerin 20 μL'sini önceden 0.2 mL PCR tüplerine dağıtın (Şekil 3A). Daha fazla ekstraksiyona kadar numuneleri -80 ° C'de daldırın ve saklayın. Numuneler en az 3 ay saklanabilir, ancak nükleik asitlerin bozulmasını önlemek için aşağı akış deneylerine devam etmek daha iyidir.

3. Cinsiyetten DNA ve RNA ekstraksiyonları fazat larvalarını belirledi

1. 12 cinsiyet tarafından belirlenen erkek veya dişi fazat larvalarını (5 dpo embriyo) havuzlayın ve 1.5 mL'lik bir tüpe hücre lizis tamponu veya RNA ekstraksiyon reaktifleri (bkz. adım 2.11 ve Malzeme Tablosu) ekleyin.
   NOT: DNA ekstraksiyonu için 3.2-3.7 adımlarını ve RNA ekstraksiyonu için 3.8-3.11 adımlarını izleyin.
2. Hücre lizis tamponunun 600 μL'sinde (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA ve %1 SDS, pH 8.0) dokuları homojenize edin ve numuneleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 10.000 x g'de santrifüj edin.
3. Bir pipet kullanarak süpernatantı (500 μL) toplayın ve 50 ° C'de 1,5 μL Proteinaz K (20 mg / mL, Malzeme Tablosuna bakınız) ile bir ısı bloğu üzerinde 5 saat boyunca inkübe edin.
4. Numuneleri 30 dakika boyunca 37 °C'de 1.0 μL 10 mg/mL RNaz çözeltisi (bkz. Malzeme Tablosu) ile işleyin.
5. ⁷ tüplerine 200 μL protein çökeltme çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, ardından 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17.000 x g'de bir santrifüj ekleyin.
6. Süpernatantı (500 μL) 500 μL% 100 izopropanol ile karıştırın ve ardından 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20.400 x g'de santrifüj yapın.
7. Pelet edilmiş DNA'yı 1.000 μL% 70 etanol ile iki kez yıkayın. Daha sonra, hava ile kurutun (oda sıcaklığında 5-10 dakika), DNA'yı 10 mM Tris-Cl tamponunun 30 μL'sinde (pH 8.5) çözün.
8. Dokuları 600 μL RNA ekstraksiyon reaktiflerinde homojenize edin ve tüpe 240 μL ultra saf damıtılmış su ekleyin. Tüpleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 12.000 x g'de santrifüj yapın.
9. Süpernatantı (600 μL) 600 μL% 100 izopropanol ile karıştırın ve karışımı bir silika spin kolonuna aktarın (bkz. Tüpleri 4 ° C'de 1 dakika boyunca 17.900 x g'de santrifüj yapın.
10. Kolonu 750 μL% 70 etanol ile yıkayın ve sütunu 4 ° C'de her biri 1 dakika boyunca 17.900 x g'de iki kez santrifüj yapın.
11. Kolona 15 μL Ultra saf damıtılmış su yükleyin. RNA'yı süzmek için tüpleri 17.900 x g'de 4 ° C'de 1 dakika boyunca santrifüj yapın.
12. UV tabanlı bir spektrofotometre kullanarak DNA ve RNA'nın kalitesini ve miktarını hesaplayın ve doğrulayın. A260/A280 (Nükleik asitler/protein) ve A260/A230 (Nükleik asitler/tuzlar ve diğer kirleticiler) oranlarını kullanarak nükleik asitlerin saflığını değerlendirin¹³.
    NOT: RNA ekstraksiyonu için, daha önce yayınlanmış prosedür¹² izlendi ve bu da fenol kontaminasyonu ile sonuçlandı (Tablo 1). Tek bir embriyo veya farat larvasından ekstrakte edilen DNA ve RNA, düşük miktarda ve düşük kaliteli örnekler verir. Tipik olarak, 12 fazat larvasından DNA ekstraksiyonu 100-600 ng verirken, mevcut yöntemi kullanan RNA ekstraksiyonu, Tablo 1'de gösterildiği gibi 900-1.500 ng üretir.
    NOT: Adım 3.13-3.15, yüksek verimli dizilemelerin daha fazla tahlili için isteğe bağlıdır.
13. Floresan bazlı spektrofotometre kullanarak DNA ve RNA miktarlarını hesaplayın.
    NOT: RNA miktarlarının oranı (UV bazlı konsantrasyon (ng/μL)/floresan bazlı konsantrasyon (ng/μL)) daha ileri deneysel uygulamaların kalitesini değerlendirmek için hesaplanmıştır. Örneğin, UV ve floresan bazlı konsantrasyonlar sırasıyla 80 ng / uL ve 60 ng / uL olduğunda, oran 1.5 (80/60) olacaktır. Genellikle, 1,5'in altındaki oranlar, yüksek verim sıralaması¹³ kullanan aşağı akış uygulamaları için yeterli saflığı gösterir.
14. Mikroçip elektroforezi kullanarak RNA'nın kalitesini analiz edin¹⁴.
15. Bir RNA kütüphanesi hazırlama kiti kullanarak RNA kütüphanesini hazırlamak için nitelikli RNA'ları kullanın (bakınız Malzeme Tablosu). Hazırlanan kütüphaneler için uygun bir platform kullanarak kütüphaneleri sıralayın.

Sonuçlar

Ana hatların kurulması ve bakımları
Tarlada toplanan larvaların yaşayabilirliği, tarla konumuna, mevsimlere ve yetiştirme koşullarına farklı şekilde atfedilir (örneğin, Arai ve ^ark.12'de gösterildiği gibi, Tayvan, Taoyuan'daki canlılığın% 90'ı). Çiftlerin yaklaşık% 30-50'si her zamanki gibi yeni nesli üretecektir. H. magnanima ve A. honmai için, matrilinler 100'den fazla kuşak boyunca akrabalık yoluyla korunmuştur.

Tartışmalar

Tortricid çeşitli tarım ve ormancılık zararlılarından oluşur; Bu çalışmada tortriksin nesiller boyunca arka plana çıkarılması, böceklerin embriyogenezini ve cinsiyetinin gözlemlenmesi ve olgunlaşmış embriyolar kullanılarak moleküler analiz yapılması için yöntemler sunulmuştur.

Haşere böcek çalışmasının önündeki engellerden biri, yetiştirme yöntemleri oluşturmaktır. Özellikle akrabalık bazen türlerin uygunluğunu olumsuz yönde etkiler. Akrabalık depr...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1/2 ounce cup	FP CHUPA	CP070009	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid	FP CHUPA	CP070011	insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
99.7% acetic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	36289	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument
Agilent RNA6000 nano kit	Agilent Technologies	5067-1511	Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf
benzalkonium chloride solution	Nihon Pharmaceutical Co., Ltd	No.4987123116046	Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html
Cotton	AOUME	8-1611-02	insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1
DAPI solution	Dojindo, Tokyo, Japan	340-07971	stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/
Disodium Hydrogenphosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html
dsDNA HS quantification kit	Invitrogen	Q33231	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
Econospin RNA II column	Epoch Life Science Inc.	EP-11201	RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx
Ethanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA)	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html
Glassine paper	HEIKO	2100010	insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK	ATTO, Tokyo, Japan	4002620	incubation; https://www.attoeng.site/
heptane	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
INSECTA LF	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
ISOGENII	Nippon Gene	311-07361	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html
isopropanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html
Lactic acid	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html
methanol	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html
MSV-3500 vortex	Biosan	BS-010210-TAK	Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/
Nano Photometer NP 80	Implen	not shown	Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
Natural pack wide	Inomata chemical	1859	insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England BioLabs	E7770S	Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039
orcein	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
Paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	160-16061	fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength)	Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan	not shown	Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant	Invitrogen, MA, USA	P36965	antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution	Merck	71049-4CN	DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution	Qiagen	158912	DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4	Invitrogen	Q33238	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit	Invitrogen	Q32855	Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution	Nippon Gene	313-01461	RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S	Nosan Co., Ltd	not shown	Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride	FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan	4.98748E+12	Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl	FUJIFILM Wako Chemicals Co.	4.98748E+12	Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water	Invitrogen	10977023	RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015