Doğal Öldürücü Hücreler ve Nosiseptör Nöronlar Arasındaki Etkileşimi Ortaya Çıkarmak

Özet

Nosiseptör nöronlar ve NK hücreleri aktif olarak enflamatuar bir bağlamda etkileşime girer. Bir ortak kültür yaklaşımı, bu etkileşimi incelemeyi sağlar.

Özet

Somatosensoriyel nöronlar, zararlı uyaranları tespit etmek ve savunma reflekslerini aktive etmek için evrimleşmiştir. İletişim araçlarını paylaşarak, nosiseptör nöronlar ayrıca bağışıklık sisteminin aktivitesini kontrol ederek konakçı savunmasını da ayarlar. Bu sistemler arasındaki iletişim çoğunlukla adaptiftir, homeostazı korumaya yardımcı olur, ayrıca kronik hastalıkların başlangıcına yol açabilir veya teşvik edebilir. Her iki sistem de, birincil ve ikincil lenfoid dokularda ve mukozada bulunan bu tür lokal etkileşime izin vermek için birlikte evrimleşmiştir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, nosiseptörlerin yabancı antijenleri, bağışıklık hücresi kaynaklı sitokinleri ve mikropları doğrudan tespit ettiğini ve bunlara yanıt verdiğini göstermiştir.

Nosiseptör aktivasyonu sadece ağrı aşırı duyarlılığı ve kaşıntı ile sonuçlanmaz, aynı zamanda nosiseptör ateşleme eşiğini düşürür ve nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar. Nosiseptörlerin periferik terminalleri tarafından üretilen ve salınan peptitler, lenfositlerin kemotaksisini ve polarizasyonunu bloke edebilir, inflamasyonun lokalizasyonunu, süresini ve tipini kontrol edebilir. Son kanıtlar, duyusal nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücreleriyle hücre-hücre teması yoluyla etkileşime girdiğini, örneğin doğal öldürücü (NK) hücreler üzerindeki grup 2D (NKG2D) reseptörlerini kullandığını göstermektedir.

NK hücrelerinin çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese ettiği göz önüne alındığında, nosiseptörlerin NK hücrelerinin aktivitesini kontrol etmek için nöropeptitler kullandıkları düşünülebilir. Burada, bir tabaktaki nosiseptör nöron-NK hücre etkileşimlerini incelemek için bir ko-kültür yöntemi geliştirdik. Bu yaklaşımı kullanarak, lomber nosiseptör nöronların NK hücre sitokin ekspresyonunu azalttığını bulduk. Genel olarak, böyle bir indirgemeci yöntem, tümör innerve edici nöronların NK hücrelerinin antikanser fonksiyonunu nasıl kontrol ettiğini ve NK hücrelerinin yaralı nöronların ortadan kaldırılmasını nasıl kontrol ettiğini incelemek için yararlı olabilir.

Giriş

Duyusal nöronların hücre gövdeleri dorsal kök ganglionlarından (DRG) kaynaklanır. DRG, periferik sinir sisteminde (PNS), omuriliğin dorsal boynuzu ile periferik sinir terminalleri arasında bulunur. DRG nöronlarının psödo-unipolar doğası, hedef dokuyu innerve eden periferik daldan, somatosensoriyel bilgiyi omuriliğe taşıyan merkezi dala bilgi aktarımına izin verir¹. Özel iyon kanalı reseptörleri kullanarak, birinci dereceden nöronlar patojenlerin, alerjenlerin ve kirleticilerin^{oluşturduğu} tehditleri algılar 2, bu da katyonların akışına (Na +, Ca^{2 +}) ve bir aksiyon potansiyelinin üretilmesine yol açar 3,4,5.

Bu nöronlar ayrıca, ilk tehlike algılamasının gerçekleştiği çevreye doğru antidromik etki potansiyeli gönderir ve bu da nöropeptitlerin lokal salınımına yol açar ^1,4. Bu nedenle, nosiseptör nöronlar, konağı çevresel tehlikeye karşı uyaran koruyucu bir mekanizma görevi görür 4,5,6,7.

İkinci dereceden nöronlarla iletişim kurmak için, nosiseptörler çeşitli nörotransmiterleri (örneğin, glutamat) ve nöropeptitleri (örneğin, kalsitonin geni ile ilişkili peptid (CGRP), madde P (SP) ve vazoaktif bağırsak peptidi (VIP))^6,7 serbest bırakır. Bu peptitler kılcal damarlara etki eder ve plazma ekstravazasyonunu, ödemi ve bağışıklık hücrelerinin lokal akışını ve modülasyonunu teşvik eder ^2,4,7.

Somatosensoriyel ve bağışıklık sistemleri, sitokinler ve nöropeptitlerden ve bunların ilgili konyak reseptörlerinden oluşan ortak bir iletişim sistemi kullanır⁴. Bu çift yönlü iletişim, tehlikeden korunmaya ve homeostazı korumaya yardımcı olurken, aynı zamanda hastalık patofizyolojisine de katkıda bulunabilir⁴.

NK hücreleri doğuştan gelen lenfoid hücreler olarak sınıflandırılır ve viral olarak enfekte olmuş hücreleri ortadan kaldırmak için uzmanlaşmıştır. NK hücre fonksiyonu, aktive edici reseptör NKG2D⁸ de dahil olmak üzere uyarıcı ve inhibitör reseptörlerin bir dengesi tarafından yönetilir. NKG2D'nin endojen ligandı olan retinoik asit erken indüklenebilir1 (RAE1), tümörigenez ve enfeksiyon ^8,9 gibi stres altındaki hücreler tarafından eksprese edilir.

Son zamanlarda yapılan araştırmalar, periferik sinir hasarının duyusal nöronları stathmin 2 (STMN2) ve RAE1 gibi uyumsuz molekülleri eksprese etmeye yönlendirdiğini göstermiştir. Böylece, hücre-hücre teması yoluyla, NKG2D eksprese eden NK hücreleri, RAE1 eksprese eden nöronlarla etkileşim yoluyla aktive edildi. Buna karşılık, NK hücreleri yaralı nosiseptör nöronları ve normalde sinir hasarı ile ilişkili künt ağrı aşırı duyarlılığını ortadan kaldırabildi¹⁰. NKG2D-RAE1 eksenine ek olarak, NK hücreleri çeşitli nosiseptör tarafından üretilen mediatörler için konyak reseptörlerini eksprese eder. Bu nedenle, bu mediatörlerin NK hücre aktivitesini modüle etmeleri mümkündür. Bu yazıda nosiseptör nöron-NK hücre etkileşiminin biyolojisini araştırmak için bir ko-kültür yöntemi sunulmaktadır. Bu yaklaşım, nosiseptör nöronların doğuştan gelen bağışıklık hücresi yanıtlarını yaralanmaya, enfeksiyona veya maligniteye nasıl modüle ettiğinin anlaşılmasına yardımcı olacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Université de Montréal'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri (#22053, #22054) tüm hayvan prosedürlerini onayladı. Çözümlerin ve bileşimlerinin listesi için Tablo 1'e ve bu protokolde kullanılan malzemelerin, ekipmanların ve reaktiflerin listesi için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. NK hücre izolasyonu, kültürü ve stimülasyonu

1. Nosiseptör nöronu bozulmadan üretin (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1^wt::D TA fl/wt) ve ablatlanmış (TRPV1 cre::D TA fl/wt) fareler, lox-stop-lox-difteri toksin farelerini (DTA fl/^fl) TRPV1^cre/wt fareleri ile geçerek geçer.
2. CO₂ inhalasyonunu kullanarak, naif bir çöp arkadaşı kontrolü (TRPV1 wt::D TA^fl/wt) faresini ötenazileştirin.
3. Dalağı, 500 μL steril fosfat tamponlu salin (PBS) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.
4. Dalağı bir havane kullanarak homojenize edin.
5. Hücreleri 1 mL steril PBS ile seyreltin.
6. Karışımı 50 μm'lik bir hücre süzgecinden 15 mL'lik bir konik tüpe süzün.
7. Steril PBS ile ses seviyesini (10 mL) doldurun.
8. 10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
9. Hücreleri santrifüj edin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.
10. Hücreleri takviyeli RPMI 1640 ortamında 10⁸ hücre / mL konsantrasyonunda yeniden askıya alın.
11. Bir fare NK hücre izolasyon kiti kullanarak dalak NK hücrelerini manyetik olarak arındırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Akış sitometrisi^11'i kullanarak NK hücre saflığını onaylayın.
12. 10 μL toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
13. Hücreleri santrifüj edin (500 × g, 5 dakika) ve süpernatanı çıkarın.
14. NK hücrelerini takviyeli RPMI 1640 kültür ortamında (IL-2 ve IL-15 içeren) yeniden askıya alın.
15. Kültür 2 ×⁹⁶ kuyucuklu bir U-alt plakada 48 saat boyunca 10 6 NK hücresi / mL.

2. DRG nöron izolasyonu ve kültürü

1. NK hücre stimülasyonunun bitiminden 24 saat önce (adım 1.15), 96 delikli bir plakayı 100 μL / laminin (1 ng / mL) ile kaplayın ve 45 dakika (37 ° C) boyunca inkübe edin.
2. Kuluçkadan sonra, çözeltiyi çıkarın ve kuyucukların bir biyogüvenlik kabininde hava ile kurumasına izin verin.
3. CO₂ inhalasyonunu kullanarak, nosiseptör nöronu bozulmadan ötenazi yapın (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1^wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1^cre::D TA^fl/wt) fareler.
   NOT: CO₂ inhalasyonu, DRG'ye bağlı spinal sinirleri bozmaktan kaçındığı için servikal çıkığa tercih edilir.
4. Fareyi tahtaya eğilimli bir pozisyonda sabitleyin, cildi kaldırın ve cildi sırt sütunu boyunca kesin. Ayrıntılı bir video için Perner ve ark.¹².
5. Lumbosakral eklemi kesin ve sakrumu bel omurgasından makasla ayırın.
6. Omurganın tabanına ulaşılana kadar omurganın her iki tarafındaki kasları ve kaburgaları kafatası yönünde keserek omurgayı ayırın.
7. Makas kullanarak, atlanto-oksipital eklemdeki omurgayı kesin.
8. Kas ve yağ dokusunu omurgadan çıkarın.
9. Omuriliği çıkarmak ve DRG'ye erişmek için vertebral kolonu sabitleyin ve açın. DRG'yi, dorsal kök yoluyla omuriliğe bağlı, ancak meninkslerden ayrılmış intervertebral foraminada arayın.
10. DRG'leri, 10 mL buz gibi soğuk takviyeli DMEM ile doldurulmuş 15 mL konik bir tüpe hasat edin.
11. Preparatı santrifüj edin (200 × g, 5 dakika, oda sıcaklığı) ve süpernatanı çıkarın.
12. Kollajenaz IV (1 mg/mL) ve Dispase II (2.4 U/mL) içeren 250 μL PBS ekleyin.
13. DRG'yi Kollajenaz IV/Dispase II (C/D) çözeltisi (80 dk, 37 °C, hafif ajitasyon) ile inkübe edin. Birkaç fareden gangliyonları toplarken, ganglion başına 125 μL C / D çözeltisi oranını koruyun.
14. Enzimleri inaktive etmek için, 5 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin.
15. Çözeltiyi santrifüj edin (200 × g, 5 dakika) ve bir pipet kullanarak süpernatantı yavaşça çıkarın.
16. İstenmeyen hücre kaybını önlemek için, süpernatanın ~ 100 μL'sini bırakın.
17. 1 mL takviyeli DMEM ortamı ekleyin.
18. Bir pipet tabancası ve boyutları azalan üç cam Pasteur pipeti kullanarak, DRG'yi tek hücreli bir preparatta yavaşça tritüre edin (Pasteur pipet boyutu başına ~10 yukarı/aşağı).
19. Bir biyogüvenlik kabininde, sığır serum albüminini (BSA) steril PBS'de% 15'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin. −20 °C'de 1 mL aliquots saklayın.
20. 2 mL steril PBS ekleyerek ve tüpün dibine yavaşça 1 mL% 15 BSA çözeltisi dağıtarak 15 mL'lik bir konik tüpte bir BSA gradyanı oluşturun. Pipetleri nazikçe çıkararak gradyanı bozmaktan kaçının.
21. Bir P200 pipet kullanarak, tritüne gangliyon süspansiyonunu (nöronları içeren) yavaşça tüpün yan tarafına gradyana pipetleyin.
22. Nöron içeren BSA gradyanını santrifüj edin (200 × g, 12 dk, oda sıcaklığı). Santrifüjün hızlanmasını ve yavaşlamasını minimum hıza ayarlayın.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, nöronlar tüpün dibinde olurken, hücre kalıntıları BSA gradyanında sıkışıp kalacaktır.
23. Bir pipet kullanarak tüm süpernatantı nazikçe çıkarın.
24. Hücreleri 500 μL Nörobazal içinde yeniden askıya alın.
25. Laminin kaplı, düz tabanlı 96 kuyucuklu bir plakada kuyu başına^{10 4} nöron (200 μL nörobazal / kuyu) Plaka.
    NOT: Ortalama olarak, bir araştırmacı fare başına ~ 8 kuyu doldurabilecektir.
26. Bağlanmaya izin vermek için nöronları (gece boyunca 37 ° C) kültürleyin.

3. Ko-kültür ve akım sitometrisi

1. Nörobazal'ı nöron kültüründen yavaşça çıkarın.
2. IL-2 ve IL-15 ile 48 saatlik stimülasyondan sonra (bkz. adım 1.14-1.15), NK hücrelerini yeniden askıya alın ve nöron kültürüne 10⁵ NK hücresi / kuyusu ekleyin (96 kuyucuklu düz alt plaka).
   NOT: Ortalama olarak, araştırmacı fare başına ~ 6 kuyu doldurabilecektir.
3. Takviyeli nörobazal MX'teki hücrelerin ortak kültürü (37 ° C, 48 saat).
4. Hücreleri toplayın, PBS (3x) ile yıkayın ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C).
5. Süpernatantı atın ve hücreleri Viability Dpaint eFlour-780 (1:1.000, 15 dk, 4 °C) ile lekeleyin.
6. Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.
7. CD16/32 (1:100, 15 dk, 4 °C) ile hücrelerdeki spesifik olmayan bölgeleri bloke edin.
8. Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.
9. BV421 anti-NK-1.1 (1:100), floresein izotiyosiyanat (FITC) anti-NKp46 (1:100) ve fikoeritrin (PE) anti-GM-CSF (1:100) içeren hücreler leke (15 dk, 4 °C).
10. Hücreleri toplayın, PBS (3x) ve santrifüj (500 × g, 5 dakika, 4 °C) ile yıkayın.
11. Süpernatanı atın, FACS tamponundaki hücreleri (500 μL) yeniden askıya alın ve NK hücrelerini akış sitometrisi¹¹ ile immünofenotipleyin. Geçit stratejisi için Şekil 1A'ya bakın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

NK hücreleri, çöp arkadaşı kontrolünden (TRPV1 wt: :D TA^{fl / wt}) farelerin plenositlerinden manyetik olarak saflaştırıldı ve IL-2 ve IL-15 ile uyarıldı (48 saat). NK hücreleri daha sonra tek başlarına kültürlendi veya nosiseptör nörondan sağlam bir şekilde toplanan DRG nöronları ile birlikte kültürlendi (çöp arkadaşı kontrolü; TRPV1^wt::D TA fl/wt) veya ablatlanmış (TRPV1^cre::D TA^fl/wt) fareler. Hücreler daha sonra TRPV1 ago...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Davies ve ^ark.11 , yaralı nöronların RAE1'i yukarı regüle ettiğini bulmuşlardır. Hücre-hücre teması yoluyla , NKG2D eksprese eden NK hücreleri daha sonra RAE1 ⁺ nöronlarını tanımlayabilir ve ortadan kaldırabilir ve bu da kronik ağrıyı sınırlayabilir¹¹. NK hücrelerinin ayrıca çeşitli nöropeptit reseptörlerini de eksprese ettiği ve bu nöropeptitlerin immünomodülatör yetenekleri ile bilindiği göz önüne alındığında, N...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-mouse CD16/32	Jackson Laboratory	Cat no: 017769
B-27	Jackson Laboratory	Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade	World Precision Instruments	Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1	Fisher Scientific	Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm)	Fisher Scientific	Cat no: A3160702
Collagenase IV	Fisher Scientific	Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl	Fisher Scientific	Cat no: SH3057402
Dispase II	Fisher Scientific	Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Fisher Scientific	Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit	Sigma	Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	Cat no: C0130
FACSAria III	Sigma	Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46	Sigma	Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate	Sigma	Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette	Sigma	Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF)	VWR	Cat no: 02-0131
Laminin	Cedarlane	Cat no: 03-50/31
L-Glutamine	Gibco	Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15	Gibco	Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2	Gibco	Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF)	Life Technologies	Cat no: 13257-019
Neurobasal media	PeproTech	Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF	PeproTech	Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin	PeproTech	Cat no: 210-15
Pestles	Stem Cell Technology	Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biolegend	Cat no: 108732	Clone PK136
RPMI 1640 media	Biolegend	Cat no: 137606	Clone 29A1.4
TRPV1Cre	Biolegend	Cat no: 505406	Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools.	Biolegend	Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate	Biolegend	Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780	Becton Dickinson